L'estudi de la variació genòmica ens pot ajudar a entendre la història demogràfica de les poblacions i els events de selecció que hi han influït. Normalment això es fa mitjançant els tests de neutralitat, una eina estadística que permet detectar desviacions de la neutralitat mitjançant la comparació dels resultats empírics obtinguts per un estadístic a partir d'una mostra d'ADN, contra una distribució neutra simulada d'aquest estadístic. Tot i això, aquesta metodologia té algunes limitacions, principalment relacionades amb (a) la variació a partir de la que treballa el test, (b)la metodologia d'ús dels estadístics de neutralitat, i (c) la tecnología emprada per obtenir informació de les seqüències d'ADN. En els quatre articles presentats en aquesta tesis he abordat tots aquests problemes. Respecte a la primera limitació he analitzat l'efecte que les desviacions de la neutralitat, com ara la recombinació i la demografia, tenen sobre el poder dels estadístics de neutralitat. Pel que fa a la metodologia, he estudiat si la incertesa en la reconstrucció de les dades de resequenciació té algun efecte en el poder dels tests quan aquests es comparen contra dades simulades. Finalment, els dos darrers treballs aborden els problemes que sorgeixen quan s'utilitzen genotips en lloc de dades de resequenciació, i proposen alternatives per a l'anàlisi d'aquestes dades. / The study of the genomic variation can give us insights into the demographic history of the populations and of the selective events acting upon them. This is usually approached by means of the neutrality tests, a statistical tool that can detect departures from neutrality by comparing the empirical results for a given statistic obtained from DNA samples against neutral, simulated distribution of this statistic. However, this methodology has some limitations, mainly related to (a) the variation the tests rely upon, (b) the methodology of the use of neutrality tests, and (c) the technology used to obtain information from DNA sequences. In the four papers included in this thesis I approach all these issues. For the first of the mentioned concerns, I have analysed how the power of neutrality statistics is affected by departures of neutrality such as recombination or demographic events. As for the methodology, I have estudied whether uncertainity in the reconstruction of resequencing data has any effect on the power of the tests when it is compared with simulation data. Finally, the last two works address the problems of using genotyping instead of resequencing data and propose alternatives to the analysis of such data.

El diagnòstic genètic preimplantaional (PGD) permet seleccionar, dins un programa de fecundació in vitro (FIV), embrions lliures d’alteracions cromosòmiques per a la transferència a l’úter matern. Actualment, la tècnica més freqüentment utilitzada per a aquesta finalitat és la hibridació in situ fluorescent (FISH), que tan sols permet analitzar de manera rutinària nou dels 24 tipus diferents de cromosomes existents. Una tècnica alternativa menys emprada és la hibridació genòmica comparada (CGH), que permet una anàlisi citogenètica completa de tot el cariotip. Aquesta metodologia, però, requereix un temps major que la duració del cicle de FIV per obtenir els resultats, de manera que els embrions analitzats s’han de criopreservar i transferir en un altre cicle addicional. L’objectiu d’aquest treball ha estat desenvolupar i aplicar una metodologia de CGH ràpida en què el temps d’hibridació s’ha reduït de 72 hores a 12 hores, de manera que no sigui necessària la criopreservació. Per a la seva posada a punt, s’han analitzat 32 fibroblasts aïllats de línies cel·lulars establertes (Coriel) amb alteracions cromosòmiques conegudes, el resultat de CGH ràpida dels quals ha confirmat en tots els casos la presència d’aquestes alteracions. Un cop desenvolupat el protocol de CGH ràpida, s’ha adaptat i validat per a l’anàlisi de blastòmers, emprant embrions descartats de casos de PGD mitjançant FISH amb nou sondes per als cromosomes 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X i Y (FISH-9-cr). Aquesta anàlisi ha posat de manifest que les discordances entre els resultats de la CGH ràpida i els de la FISH-9-cr són degudes principalment a l’existència de mosaïcisme, però també a errors de la FISH. La CGH ràpida també s’ha utilitzat per fer l’anàlisi de 22 embrions de pacients amb edat materna avançada descartats del PGD amb FISH-9-cr. Aquest estudi ha revelat la presència d’aneuploïdies (el 38,5% de les quals no s’haurien detectat mitjançant la FISH) i d’alteracions estructurals (en el 31,8% dels