Los perros de raza Shar Pei tienen dos características fenotípicas propias de la raza que son las arrugas de la piel (ahora conocido como Hialuronosis Cutánea Hereditaria-HCH) y un desorden genético llamado Fiebre Familiar del Shar Pei (FSF) que se cree que es causada por un exceso de Ácido Hialurónico (HA). El origen genético se describe como una mutación reguladora (Variación Número de Copias- CNV) localizada upstream del gen que sintetiza HA (HAS2) en el cromosoma 13. Se construyó un modelo murino transgénico con mayor número de copias del HAS2 para emular y confirmar el fenotipo descrito en Shar Peis. Obtuvimos de manera exitosa 5 ratones transgénicos fundadores los cuales sirvieron para formar la colonia. Un total de 80 ratones de la F2 fueron incluidos en el estudio; 40 transgénicos (TG) (20 adultos y 20 jóvenes) y 40 tipo salvaje utilizados como control (20 adultos y 20 jóvenes). El análisis del fenotipo in vivo incluyó la inspección visual de posibles alteraciones en la piel (laxitud, pliegues, arrugas) y temperatura corporal (sistema basado implantación de microchip). Se determinó el número de copias (CN) utilizando el método de cuantificación relativa (2-ΔΔCt) con una RT-qPCR. El análisis post mortem incluyó hemograma completo, análisis de expresión de HAS2 en piel [utilizando el HAS2 murino endógeno como referencia y el HAS2constructo (transgen) como diana], histología de órganos parenquimatosos y piel además de la determinación de concentración de HA en suero sanguíneo. Después que se determinó el CN, los ratones TG fueron divididos en tres grupos: i) bajo CN: <20 copias, ii) medio CN: 21-69 copias y iii) alto CN: >70 copias. Aunque de manera exitosa conseguimos crear un ratón transgénico que expresaba HAS2, sobre producía HA y que en algunos aspectos semejaba el fenotipo de los Shar Peis, no pudimos emular la piel arrugada característica del Shar Pei ni tuvimos ratones con episodios febriles. Con todos estos resultados, es difícil sustentar el hecho de que el fenotipo de las arrugas de la piel del Shar Pei y el desorden febril sean consecuencia única de un aumento en la síntesis de HA. Los resultados obtenidos de los ratones transgénicos generados en esta tesis corroboran que quedan muchas preguntas respecto a las bases genéticas de HCH y FSF por contestar y que diferentes enfoques para averiguar el porqué de estas enfermedades son necesarios. Es por esta razón que analizamos otras vías de degradación de HA como la función del HAS2as, un gen que regula la expresión de HAS2, además de los Toll Like Receptors 2 y 4, sin encontrar cambios significativos. También reanalizamos datos de chip de Illumina, CanineSNP20 BeadChip (22.362 SNPs) para buscar regiones de homocigosis involucradas en el fenotipo del Shar Peis. Encontramos dos regiones de homocigosis en los CFA6 6 (40, 691, 228-51, 293, 708 CanFam2.0) y CFA 13 (23, 222, 643-27, 079, 420 CanFam2.0). Nuestros resultados indican un haplotipo específico característico de los Perros Shar Peis en el CFA6 el cual incluye dos genes (TNFR1 y MEFV) relacionados con la Fiebre Familiar Mediterránea en humanos y un CNV. Creemos que es importante considerar otras regiones en el genoma como la región del CFA6, la cual alberga muchos genes candidatos, para continuar indagando sobre las bases genéticas de estas enfermedades además de finalmente intentar confirmar si la HCH y la FSF están relacionados al compartir el mismo fondo genético o si son dos entidades distintas. / Shar Pei dogs have a breed defined wrinkled skin phenotype (now known as Hereditary Cutaneous Hyaluronosis-HCH) and a genetic disorder called Familial Shar Pei fever (FSF) which is thought to be caused by an excess in Hyaluronic Acid (HA). The genetic origin is described as a regulatory mutation (Copy number variation) located upstream of the HA synthesizing gene (HAS2) in chromosome 13. A transgenic mouse model with increased copies of HAS2 was constructed to emulate and confirm the phenotype described in Shar Peis. We successfully obtained 5 transgenic founder mice from which the colony was formed. A total of 80 F2 mice were included in the study: 40 Transgenic (TG) (20 adult and 20 young) and 40 wild type (WT) used as controls (20 adult and 20 young). Phenotype in vivo analysis included visual inspection of possible skin alterations (laxity, folds, wrinkles) and body temperature (microchip implant system). Copy number (CN) determination was performed using the comparative cycle threshold (CT) relative quantification method (2-ΔΔCt) with RT-qPCR. Post mortem analysis included complete blood count, skin HAS2 expression [using the endogenous HAS2 gene as a reference gene and HAS2 construction (transgene) as target], histology of parenchymal organs and skin and the determination of serum HA concentration. After CN determination, TG mice were divided into three groups: i) low CN: <20 copies, ii) medium CN; 21-69 copies and iii) High CN: >70 copies. Even though we successfully created a transgenic mouse which expressed HAS2, over produced HA and that in some aspects resembled the phenotype of Shar Pei dogs, we couldn’t emulate the Shar Peis characteristic wrinkled skin, nor did we have mice with febrile episodes. With all these results, it is difficult to sustain that the wrinkled skin phenotype and febrile disorder of the Shar Pei are only consequence of an increased synthesis of HA. Results of the transgenic mice generated in this thesis corroborate that many questions regarding the genetic basis of HCH and FSF remained to be answered and different approaches to insight on these diseases had to be used. Therefore we analyzed other HA degradation pathways such as HAS2as, gene which regulates HAS2 expression as well as HA degradation product routes (Toll Like Receptors 2 and 4) without any significant findings. We also reanalyzed data from the Illumina CanineSNP20 BeadChip (22.362 SNPs) to look for other regions involved in Shar Peis phenotypes. We have found two homozygosity regions in Shar Peis CFA 6 (40,691,228-51,293,708; CanFam2.0) and CF 13 (23,222,643-27,079,420; CanFam2.0). Our results denote a specific haplotype characteristic to Shar Pei dogs in CFA6 which includes 2 genes (TNFR1 and MEFV) related to Familiar Mediterranean Fever in humans and a CNV. We believe that it is important to consider other genomic regions such as that in CFA 6 which harbors many candidate genes to further inquire into the genetic background of these diseases as well as to finally confirm if HCH and FSF are related sharing a common genetic background or if they are two separate entities.