embrions), així com de mosaïcisme (en el 77,3% dels embrions) en els diferents blastòmers analitzats. Un cop demostrada la seva fiabilitat, la tècnica s’ha aplicat clínicament per al cribatge d’aneuploïdies en dos casos d’edat materna avançada, dos casos d’avortaments de repetició i un cas de fallades repetides d’implantació, en els quals s’ha obtingut una taxa d’implantació dels embrions transferits del 60%. Prèvia comprovació que la CGH ràpida era capaç de detectar desequilibris parcials de cromosomes amb un límit de resolució de 10-20Mb, aquesta metodologia s’ha aplicat en el PGD de portadors de translocacions cromosòmiques Robertsonianes (tres casos, quatre cicles de FIV-PGD), recíproques (dos casos, tres cicles de FIV-PGD) i un cas d’una doble translocació (tres cicles de FIV-PGD), en els quals s’ha obtingut un elevat èxit de diagnòstic i dos embarassos. En aquests casos, la CGH ràpida permet estudiar la segregació dels cromosomes implicats en la reorganització, alhora que la resta de cromosomes de la cèl·lula. La variant de CGH desenvolupada, doncs, permet estudiar tots els cromosomes de la cèl·lula i detectar-hi tant alteracions numèriques com estructurals en un sol procediment que, degut a la reducció del temps d’hibridació, és compatible amb la transferència en fresc dels embrions seleccionats. Per tant, la seva implementació pot incrementar la taxa d’implantació dels embrions transferits després del PGD. / Preimplantation genetic diagnosis (PGD) concurrent to in vitro fertilization (IVF) allows for the selection of embryos free of chromosomal abnormalities for transfer into the mother uterus. Nowadays, the technique most frequently used for this purpose is fluorescent in situ hybridization (FISH), which routinely allows for the study of only nine of the 24 existing chromosomes. Comparative genomic hybridization (CGH), although applied less frequently, is an alternative approach which permits a comprehensive cytogenetic study of the full karyotype. This method, nevertheless, requires a time greater than the length of the IVF cycle to get the results, so the embryos analyzed must be cryopreserved and transferred in a subsequent additional IVF cycle. The objective of this work was to develop and apply a short-CGH methodology in which the hybridization time is reduced from 72 hours to 12 hours, so that cryopreservation of biopsied embryos is no necessary. Thirty-two fibroblasts isolated from established cell lines (Coriel) with known aneuploidies have been used to develop the short-CGH protocol, obtaining results that confirmed the presence of these aneuploidies in all the studied cells. Subsequently, the method was adapted and validated for the analysis of blastomeres, using discarded embryos from PGD by FISH with nine probes for chromosomes 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X and Y (FISH-9-cr). The short-CGH analysis revealed that the discordances between short-CGH results and FISH-9-cr results are mainly due to the existence of mosaicism, but also to FISH errors. The short-CGH approach has also been used for the analysis of 22 embryos from advanced maternal age patients, discarded by FISH-9-cr PGD. This study detected aneuploidies (38.5% of which could not have been detected by FISH), structural errors (in 31.8% of the embryos) and mosaicism (in 77.3% of the embryos) among the analysed blastomeres. Once its reliability was proven, this technique has been clinically applied for aneuploidy screening in two advanced maternal age cases, two recurrent miscarriage cases and a repeated implantation failure case, allowing a 60% implantation rate. After checking that short-CGH is capable of detecting partial chromosomal imbalances with a resolution limit of 10-20Mb, this approach has been applied in PGD for chromosomal Robertsonian translocation carriers (three cases, four IVF-PGD cycles), reciprocal translocation carriers (two cases, three IVF-PGD cycles) and a double translocation carrier (three IVF-PGD cycles), in which high diagnosis rate and two pregnancies have been achieved. In these cases, short-CGH allows for the study of the chromosomes involved in the reorganization simultaneously to the analysis of the remaining complement chromosomes. In conclusion, the developed CGH variant permits the study of the full karyotype, detecting both numerical and structural chromosomal abnormalities in a single process that, due to the reduction of the hybridization period, is compatible with fresh transfer of the selected embryos. Therefore, its implementation may improve the implantation rate of the transferred embryos after PGD.