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / Chromatin compaction is regulated by different factors, among them histone posttranslational modifications. There are different histone modifications, and among them, acetylation and methylation of lysine residues. Acetylation levels are regulated by histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs), enzymes that catalyze addition and removal, respectively, of acetyl groups from histone lysine residues. Among the four classes of HDACs, the class III which correspond to the members of the Sir2 family or Sirtuins are quite unique. They participate in the response to a wide variety of stress stimuli through their requirement of NAD+ as a cofactor in their enzymatic activity. Mammals harbor seven Sirtuins (SirT1-SirT7). Among them, SirT6 is a nuclear protein involved in both genomic stability and metabolic homeostasis. Interestingly, SirT6 regulates the majority of these processes through an effect on chromatin, based on deacetylation of a histone mark, H3K9ac. However, the mechanism involved has not been fully characterized. In this work, we aim to study the consequences of SirT6 function in chromatin organization. We show that SirT6 overexpression induces gene silencing, which fits with the role of SirT6 as a repressor, shown by previous reports. Our studies show that SirT6 interacts with proteins or multi-protein complexes also involved in gene silencing, such as components of NuRD complex, or the HMTs EZH2, Suv39h1. However, we have focused the project in understanding the functional relationship between SirT6 and a H3K9-specific methyltransferases that we have identified as Suv39h1 and G9a. Suv39h1 trimethylates H3K9 and is essential in the establishment and maintenance of pericentromeric and telomeric constitutive heterochromatin. Interestingly, Suv39h1 was previously found to interact with SirT1 in the context of constitutive and facultative heterochromatin formation. Our work shows that the functional relationship between Suv39h1 and SirT6 is quite different from the already described between SirT1 and Suv39h1. SirT6 mediates a non canonical monoubiquitination in Suv39h1 in three conserved cysteines of the pre-SET domain. We have also identified SKP2 as the E3 ubiquitin ligase responsible of this monoubiquitination. SKP2 has a well-known role in promoting poliubiquitination and degradation of protein involved in G1/S checkpoint such as p21 and p27 and its levels are regulated during cell cycle progression. Our data show that SKP2 levels are also regulated by SirT6 through deacetylation, which in turn induce a double phosphorylation that prevents its degradation. Suv39h1 monoubiquitination is induced by double thymidine block and nocodazole treatments that arrest cells in G1/S phase and early mitosis, respectively. Furthermore, Suv39h1 monoubiquitination is induced by NF-kB pathway activation such as TNFa treatment, the overexpression of the NF-kB transcription factor RelA, or of the activator IKKa. Moreover, the promoter of the NF-kB global repressor, IkBa, is regulated by the interplay between Suv39h1, SKP2 and SirT6. Thus, upon activation of the pathway by TNFa treatment, SirT6 induces the Suv39h1 monoubiquitination through SKP2 activation and monoubiquitinated Suv39h1 is removed from the promoter allowing the transcription activation of IkBa by RelA. This novel model provides not only new insights in the regulation of NFkB pathway but also unveils new roles for SirT6, SKP2 and Suv39h1. / La compactación de la cromatina es regulada por diferentes factores entre los cuales destacan las modificaciones post-traduccionales de las histonas. Hay diferentes modificaciones de histonas entre ellas las desacetilationes y las metilaciones. Los niveles de acetilación están regulados por las histonas acetiltransferasas (HATs) y las histonas deacetilasas (HDACs), proteínas que añaden o quitan grupos acetil a las lisinas de las histonas, respectivamente. Los miembros de la familia Sir2 o de las sirtuínas constituyen la clase III de las HDACs y participan en respuesta a muchas formas de estrés. Entre ellas, está SirT6 que desacetila H3K9 acetilado para promover silenciamiento. En este proyecto mostramos que la sobreexpresión de SirT6 produce silenciamiento génico tal y como se había descrito previamente. Además, SirT6 interacciona con proteínas involucradas en silenciamiento génico como es el complejo NuRD y EZH2 y la metiltransferases de H3K9, G9a y Suv39h1. Suv39h1 trimetila H3K9 necesario para la estructura de la heterocromatina. Está caracterizada la interacción entre Suv39h1 y SirT1 en el contexto de formación de la formación de heterocromatina. La relación entre Suv39h1 y SirT6 es bastante diferente a la de Suv39h1 y SirT1. SirT6 media una monoubiquitinación no canónica en tres cisteínas conservadas del dominio pre-SET de Suv39h1. Entre las E3 ubiquitina ligasas que interaccionan con Suv39h1 y SirT6 como CHIP y CHFR, encontramos que la responsable de la monoubiquitinación de Suv39h1 es SKP2. Mostramos que los niveles de SKP2 están regulados también por SirT6 la cual desacetila SKP2 e induce su fosforilación evitando así su degradación. La monoubiquitinación de Suv39h1 es inducida con tratamiento de doble bloqueo y timidina, que paran las células en G1/S y mitosis temprana, respectivamente. Además, la activación de la vía de NFkB induce la monoubiquitinación de Suv39h1. La expresión del regulador negativo de la vía de NFkB, IkBa, está regulada por la interacción entre Suv39h1, SirT6 y SKP2 y bajo tratamiento con TNFa. SirT6 induce la monoubiquitinación de Suv39h1 a través de SKP2 y Suv39h1 monoubiquitinizado es desplazado del promotor permitiendo la activación de la transcripción de IkBa por RelA. Este modelo proporciona nuevas perspectivas de la regulación de la vía NFkB.

Numerosos estudios se llevan a cabo en todo el mundo para conocer las causas y el comportamiento del cáncer y aplicar este conocimiento a la mejora de la prevención, diagnóstico y tratamiento de las personas afectadas. Es en este contexto en el cual nuestro grupo pretende contribuir con estos objetivos, aportando nuevos conocimientos sobre los procesos involucrados en el desarrollo tumoral en el cáncer de tiroides en particular y en la carcinogénesis en general. El objetivo principal de este trabajo de tesis es estudiar la implicación de los genes WDR3 y TBX15 en el cáncer. El estudio de estos genes surge debido a que estudios previos llevados a cabo en nuestro laboratorio identificaron dos polimorfismos marcadores de la susceptibilidad al cáncer de tiroides en la región cromosómica 1p12, donde se encuentran estos genes. Además, esta región cromosómica ha sido asociada frecuentemente con numerosos tipos de cáncer. Uno de los polimorfismos identificados se encuentra en el intrón 24 del gen WDR3 y el otro en una región vacía de genes ubicada a 460 Kb del gen TBX15. La función de estos genes no ha sido completamente dilucidada, sin embargo, se ha propuesto que WDR3 estaría involucrado en la proliferación del ciclo celular a través de la interrupción de la biogénesis del ribosoma, además, varios estudios han mostrado una expresión irregular de las proteínas con motivos WD en determinados tipos de cáncer. Por otra parte, el gen TBX15, al igual que los demás miembros de la familia T-box, ha sido asociado a procesos del desarrollo, además, en los últimos años han surgido evidencias que indican una relación entre los genes T-box y la tumorigénesis, con efectos sobre la proliferación celular, invasión y metástasis. Es por ello que hipotetizamos que los genes WDR3 y TBX15 podrían estar relacionados con el cáncer. Numerosos estudios se llevan a cabo en nuestro laboratorio con el fin de dilucidar el papel de estos genes en la etiología del cáncer de tiroides en particular y también en el cáncer en general. En el presente trabajo de tesis realizamos un estudio de asociación de los genes WDR3 y TBX15 con la susceptibilidad al cáncer de tiroides y, seguidamente, analizamos su expresión y regulación principalmente en cáncer de tiroides y también en cáncer de colon y tumores cerebrales. El estudio de asociación del gen WDR3 con el cáncer de tiroides indica que este gen es un factor de susceptibilidad a este tipo de cáncer. Además, los análisis de expresión de WDR3 evidencian una sobre-expresión de este gen en el cáncer de tiroides y de colon. Los análisis de metilación de la región promotora de WDR3 indican que esta modificación epigenética no está involucrada en la regulación de la expresión de WDR3 a nivel transcripcional, sin embargo, el análisis de factores de transcripción de unión al promotor muestran que los factores c-Myc y CTCF actúan regulando la expresión de WDR3. Por otra parte, el estudio de asociación del gen TBX15 con el cáncer de tiroides indica que este gen no es un factor de susceptibilidad a este tipo de cáncer. Los análisis de expresión de TBX15 evidencian una expresión disminuida de este gen en el cáncer de tiroides. Los análisis de metilación de la región promotora de TBX15 en tejidos de tiroides y tejidos cerebrales, indican que esta modificación epigenética está involucrada en la regulación de la expresión de TBX15 a nivel transcripcional. El presente trabajo de tesis pone en evidencia el papel de los genes WDR3 y TBX15 en la etiología del cáncer de tiroides y sugieren su implicación en la carcinogénesis en general. / There are numerous studies dedicated to find out the causes of cancer and its progression and the application of this knowledge to improving the prevention, diagnosis and treatment. In this context our group contributes to these objectives, providing new insights into the processes involved in tumor development of thyroid cancer in particular and carcinogenesis in general. The main objective of this thesis is to study the involvement of the genes WDR3 and TBX15 in cancer. The study of these genes arises from studies conducted in our laboratory that identified two polymorphisms markers of thyroid cancer susceptibility in the chromosomal region 1p12, where these genes have been mapped. Additionally, this chromosomal region has often been associated with many types of cancer. One of the polymorphisms identified is located in WDR3 (intron 24) gene and the other in a region located at 460 Kb from TBX15 gene. The function of these genes has not been completely known, however, it has been proposed that WDR3 is involved in the proliferation of the cell cycle through the disruption of the ribosome biogenesis. In addition, several studies have shown an irregular expression of WD repeat proteins in certain types of cancer. Moreover, the TBX15 gene, like other members of the T-box family, has been related to developmental processes and several evidences suggest a relationship between the T-box genes and tumorigenesis, with effects on cell proliferation, invasion and metastasis. That is why we hypothesize that genes WDR3 and TBX15 may be related to cancer. Numerous studies are conducted in our laboratory to elucidate the role of these genes in the etiology of thyroid cancer in particular and also in cancer in general. In this thesis was performed an association study of genes WDR3 and TBX15 with thyroid cancer susceptibility, and their expression and regulation were analyzed in thyroid cancer, colon cancer and brain tumors. The gene association study of WDR3 with thyroid cancer indicates that this gene is a susceptibility factor for this cancer. The expression analysis shows that the WDR3 is over-expressed in thyroid cancer and colon cancer. The methylation analysis of the promoter region of WDR3 indicates that this epigenetic modification is not involved in the regulation of WDR3 expression at transcriptional level, however, analysis of transcription factors binding to the promoter shows that the c-Myc and CTCF factors could act as regulators of the WDR3 expression. Moreover, the association study of TBX15 gene with thyroid cancer indicates that this gene is not a susceptibility factor for this cancer. The expression analysis of TBX15 shows decreased expression of this gene in thyroid cancer. The methylation analysis of the promoter region of TBX15 in thyroid tissues and brain tissues, indicates that this epigenetic modification is involved in the regulation of TBX15 expression at transcriptional level. This thesis highlights the role of genes WDR3 and TBX15 in the etiology of thyroid cancer and suggests their involvement in carcinogenesis in general.