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The conservation of species relies on a deep knowledge of biology of the species concerned, as well as on the identification of reproductively isolated units, which are genetically different from one other (genetic stocks). Red shrimps, Aristeus antennatus and Aristaeomorpha foliacea, are commercially important decapods with a large distributional range in the Mediterranean Sea (MED), Atlantic Ocean (AO) and Mozambique Channel (MOZ). The genetic analysis of harvesting grounds of A. antennatus and A. foliacea has allowed identify four genetic stocks within each species and sampled area. The Strait of Gibraltar, the Strait of Sicily and the Peloponnesian gyre were identified as major barriers to gene flow within the Mediterranean Sea and adjacent waters. Furthermore, A. antennatus was identified as a monophyletic species whilst in A. foliacea three genetic lineages were detected, one of which presented multilocus support, so as to be considered a different genetic species. / La conservació i gestió d’espècies depèn d’un bon coneixement de la seva biologia així com de la identificació d’unitats reproductivament aïllades i genèticament diferenciades (estocs genètics). Les gambes vermelles, Aristeus antennatus i Aristaeomorpha foliacea són decàpodes marins amb un alt valor econòmic i un ampli rang de distribució en el Mar Mediterrani, Oceà Atlàntic i Oceà Índic. L’anàlisi genètic dels caladers més importants d’A. antennatus i A. foliacea mitjançant diversos marcadors moleculars ha permès la identificació de quatre estocs genètics en cadascuna de les espècies. L'Estret de Gibraltar, l’Estret de Sicília i el gir del Peloponès es varen identificar com barreres geogràfiques i hidrogràfiques que causen restricció al flux gènic dintre del Mediterrani i amb aigües colindants. D’altra banda, els resultats revelen el monofiletisme d’A. antennatus, i l’existència de tres llinatges en A. foliacea, un dels quals presenta suport multilocus per a ser considerat una espècie genètica diferent.

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La expansión de repeticiones de trinucleótidos es la base molecular de algunas enfermedades genéticas hereditarias, como la distrofia miotónica tipo 1 (DM1) y el síndrome del X frágil (FXS). Los alelos expandidos asociados a enfermedades son inestables tanto en la línea somática como en la germinal, con una clara tendencia hacia las expansiones. La tasa de expansiones está directamente relacionada con el tamaño del alelo expandido y con la edad del individuo. Muchos factores genéticos pueden afectar a la inestabilidad de repeticiones de trinucleótidos, pero también factores ambientales podrían modular esta inestabilidad.Para investigar el efecto de factores ambientales en la inestabilidad de repeticiones de trinucleótidos, estudiamos:- El efecto de la MMC en la inestabilidad de las secuencias (CTG)n y (CGG)n endógenas, asociadas a la DM1 y al FXS, respectivamente, en líneas celulares deficientes y no deficientes en el sistema de reparación de falsos apareamientos (MMR), con un número normal de repeticiones.- El efecto de la MMC en la inestabilidad de las repeticiones (CTG)n en alelos normales y patogénicos en líneas celulares linfoblastoides derivadas de pacientes DM1 a lo largo del tiempo.Vimos que la MMC induce inestabilidad en secuencias cortas de repeticiones de trinucleótidos en la línea celular SW480, por un mecanismo en trans independiente de MMR, y en la línea HCT116, en menor grado, por un mecanismo dependiente de la deficiencia en hMLH1. También vimos que la MMC promueve la inestabilidad en secuencias cortas de líneas celulares linfoblastoides derivadas de pacientes, y que acelera el proceso de expansión de las repeticiones CTG en alelos patogénicos. Esta tesis es la primera demostración de inducción por mutágenos de inestabilidad de repeticiones de trinucleótidos asociadas a enfermedades genéticas humanas. / Trinucleotide repeat expansion is the molecular basis of several genetic diseases, including myotonic dystrophy type 1 (DM1) and the fragile X syndrome (FXS). The disease-associated expanded alleles are unstable both in somatic and germ cell lineages, with a high tendency towards expansion. The rate of expansion is directly related to the size of the pathogenic allele, increasing the size heterogeneity with age. Genetic factors modulate the trinucleotide repeat instability. In this thesis we hypothesize that environmental factors could also modulate this instability.To investigate the effect of environmental factors in the trinucleotide repeats instability, we study:- The mytomycin C (MMC) effect in (CTG)n and (CGG)n instability, associated to DM1 and FXS, respectively, in mismatch repair (MMR) proficient and deficient cell lines, with normal trinucleotide repeat length.