Esta tesis revela la regulación transcripcional del gen gap giant (gt) en el embrión blastodermal de Drosophila por ingeniería inversa: un modelo matemático infiere los mecanismos subyacentes de datos cuantitativos de expresión recopilados en un fondo genético silvestre. El modelo se amolda a mRNA reportero controlado por elementos reguladores en cis (CRE) de gt. Es una herramienta potente para investigar cómo se forma el patrón a nivel molecular por los sitios de unión de factores de transcripción y permite predecir la expresión en cepas mutantes. La presente tesis esclarece la regulación diferencial de dos CRE adyacentes de gt y presenta la primera evidencia experimental de auto-activación de gt mediante mutagénesis de sus elementos reguladores. Tras la optimización de los parámetros en un fondo de tipo silvestre, el modelo predice correctamente los cambios observados en mutantes de Krüppel y tailless. Otras contribuciones reglamentarias sugeridas por el modelo son confirmadas por la evaluación sistemática de los CREs en mutantes / This thesis unravels the transcriptional regulation of the gap gene giant (gt) in the Drosophila blastoderm embryo via a reverse-engineering approach: a mathematical model infers the underlying mechanisms from quantitative expression data collected in the wild-type background. The model is fit to reporter mRNA driven by cis-regulatory elements (CRE) of gt. It is a powerful tool to investigate how the pattern is formed at the molecular level from transcription factor binding sites and it gives us the ability to predict the expression in mutants. This thesis elucidates the differential regulation of two adjacent gt CREs and presents the first experimental evidence for Gt auto-activation via site-directed mutagenesis of its enhancers. After optimizing the parameters in the wild-type background, the model correctly predicts the observed changes in Krüppel and tailless mutants. Other regulatory contributions suggested by the model are confirmed by systematic evaluation of the CREs in mutants

Los avances en las tecnologías de genotipado masivo están revolucionando la comprensión de los genomas de animales domésticos, incluyendo su historia y cómo los eventos demográficos y selectivos han dado forma a la variación de los genomas de los individuos. En este trabajo analizamos por primera vez una amplia muestra de poblaciones de cerdos criollos de América y se estimó su relación genética con las poblaciones de cerdos en todo el mundo. Adicionalmente, se analizó el genoma de un cerdo que vivió en el siglo XVI a fin de proporcionar nuevas evidencias sobre eventos históricos y genéticos importantes como la domesticación y cruzamientos. Estos estudios mostraron una alta diferenciación entre las poblaciones de cerdos de Europa y Asia, siendo especialmente pronunciada para la región no pseudoautosómica del cromosoma X. A pesar del origen ibérico de los primeros cerdos introducidos en América, se observó una reducción sustancial de éste origen genético en el casi todas las poblaciones Americanas de cerdos estudiadas. El origen genético observado en las actuales poblaciones de cerdos en América se debió primero al los cerdos Ibéricos en el siglo XV y la reciente introgresión de las razas porcinas comerciales. Además se detectó origen genético proveniente de Asia, probablemente por causa de la introgresión de las razas comerciales que llevan haplotipos asiáticos, aunque no se puede descartar el cruzamiento con razas Chinas. Debido a la gran diversidad de condiciones del medio ambiente en América, se compararon las frecuencias alélicas observadas entre las poblaciones para estimar huellas de selección en el genoma, detectándose algunos genes relacionados con el sistema cardiovascular y la conformación de las extremidades. El ADN antiguo proporciona una valiosa información a cerca de los acontecimientos históricos que han modelado el genoma de los individuos modernos. En el capítulo 5 se analizó una parte del genoma de un cerdo que vivió en el siglo XVI en el noreste de España, junto a tres nuevos genomas de individuos modernos, un cerdo Ibérico, un jabalí de España y un cerdo criollo de Guatemala. Los genomas fueron obtenidos por métodos de secuenciación masiva. Los datos arqueológicos y genómicos sugirieron que el cerdo antiguo era domestico y estrechamente relacionado con los cerdos Ibéricos actuales y el jabalí Europeo, y con señales genéticas de cruzamiento entre ellos. Sorprendentemente, la comparación del cerdo antiguo y el cerdo Ibérico moderno con el genoma del cerdo criollo de Guatemala, mostró que ellos son igualmente cercanos a los cerdos criollos de América, y podría apoyar la hipótesis de la reducción de origen ibérico en cerdos Americanos causado por la introgresión de otras razas. Por último, entre los genes altamente diferenciadas se encontraron aquellos que participan en el color de la capa y el aumento del rendimiento reproductivo, ambas funciones asociadas con el primeros procesos de domesticación. Una de las estrategias de análisis para describir las relaciones de la población de cerdos utilizados en esta tesis, y ampliamente utilizado en estudios similares, es el análisis de componentes principales (PCA). Sin embargo, las proyecciones de PCA son sensibles a tamaño de muestra desbalanceado. En el capítulo 6 se evaluó una corrección en el PCA que tenga en cuenta el tamaño de la muestra de las poblaciones evaluadas ó su FST para corregir el sesgo en las proyecciones de los individuos. Las simulaciones sugieren que el método propuesto mejora las proyecciones de los individuos en dos dimensiones y en algunos caso, recupera los patrones de relaciones de la población, incluso cuando el tamaño de muestra es tan bajo como n = 1. El método ponderado de PCA puede recuperar una estructura más realista de los datos que la inferida con el PCA tradicional en poblaciones genéticamente diferenciadas. / Advances in high throughput genetic technologies are revolutionizing the understanding of domestic animal genomes, including their history and how demography and selective processes have shaped the variation of individuals’ genomes. Here we studied for the first time a large survey of village pig populations from America and estimate their relatedness with worldwide pig populations. In complement, we also analysed an ancient pig genome of 16th century to provide new evidence on important historical and genetic events like domestication and admixture. These studies showed the high differentiation between European and Asian pig populations, being particularly pronounced for the non-pseudoautosomal region of chromosome X. Despite the Iberian origin of pigs firstly introduced to America, a substantial reduction of this ancestry was observed in almost all American village pig populations. The actual ancestry observed in America is likely the result of admixing Iberian pigs in 15th century and recent introgression of commercial pig breeds. Additionally, some Asian ancestry also was observed probably due to introgression of commercial breeds carrying Asian haplotype, although direct admixture with Chinese breeds cannot be ruled out. Because the large diversity of environmental condition in the American continent, we compared the allele frequencies observed between populations to estimate signatures of selection