- The MMC effect in the (CTG)n repeats in normal and pathogenic alleles in lymphoblastoid cell lines from DM1 patients over time.We found that MMC induced instability in short trinucleotide repeats. We observed two mechanisms of MMC-induced trinucleotide repeats instability: a major trans-acting mechanism independent of MMR and a minor mechanism dependent on MLH1 deficiency. Our results also indicated that MMC modulates the dynamics of DM1 associated CTG repeats in lymphoblastoid cell lines, enhancing the expansion bias of long-pathogenic repeats and promoting the expansion of normal length repeats. This thesis is the first demonstration of mutagen-induced instability of trinucleotide repeats associated to human disese.

El cáncer de tiroides representa un 98% de los cánceres del sistema endocrino y existen muy pocos estudios sobre factores genéticos de susceptibilidad en este tipo de cáncer. En los últimos años, se está analizando con mucha atención el papel de los polimorfismos genéticos en la susceptibilidad individual a padecer cáncer. En nuestro trabajo hemos genotipado, mediante PCR, dos microsatélites, THRA1 y BAT-40, y seis polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) en una población de pacientes y controles con el objetivo de determinar la posible asociación entre la susceptibilidad al cáncer de tiroides y dos regiones genómicas diferentes. Por un lado, el gen codificante del receptor ?1 de la hormona tiroidea (NR1A1a,17q11.2), que contiene el microsatélite THRA1; y por otro, la región p12-13 del cromosoma 1, estudiando el microsatélite BAT-40 y seis SNPs. En ambos casos se estudió la asociación de los distintos polimorfismos con la susceptibilidad al cáncer del tiroides, así como la interacción entre ellos y con factores ambientales. En nuestros resultados observamos que los genotipos con repeticiones cortas de THRA1 (<18 CA) podrían tener un efecto protector respecto a la susceptibilidad al cáncer de tiroides, que podría estar relacionado con el nivel de expresión del gen NR1A1a. Asimismo, los genotipos con alelos de BAT-40 del intervalo de repeticiones A25-A29 muestran también un efecto protector; y los genotipos con un número de repeticiones menor de 11 podrían estar asociados con el riesgo de cáncer de tiroides, por lo que el microsatélite BAT-40 puede ser un posible marcador genético de susceptibilidad a este cáncer. El análisis adicional de los seis SNPs de la región 1p12-13 muestra que los polimorfismos rs2145418 y rs46599873 presentan una asociación estadísticamente significativa con la susceptibilidad al cáncer de tiroides. Dado que el marcador rs2145418 está en una región en la que no se ha descrito ningún gen, consideramos que el responsable de la asociación podría ser un factor sin identificar o que se trate de una región reguladora. Asimismo, puesto que el SNP rs4659873 se sitúa en el intrón 25 del gen WDR3, posiblemente implicado en procesos de regulación génica y progresión del ciclo celular, proponemos la posible implicación de este gen en la susceptibilidad al cáncer de tiroides.En los últimos años, el descubrimiento de la inestabilidad genómica inducida por la radiación ha provocado un aumento del interés en conocer los efectos de la exposición a largo plazo, incluyendo la transmisión de estos efectos a la descendencia (inestabilidad transgeneracional). En este contexto, el segundo objetivo de nuestro estudio consistió en establecer si la radiación induce inestabilidad genómica a largo plazo en humanos. Para ello, estudiamos dos familias en las que uno de los progenitores, paciente con cáncer de tiroides, había sido tratado con 131I, 17 y 7 años antes del estudio, respectivamente. Se establecieron líneas celulares linfoblastoides (LBCLs) de cada uno de los