in the genome, detecting some genes related with cardiovascular system and limbs conformation. Ancient DNA provides valuable information about the historical events that have modelled the genome of modern individuals. In chapter 5 we performed the analysis of the partial genome of a pig that lived in 16th century at North eastern Spain together three new modern genomes from Iberian pig, Spanish wild boar and a Guatemalan Creole pig obtained by whole genome shotgun sequencing. Archaeological and genomic data suggested that ancient pig was domestic, closely related to extant Iberian pigs and to European wild boar with some genetic signals of admixture with wild boar. Surprisingly, the comparison of ancient pig and modern Iberian pig to American sample from Guatemala, showed that they are equally close to American Creole pigs, and could support the hypothesis of reduction of Iberian origin in American village pigs driven by introgression of other breeds. Finally, among the highly differentiated genes we found those involved in coat colour and an increase the reproductive performance, both known functions associated with early domestication process. One of the analytical strategies to describe the population relationships of pigs used in this thesis, and widely used in similar studies is the principal component analysis (PCA). Nonetheless, PCA projections are sensitive to unequal sample size. In Chapter 6 we evaluated a correction in PCA that consider either sample size of evaluated populations or their FST estimates to correct bias in individual projections. Simulations suggest that the proposed method improves the two-dimensional projections of PCA data and, in some cases, entirely recovers population relationships patterns, even when sample size is as low as n=1. The weighted PCA can recover a more realistic structure than inferred with traditional PCA in well-structured populations.

Este trabajo de tesis se centró en tres ámbitos de gran interés social, económico y biomédico: envejecimiento, epigenética y ejercicio físico como estilo de vida saludable. Actualmente existe un patrón de pirámide poblacional cada vez más envejecido y la proporción de patologías asociadas a este proceso ha aumentado significativamente, convirtiendo al envejecimiento en uno de los principales ejes de la investigación científica actual. Además, los recientes hallazgos en el campo de la epigenética muestran la implicación de este tipo de regulación en la mayoría de procesos celulares y funciones biológicas. La modulación epigenética ejercida por el entorno y los hábitos de vida hacen de esta ciencia una de las más interesantes en la búsqueda de herramientas preventivas y terapéuticas de patologías crónicas y asociadas a envejecimiento. Asimismo, el ejercicio físico es uno de los factores de estilo de vida más estudiados y recomendados por las autoridades sanitarias a nivel mundial como hábito saludable. En este contexto, el objetivo principal de esta tesis fue identificar marcadores de envejecimiento y su posible regulación epigenética mediante la práctica de ejercicio físico en el modelo murino de senescencia acelerada SAMP8 empleando como control la cepa SAMR1,. Observamos que los ratones SAMP8 presentan rasgos de inflamación crónica y alteraciones de factores de remodelación de cromatina durante todo su ciclo vital. El entorno proinflamatorio presente en los ratones senescentes se ha visto reflejado por el aumento de IL6 y por una respuesta exacerbada a LPS, debido al menos en parte a la reducción en la expresión del factor epigenético RCOR2. Además, se observó alteración en la expresión génica de diversos componentes remodeladores de cromatina, implicados principalmente en la regulación de los niveles de metilación de histonas. En concordancia con estos resultados, los ratones SAMP8 mostraron un aumento de histona H3 trimetilada en lisina 4 en linfocitos, hipocampo y corteza cerebral, lo cual sugiere que los mecanismos de regulación de metilación de histona H3 lisina 4, podrían ser la vía por la cual se establece la relación entre inflamación y envejecimiento en los ratones SAMP8. En cuanto a la modulación por ejercicio físico, se observaron beneficios derivados de la práctica a nivel fenotípico, neurovascular y transcripcional. En hipocampo, el aumento en los niveles de vascularización observado en los ratones SAMP8 se vio acompañado del aumento de factores neurotróficos como el Bdnf y otros componentes de su vía, Trkb y neuritina, implicados en fenómenos de plasticidad neuronal y neurogénesis. Por otro lado, la matriz extracelular mostró ser el compartimento más sensible al ejercicio físico. También se observaron cambios a nivel epigenético, concretamente en acetilación de histonas y microARNs asociados a desarrollo neuronal y enfermedades neurológicas. Todos estos datos apoyan el uso del ejercicio físico como terapia complementaria para la prevención y tratamiento del deterioro cognitivo y enfermedad de Alzheimer. / This thesis is focused on three major topics: aging, epigenetics and exercise. Nowadays, the molecular mechanisms of aging as well as the manifestation and progression of age-related pathologies is one of the main fields of biomedical research. Furthermore, epigenetics is an emerging and very promising science, as it has been described its involvement in most biological functions and seems to be modulated by genetic, but also environmental and lifestyle factors. Among them, exercise has been widely associated with cardiovascular and cognitive improvements and its positive impact on the promotion of health has been broadly accepted. In this context, the main objective of this thesis was to identify aging biomarkers and their epigenetic modulation by physical exercise in the accelerated senescence mouse model SAMP8. We have found that senescence mice exhibit features of chronic inflammation. We described an interplay between the down-regulation of the epigenetic factor RCOR2 and the increased of cytokine IL6 in SAMP8 mouse model. Moreover, changes in some chromatin remodeling factors mainly involved in the regulation of histone methylation levels and a consequent enhancement in trimethylation of histone H3 at lysine 4 were found in peripheral and nervous tissues of SAMP8 mice. These results suggest the involvement of epigenetic machinery in the relationship between inflammation and aging. Regarding the effects of physical exercise, phenotypic, neurovascular and transcriptional alterations were detected after the exercise intervention. An increase in vascularization levels in the hippocampus of SAMP8 mice was accompanied by changes in the expression of neurotrophic and neurogenic factors of the BDNF pathway. Furthermore, physical exercise reversed the transcriptional alterations present in SAMP8 mice for several genes involved in the establishment and maintenance of the extracellular matrix. Epigenetic changes were also observed after the exercise practice, specifically in histone acetylation and microRNAs that were previously associated with neural development and neurological disorders such as Alzheimer’s disease. As a whole, the findings presented in this thesis support the use of moderate physical activity as a complementary therapy for the prevention and treatment of cognitive impairment and Alzheimer's disease.