miembros de las familias y se realizaron los ensayos del cometa y de micronúcleos para estimar el daño genético en los cultivos celulares a lo largo de sucesivas divisiones celulares. Consideramos que este diseño experimental nos permitiría detectar el posible efecto genético a largo plazo, tanto en células somáticas (al comparar los padres entre sí y cada individuo a lo largo de las sucesivas divisiones), como en la línea germinal (comparando padres con hijos y hermanos concebidos antes y después del tratamiento). Sin embargo, en nuestras condiciones experimentales, no pudimos detectar que el tratamiento con 131I produjese una inestabilidad genómica que persita en las sucesivas generaciones celulares, ni su transmisión a la línea germinal; aunque no podemos descartar que nuestro estudio carezca de la sensibilidad necesaria para detectar este tipo de efectos, en especial si se trata de un efecto débil. / Thyroid cancer represents 98% of endocrine cancers and there are just a few studies about genetic susceptibility factors for this cancer. During the last years the role of genetic polimorphisms in individual susceptibility to cancer it's being studied with attention. In our study, he have genotyped by PCR two microsatellites, THRA1 and BAT-40, and six single nucleotide polymorphisms (SNPs) in a case-control population. The aim of the study was to establish a possible association between thyroid cancer susceptibility and two different genomic regions. On one hand, the gene NR1A1a (17q11.2), that codes the ?1 thyroid hormone receptor, and which includes THRA1 microsatellite. On the other hand, region p12-13 on chromosome 1, by studying the BAT-40 microsatellite and six SNPs. In both cases we analised the association between the different SNPs and thyroid cancer susceptibility, as well as the SNPs and environment interaction. Our results show that short THRA1 repeats (<18 CA) may have a protective effect regarding thyroid cancer susceptibility. This effect could be related to NR1A1a expression. Also, genotypes involving the BAT-40 repeat range A25-A29 show a protective effect, and genotypes involving less than 11 repeats could be associated with thyroid cancer susceptibility. Therefore, BAT-40 microsatellite could be a possible susceptibility genetic marker for this cancer.The additional analysis of six SNPs within 1p12-13 region shows that polymorphisms rs2145418 and rs4659873 have an statistically significant association with thyroid cancer susceptibility. Taking into account that rs2145418 marker is not located within any gene, we consider that an unidentified factor could be responsible of this association or maybe that it is a regulating region. In the same way, as rs4659873 is ubicated within intron 25 of WDR3 gene, possibly involved in gene regulationprocesses and cell cycle progression, we suggest the possible implication of this gene on thyroid cancer susceptibility.During the last years, the establishment of a radiation induced genomic instability has lead to an increase interest in knowing the long term effects of radiation exposure, including the transmission of these effects to the offspring (transgenerational instability). In this context, the second aim of our study consisted in establishing the possible long term radiation induced genomic instability on humans. We studied two families where one progenitor was a thyroid cancer patient, who received iodine-131 treatment, 17 and 7 years before the study, respectively. Lymphoblastoid cell lines (LBCLs) from each family member were established, and MN and comet assays were performed to detect genetic damage during the consecutive cell divisions. We assumed that with this experimental design we could detect the possible long-term genetic effects of radiation in the somatic cells (comparison between parents and along the different cell divisions) and in the germ line (parent/son comparison and comparison between siblings, conceived before and after the parent therapy). However, in our study, we couldn't detect that I-131 treatment induced a genomic instability maintained along the different cell divisions, nor its transmission to the germ line. Although we cannot discard our study lacks enough sensitivity to detect this sort of effects, specially if it is a weak effect.

El cáncer de tiroides es la patología oncológica más común en el estudio de la morbilidad endocrina. Se ha demostrado que la exposición a la radiación ionizante es un factor ambiental de riesgo al cáncer de tiroides. Asimismo, en la etiología de la enfermedad juegan un papel importante los factores genéticos. El objetivo principal de este trabajo es estudiar la susceptibilidad genética al cáncer de tiroides asociada a las regiones cromosómicas 1p12 y 8q. Siguiendo un diseño epidemiológico caso-control, de una población española de 881 individuos (402 pacientes con cáncer de tiroides y 479 controles sanos). La tecnología IPLEX se utilizó para el análisis de diez polimorfismos de la región 1p12 y siete polimorfismos de la región 8q. En la región 1p12 el análisis de haplotipos reveló que la combinación de ciertas variantes del gen WDR3, tal como el haplotipo CAT, aumenta el riesgo de cáncer de tiroides (OR= 1,85, IC 95% = 0,97-3, 55, P = 0,063). Además, tanto la transcripción del RNAm como la expresión de la proteína del gen WDR3 fueron alterados en células humanas de cáncer de tiroides. Por otra parte, En la región 8q los dos polimorfismos rs6983267 y rs1447295, y dos polimorfismos del gen TRHR no mostraron asociación con el cáncer de tiroides. Tampoco se encontró asociación para el polimorfismo del exón 33 del gen TG. Sin embargo, los dos polimorfismos del exón 10-12 del gen TG se asociaron con un mayor riesgo del cáncer de tiroides (OR = 1,80, IC 95% = 1,30-2,50, P <0,001). Nuestros resultados han involucrado por primera vez las regiones del genoma 1p12 y 8q en la susceptibilidad al cáncer de tiroides, sugiriendo su implicación en la etiología del cáncer de tiroides.

La Fibrosis quística (FQ) és la malaltia genètica recessiva letal més freqüent a la població caucàsica. Més de 1600 mutacions al gen CFTR han estat descrites com a responsables de FQ i/o han estat associades a altres malalties com l¿absència bilateral de conductes deferents, la pancreatitis crònica i les bronquiectàsies. El procés d’splicing està estrictament regulat per diferents seqüències genòmiques i factors de transcripció. Aquest fi engranatge és susceptible de veure’s afectat de forma absoluta o parcial per la presència de mutacions, donant lloc a un número variable de transcrits i, en conseqüència, a un ampli espectre fenotípic. Per determinar la rellevància clínica dels nivells d'expressió de CFTR, l’objectiu principal d’aquest treball ha estat l’estudi dels mecanismes moleculars subjacents en mutacions CFTR que afecten l’splicing, mitjançant el desenvolupament de tècniques complementàries per la seva caracterització a nivell de DNA, RNA i proteïna. Per dur a terme aquest objectiu s’ha emprat l’epiteli nasal, una mostra accessible, que ens ha permès, l’anàlisi d’expressió del gen i la localització de la proteïna CFTR. La seva caracterització genòmica ha estat fonamental per la identificació de mutacions i SNPs, i ha permès la formació acurada de grups d’estudi (individus controls, portadors i pacients). L’RT-qPCR ha estat una tècnica essencial i la normalització de dades n'és un pas imprescindible per determinar l'expressió. En aquest treball s'ha aplicat un procés acurat de selecció de gens de referència (geNorm, NormFinder, Kruskal-Wallis) i s’han validat els gens GUSB i PMCA4 com la millor combinació per l’estudi de l’expressió de CFTR. L’anàlisi in silico i qualitatiu de més de 30 mutacions missense, nonsense i d’splicing al gen CFTR ha permès la identificació de transcrits aberrants en les mutacions c.580-1G>T, c.2657+5G>A i c.3718-1G>A. La quantificació de transcrits per la mutació c.2657+5G>A ha portat a la identificació d’un nou al·lel complex amb el cSNP c.2562T>G (p.=). A nivell proteic, la manca de proteïna observada en les tres mutacions correlaciona amb els nivells de transcrits quantificats en cada una de elles, i ambdós ho fan amb el fenotip dels individus portadors de mutacions d’splicing. En conclusió, l’anàlisi quantitativa de transcrits ha mostrat una correlació amb el fenotip d’individus portadors de mutacions d’splicing, i en conseqüència pot ser útil com a paràmetre complementari per a l’avaluació de teràpies moleculars dirigides a la correcció d’splicings aberrants. / Cystic fibrosis (CF) is the most common recessive genetic disease in Caucasian population. Over 1,600 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene sequence variations have been identified in patients with cystic fibrosis (CF) and/or related disorders