Aquest treball parteix de la premissa que els processos de diferenciació cel·lular i tumorigènesi impliquen vies de senyalització i programes relacionats i que l’estudi dels canvis epigenètics subjacents a ambdós processos pot contribuir a un millor coneixement dels mecanismes i factors que determinen el destí i funcions cel·lulars. L’estudi dels patrons epigenètics en aquests processos s’ha realitzat a diferents nivells: escala genòmica, regions regulades conjuntament en càncer (Silenciament Epigenètic de Gran Abast, LRES) i a nivell individual. L’estudi dels patrons de metilació a escala genòmica mitjançant l’AIMS-Seq va permetre determinar que la diferenciació de l’intestí prim es caracteritza per lleus guanys de metilació que s’esdevenen majoritàriament en les regions contigües a illes CpG promotores (CpGi shores) associades a gens implicats en el desenvolupament, regulació de l’expressió i càncer. La gran majoria d’aquests gens no s’expressaven en intestí, estaven hipermetilats en adenomes de ratolins Apcmin/+ i en la línia cel·lular colorectal murina CT26. Els estudis d’expressió gènica amb microarrays revelaren una sobreexpressió en adenomes dels gens involucrats en comunicació cel·lular, angiogènesi i migració, que no es relacionà amb canvis en la metilació del DNA. Així doncs, es pot concloure que els gens implicats en desenvolupament, sovint poc expressats en teixit diferenciat, tendeixen a metilar-se tant en processos de diferenciació com en processos tumorals. Roman per determinar si aquesta tendència a hipermetilar-se durant la diferenciació té una repercussió funcional directa o és conseqüència d’un procés d’estabilització irreversible de la cromatina en un estat de silenciament gènic. Per tal d’analitzar la dinàmica del LRES en diferenciació i càncer van ser claus: el model de diferenciació in vitro de les cèl·lules d’adenocarcinoma humà CaCo2 a cèl·lules amb fenotip d’enteròcit, on s’observà la reversió del LRES; i la determinació que el LRES és un mecanisme conservat en càncer colorectal murí (CT26), fet que va permetre l’ús del ratolí com a model d’estudi. Els adenomes inicials dels ratolins APCmin/+ no mostraren LRES. En fases avançades, el LRES comportà la pèrdua dels subdominis de la regió (disminució de CTCF) i la infraexpressió gènica, essent el silenciament per metilació del DNA i l’adquisició de marques repressives de cromatina (H3K9me/3, EZH2) propis d’estadis més avançats de la carcinogènesi. Tot i que aquests gens tenien dominis bivalents de cromatina (H3K4me3 i H3K27me3) en teixit normal, la hipermetilació en cèl·lules tumorals no comportà una resolució de la bivalència (determinat per reChIP). A més, aquestes regions tendien a estar hiperactivades en cèl·lules progenitores de l’intestí i en adenomes benignes, suggerint la presència d’un possible mecanisme de protecció contra el silenciament regional en cèl·lules no malignes amb elevada capacitat proliferant. Finalment, ens vam interessar pel gen INH-βB, citoquina que dimeritza formant Activines. L'INH-βB està silenciat en càncer colorectal mitjançant LRES i la hipermetilació de la seva CpGi promotora està associada a una reducció de la supervivència del pacient. Els estudis funcionals (proliferació, migració i invasió) en línies cel·lulars colorectals no van demostrar que el silenciament d'aquest gen incrementés la malignitat cel·lular, suggerint que la seva associació amb agressivitat podria està relacionada amb l'extensió del fenomen LRES més que amb un efecte directe del silenciament del gen. Cal emfatitzar la necessitat d’implementar aquests estudis en altres línies cel·lulars i expandir l’anàlisi a altres funcions com són l’adhesió i la resposta a hipòxia per confirmar aquestes interpretacions. / This work is based on the fact that cellular differentiation and tumoral processes concern related pathways and that the study of epigenetic changes involved in both processes could contribute to a better understanding of the mechanisms and factors that determine the cellular fate and function. The analysis of the epigenetic patterns associated with these processes has been performed at different levels: genomic scale, regions regulated concomitantly in cancer (Long Range Epigenetic Silencing, LRES) and specific genes. Genomic methylation patterns throughout small intestine differentiation were analyzed by AIMS-Seq showing slight gains of methylation, mainly in regions contiguous to promoter CpG island (CpGi shores) of genes involved in development and cancer. The great majority of these genes were not expressed in intestine and were hypermethylated in Apcmin/+ mouse adenomas and in colorectal cell line CT26. Microarray analysis revealed that adenomas overexpressed genes implicated in cellular communication, angiogenesis and wound healing, although they did not present variations in DNA methylation. Therefore, genes involved in development, usually expressed at low levels in differentiated tissue, tend to be methylated during cellular differentiation and tumoral progression. It remains to be elucidated whether this tendency to hypermethylation during differentiation has a direct functional effect or it just implies a irreversible chromatin stabilization after genetic silencing. In order to analyze LRES dynamics during differentiation and cancer processes we worked with in vitro differentiation of the adenocarcinoma cell line CaCo2 to enterocyte-like population, in which LRES was reverted. Furthermore we determined the occurrence of the LRES mechanism in murine colorectal carcinoma (CT26), which let us to compare the mouse and human LRES processes. Initial adenomas from APCmin/+ mice did not show LRES. In advanced stages, LRES implied the loss of regional boundaries (CTCF) and transcriptional down-expression, being the silencing by DNA methylation and the acquisition of chromatin repressive marks (H3K9me2/3, EZH2) features of later stages of carcinogenesis. Although these genes presented chromatin bivalent domains (H3K4me3 and H3K27me3) in normal tissue, DNA