such as congenital bilateral absence of the vas deferens, chronic pancreatitis and bronchiectasis. The splicing process has been shown to be regulated in multiple ways. An interplay of cis-acting sequences and trans-acting factors modulates splicing by the interaction of many complexes, proteins, DNA domains, etc. This fine machinery is susceptible to be disrupted by mutations and single nucleotide polymorphism leading to a variable number of transcripts and therefore to a broad phenotypic spectrum. The purpose of this work has been to study the subjacent molecular mechanism of CFTR mutations that affect the efficiency of splicing as well as to develop complementary techniques for its characterization at DNA, RNA and protein level in epithelial cells; by doing so we aim to determine the clinical relevance of CFTR expression levels. In order to reach our goals we used nasal epithelium, an accessible sample that allowed us to study CFTR gene expression and CFTR protein localization. Mutations and single nucleotide polymorphism analysis was done in all individuals to accurately group them into controls, carriers and patients. Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was essential to determine the expression level of CFTR. As Normalization of qPCR data is a necessary step reference genes must be selected for each gene/tissue. Therefore, we applied an accurate approach to select reference genes for CFTR expression analysis (geNorm, NormFinder, Kruskal-Wallis). GUSB and ATP2B4 have been validated as the most reliable gene combination. An in silico analysis along with a qualitative assessment of more than 30 CFTR mutations (missense, nonsense and splicing) identified an aberrant transcript for three of the mutations analyzed, c.580-1G>T, c.2657+5G>A and c.3718-1G>A. Its quantification led to the identification of a novel complex allele c.2562T>G (p.=)-c.2675+5G>A. At the protein level, the lack of CFTR on the membrane for the three mutations analyzed correlated with both the transcript level observed and patient phenotypes. In conclusion, CFTR quantitative transcript analysis showed a clear correlation with the phenotype of individuals carrying a splicing mutation. Therefore, it could be a useful parameter for the evaluation of aberrant splicing-targeted therapies.

En estos últimos años, muchos nuevos materiales han sido involucrados en los campos de las nanotecnologías, y especialmente en nanomedicina. Las nanoparticulas formadas por proteínas son un ejemplo de bio-material que está atrayendo cada vez más la atención debido a sus características tanto biológicas como estructurales, como por ekjemplo su baja toxicidad, baja inmunogenicidad y su biodegradabilidad. Además, a través de la ingeniería genética, estas proteínas se pueden diseñar para que formen multímeros estructuras con la capacidad de auto-ensamblarse en una estructura similar a las capsides virales. Estas propiedades permiten el utilizo de estas nanoparticulas proteicas en el diseño de vectores para la entrega de fármacos o genes terapéuticos, el diseño de vacunas y kits de diagnósticos. La entrega de moléculas terapéuticas supones la superación de barreras tanto extracelulares como intracelulares. Gracias a la exposición de ligandos en la superficie externa y a su tamaño reducido, las nanopartículas pueden superar estas barreras como, por ejemplo, la Barrera Hematoencefalica (BBB). En este contexto, hemos desarrollado unas nanopartículas proteicas auto-ensamblables con especificidad para los receptores LDLR, con el propósito de utilizarlas como vehículos para el tratamiento de enfermedades en el Sistema Nervioso Central (SNC). Cuatro diferentes ligandos específicos para los LDLR se fusionaron a la proteína GFP -His; entre ellos, solamente el ligando ApoB fue capaz de promover la formación de nanopartículas proteicas por interacciones intermoleculares entre el mismo ApoB, la cola de histidinas y los monómeros vecinos. Estas nanoparticula han demostrado una buena internalización en líneas celulares LRDR+, en experimentos in vitro. Sin embargo, cuando se probó en un modelo in vivo, solamente dos proteínas ligandos que no forman nano-particulas se han detectado en puntos de tiempo post-administración cortos. Esto indicaría que la formación de nano-estructuras no favorece la acumulación en el SNC. Paralelamente, se estudiaron nano-partículas proteicas dirigidas hacia el receptor CXCR4, un receptor de superficie celular expuesto en la superficie celular de las células metástaticas de cáncer colorrectal. En este estudio la proteína T22-IRFP-HIS fue elegida para sustituir a la ApoB-GFP-HIS y también se observó la formación de nanoparticulas autoensamblables que además poseen una alta internalización en las células CXCR4+. Esto indica que la proteína andamio no afecta a la formación de nanopartículas, ni afecta a la especificidad del ligando de direccionamiento. La fuerza que guía a la formación de nanopartículas se basa principalmente en las interacciones electrostáticas entre monómeros de proteínas. Además este fenómeno puede ser interrumpido y revertido por la presencia de alta concentración de sal. De hecho, cuando las nanoparticulas de T22-IRFP-HIS se dializan a un tampón con alta concentración de sal, las estructuras se desensamblan en monómeros y además reducen su eficiencia de penetrabilidad celular. Esto demostraría que el tamaño y tal vez la multivalencia de la nanopartículas proteicas frente a la monovalencia de los monómeros es un factor clave para el reconocimiento celular especifico y la internalización de las proteínas. / With the development of nanotechnology and nanomedicine, more and more materials have been involved in these fields, protein based nanoparticles have become another biomaterial that is developing fast and attracts growing attention. They are non-toxic, low-antigenic, biodegradable, metabolizable, and with genetic engineering, it is easy to modify their structure, surface charge, to allow heterologous ligand display, to improve stability and more importantly, proteins can be designed to form multimeric structures with the ability to self-assemble in a similar way as viral capsid proteins do. These properties enable protein particles to be widely used in targeting and delivery of therapeutic drugs, vaccine designing, diagnosis, and gene therapy.Nanoparticle-mediated targeting delivery is also widely used when overcoming barriers in human body, especially in the BBB. Nanoparticles could help drugs to cross the BBB because they have suitable size and could exhibit targeting ligands on the surface. These ligands could interact with receptors at the BBB and then transport nanoparticles across BBB by receptor mediated transcytosis. Based on that, the first part of this context is aim to construct self-assembled protein nanoparticles targeting on LDLR (which is a high affinity binding site in brain capillaries), with the purpose of using nanostructured materials as vehicles for the systemic treatment of CNS diseases. Four different LDLR specific ligands were fused to GFP protein and His tag; among those, only ApoB ligand, was able to promote the formation of protein nanoparticles by intermolecular interactions involving the ApoB ligand and the His tag of a neighboring monomer. This ApoB empowered protein nanoparticle showed higher internalization ability on LDLR+ cells, and higher permeability in BBB in vitro model. However, when tested those proteins displaying LDLR ligands in an in vivo model, two proteins which were not able to form nanoparticle accumulated in at short post-administration time points, indicating that the nanoparticulate form is not favoring the accumulation apart from preventing the transient accumulation. This work brings up new concepts of BBB crossing properties by using functional protein nanoparticles. The second part of this context is aimed to produce size-controllable protein nanoparticles towards CXCR4 receptor (CXCR4, a cell surface receptor marker associated with metastasis-forming colorectal cancer cells and other human pathologies) expressing cells. In this part, a new scaffold protein iRFP was chosen to replace GFP, we determined that it could also self-assemble into nanoparticles, showing high penetration into CXCR4+ cells. This indicates that the o scaffold protein has neither affect on the formation of nanoparticles, nor on the ligand targeting ability. The force which drives nanoparticle formation mainly is based on electrostatic interactions between protein monomers, and this can be interrupted by the presence of high salt concentration. Moreover, when this T22 empowered nanoparticle is transferred to a high salt concentration buffer, protein naaparticles disassemble into monomers reducing its cell penetrability efficiency, proving again that size and perhaps the multivalency of the protein nanoparticle versus the monovalency of protein monomers is a key factor in receptor mediated cell targeting and penetration.