hypermethylation in tumoral cells did not imply resolution of bivalent states (determined by reChIP). Moreover, these regions tend to be more transcriptionally active in intestinal progenitor cells and benign adenomas, suggesting that this elevated expression could be a possible protective mechanism against regional silencing in non-malignant cells with high proliferative capacity. Lastly, we were interested in INH-βB, a cytokine that dimerizes forming Activins. INH-βB is silenced in colorectal cancer by LRES and the hypermethylation of its promoter CpG island has been associated with a reduction of patient survival. Functional studies (proliferation, migration and invasion) in colorectal cell lines did not demonstrate that INH-βB silencing increases malign cell properties. Therefore, the association with aggressiveness could be due to the LRES extension instead of the direct effect of INH-βB silencing. In order to confirm this interpretation it is necessary to extend these functional studies to other cell lines and to investigate other functions, such as adhesion and response to hypoxia.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvtige (IDIBELL) / La sirtuïna 1 (SirT1), una desacetilasa depenent de NAD, promou la formació de l’heterocromatina facultativa (HF) desacetilant H4K16Ac, H3K9Ac i H1K26Ac i establint marcadors d’heterocromatina via interacció amb la histona metiltransferasa Suv39h1, un factor clau en l’organització de la cromatina. Però SirT1 també regula l’heterocromatina constitutiva (HC) depenent de Suv39h1 a través d’un mecanisme desconegut. Considerant la importància de l’HC en l’organització i estabilitat de la cromatina global, i les seves implicacions funcionals en l’envelliment i la durada de la vida, definir si i com SirT1 ajuda a mantenir l'estructura de l’HC podria ser per a determinar les conseqüències durant la resposta a l'estrès en l'estabilitat del genoma. Per aquest motiu, en aquesta primera part de la tesi, ens vam centrar en entendre la connexió entre SirT1 i l’estructura de l’HC a través de l’estudi de la relació entre SirT1 i Suv39h1, ja que com s’ha comentat anteriorment, aquesta relació és crucial per la formació d’HC. En el mecanisme que proposem entre SirT1 i Suv39h1 per entendre la relació funcional entre aquestes dues proteïnes a l’HC, SirT1 preserva l’estructura de l’HC a través de l’estabilització de Suv39h1 sota condicions d’estrès inhibint la poliubiquitinització, mediada per la ubiquitina lligasa E3 MDM2 (un factor molt important en el control de la resposta a estrès relacionat amb p53), a la lisina 87 del domini chromo de Suv39h1. Els nostres estudis suggereixen que l’augment dels nivells de Suv39h1 promou un augment de l’intercanvi d’aquest a l’HC. L’increment de la taxa de renovació de Suv39h1, observat al mutant K87 d’aquest, promou la integritat genòmica en condicions d’estrès genotòxic. Aquest mecanisme pot ser també molt important per l’HF en el contexte del programa d’expressió en resposta a estrès regulat per SirT1. Una altra proteïna molt important en l’HC, en el manteniment i formació d’aquesta, és la proteïna estructural HP1, de la qual s’han descrit tres isoformes en mamífers: HP1α, HP1β i HP1γ. Curiosament comparada amb SirT1, HP1 també s’uneix a la regió N-terminal de Suv39h1, però contràriament, té una forta localització a HC. Aquesta observació ens va portar a desenvolupar la segona part del projecte centrada en entendre si el mecanisme observat entre SirT1 i Suv39h1 estava conservat dins del cor estructural de l’HC a través de la relació entre Suv39h1 i les isoformes d’HP1. Conseqüentment, aquest estudi ens va dirigir cap a la caracterització del paper de cadascuna de les isoformes d’HP1 en el manteniment de l’estructura de l’HC. Les qual s’han considerat, excepte en aspectes molt concrets, força similars. Sorprenentment, tot i la similitut entre les tres isoformes d’HP1, vam aportar una regulació diferencial sobre Suv39h1. De les isoformes d’HP1 existents a mamífers, dues d’elles HP1α i HP1γ, augmenten els nivells de Suv39h1 a través de la seva unió i regulació a la regió N-terminal d’aquest, com hem vist amb SirT1, inhibint la degradació per ubiquitinització i conseqüentment augmentant l’intercanvi de Suv39h1. El mecanisme a través del qual no està clar. HP1β sembla tenir un paper com a reservori respecte la regulació de Suv39h1 en condicions normals. Les isoformes d’HP1α i HP1γ també semblen incrementar la renovació de Suv39h1 per tal de mantener una adequada estructura de l’HC. Específicament, l’HP1β sería necessària en aquest augment sota l’efecte de l’estrès per garantitzar la integritat del genoma. Tenint en compte el coneixement de l’HC, que és mínim, els nostres estudis s’han centrat en entendre l’estructura, a través de la caracterització del paper de les isoformes d’HP1, en condicions normals i d’estrès. Proposem un model en el qual situaríem predominantment HP1α, però també HP1γ, formant homo i heterodímers, en diferents regions del foci d’HC limitant l’expansió de la marca d’H4K20me3. En aquesta regió, Suv39h1 uniría a HP1α i a HP1γ i aquestes l’estabilitzarien. I en el centre d’aquestes regions localitzaríem HP1β que tindria més afinitat amb Suv420h2 formant homo i heterodímers amb HP1γ. En absència d’HP1α, la modificació H4K20me3 s’expandiria provocant una compactació a la cromatina. / Sirtuin1 (SirT1) is a NAD dependent deacetylase that promotes the formation of facultative heterochromatin via interaction with histone methyltransferase Suv39h1, a key factor in the organization of chromatin. But SirT1 also regulates the constitutive heterochromatin (HC) depending Suv39h1 through an unknown mechanism. Considering the importance of the HC in the organization and stability of the global chromatin and its functional implications in aging and lifespan, define whether and how SirT1 helps keep the structure HC could be to determine the implications for the stress response in genome stability. In the proposed mechanism between SirT1 and Suv39h1 to understand the functional relationship between these two proteins in the HC, SirT1 preserves the structure of the HC through the stabilization of Suv39h1 under stress conditions inhibiting polyubiquitination mediated by MDM2 at lysine 87 of the chromo domain of Suv39h1. The increase in available Suv39h1 is associated with a faster renewal of the HC and increased protection of genomic integrity in these conditions. Another important protein in the HC, maintenance and training for this, which also binds to the N-terminal region of Suv39h1 is heterochromatin protein1 (HP1) which has a strong localization in HC. Therefore, we focused on studying the relationship between Suv39h1 and three HP1 isoforms found in mammals: HP1α, HP1β and HP1γ. Surprisingly, despite the similarity, we observed a differential regulation of Suv39h1. HP1α and HP1γ, increase the levels of Suv39h1 through its binding and regulation by the N-terminal region that inhibits degradation by polyubiquitination and consequently increasing the exchange of Suv39h1 to maintain an adequate structure of the HC. The mechanism through which is unclear. HP1β would be necessary, in this increase, under the effect of stress. This study led to the characterization of the role of each of the HP1 isoforms in maintaining the structure of the HC. We propose a model which would place predominantly HP1α, but also HP1γ in different regions of foci of HC limiting the expansion of the H4K20me3 mark. In this region, would interact Suv39h1. And the center, HP1β would have more affinity with Suv420h2, where also would find HP1γ.

High Throughput Sequencing technologies (HTS) are becoming the standard in genomic regulation analysis. During my thesis I developed software for the analysis of HTS data. Through collaborations with other research groups, I specialized in the analysis of ChIP-Seq short mapped reads. For instance, I collaborated in the analysis of the effect of Hog1 stress induced response in Yeast and helped in the design of a multiple promoter-alignment method using ChIP-Seq data, among other collaborations. Making use of expertise and the software developed during this time, I analyzed ENCODE datasets in order to detect active genomic enhancers. Genomic enhancers are regions in the genome known to regulate transcription levels of close by or distant genes. Mechanism of activation and silencing of enhancers is still poorly understood. Epigenomic elements, like histone modifications and transcription factors play a critical role in enhancer activity. Modeling epigenomic signals, I predicted active and silenced enhancers in two cell lines and studied their effect in splicing and transcription initiation. / Las tecnologías High Throughput Sequencing (HTS) se están convirtiendo en el método standard de análisis de la regulación genómica. Durante mi tesis, he desarrollado software para el análisis de datos HTS. Mediante la colaboración con otros grupos de investigaci n, me he especializado ́ en el análisis de datos de ChIP-Seq. Por ejemplo, colaborado en el análisis del efecto de Hog1 en células de levadura afectadas por stress, colaboré en el diseño de un m ́ todo para el alineamiento m ́ ltiple de promotores usando datos de ChIP-Seq, entre otras colaboraciones. Usando el conocimiento y el software desarrollados durante este tiempo, analicé datos producidos por el proyecto ENCODE para detectar enhancers genómicos activos. Los enhancers son areas del genoma conocidas por regular la transcripción de genes cercanos y lejanos. Los mecanismos de activación y silenciamiento de enhancers son aún poco entendidos. Elementos epigenómicos, como las modificaciones de histonas y los factores de transcripción juegan un papel crucial en la actividad de enhancers. Construyendo un modelo con estas señales epigen ́ micas, predije enhancers activos y silenciados en dos lineas celulares y estudié su efecto sobre splicing y sobre la iniciacion de la transcripción.

Antimicrobial Peptides have strong interest as a novel class of antimicrobial agents in the phytosanitary field. This Thesis focuses on the development of strategies to produce of BP100 derivatives (BP100ders) in genetically modified (GM) rice plant biofactories. The production of certain BP100ders using a strong constitutive promoter was toxic to the host plant and, impairing its viability. That phytotoxicity to the host was directly linked to the haemolytic activity of BP100ders. Transgenic plants were obtained that produced these peptides with yields up to 0.5% total soluble protein and retaining their antimicrobial activity. Through fusion to the DsRed fluorescent tag allowed tracing recombinant BP100ders in plants observing the accumulation in large vesicles derived from the endoplasmic reticulum. Through a strategy based on inducible promoters, particularly heat-shock, we showed that recombinant phytotoxic peptides can be produced in GM plants by using promoters that have minimal activities during transformation and regeneration of GM plants / Els pèptids antimicrobians són de gran interès com una nova classe d'agents antimicrobians en el camp fitosanitari. Aquesta Tesi se centra en el desenvolupament d’estratègies per a la producció de BP100ders en plantes d'arròs modificades genèticament (MG) com a biofactoria. La producció d’alguns BP100ders sota el control d’un promotor constitutiu fort va ser tòxica per la planta. Aquesta fitotoxicitat estava directament relacionada amb l'activitat hemolítica del pèptid. Es van obtenir plantes MG que els produeixen amb uns rendiments de 0,5% de proteïna soluble total i conservant l’activitat antimicrobiana. Mitjançant fusió amb la proteïna fluorescent DsRed es va observar l'acumulació dels BP100ders recombinants en grans vesícules derivades del reticle endoplasmàtic. Mitjançant l'estratègia basada en l'ús de promotors induïbles, concretament per temperatures elevades, es va demostrar que els pèptids fitotòxics poden ser produïts en plantes MG si els transgens que els codifiquen estan regulats per promotors amb una activitat basal mínima