Durant el transcurs d’un rastreig a gran escala per RNA d’interferència (iARN) en Caenorhabditis elegans, el gen rsr-2 va ser identificat com a interactor genètic del gen lin-35 Retinoblastoma, l’homòleg de la família humana de Retinoblastoma. El gen rsr-2 és l’ortòleg de la proteina humana d’splicing SRm300/SRRM2. A diferència del seu ortòleg en llevat Cwc21, rsr-2 és essencial per la viabilitat. Degut a que la forta inactivació d’rsr-2 produeix uns fenotips molt severs, hem aprofitat l’efecte lleu que produeix l’ARN interferent a través de l’aliment per estudiar les funcions d’rsr-2 durant el desenvolupament. Els assatjos d’iARN d’rsr-2 juntament amb anàlisis d’epistàsia genètica situen rsr-2 en la via de la determinació sexual de la línia germinal. Tot i així, tiling arrays d’animals rsr-2(iARN) no han revelat defectes significatius en l’splicing. Gràcies a experiments d’immunofluorescència, hem observat que un anticòs específic per RSR-2 co-localitza amb cromatina en nuclis de cèl·lules de la línia germinal. Interessantment, experiments d’immunoprecipitació de cromatina i seqüenciació massiva (ChIP-Seq) han desvetllat que RSR-2 co-precipita cromatina seguint un patró similar al de l’ARN polimerassa II. Aquests experiments de ChIP-Seq també han fet palès que RSR-2 és reclutada a la cromatina d’un mode que és independent de l’splicing i suggereixen que RSR-2 podria desenvolupar un rol de regulador transcripcional. Addicionalment, hem explorat els transcriptomes d’animals rsr-2(iARN) i prp-8(iARN) en estadi de larva 3 (L3), fet que ens ha permès classificar rsr-2 com a un factor d’splicing no essencial. Conjuntament, el nostre estudi mostra que RSR-2 és una proteina multifuncional que regula el desenvolupament de Caenorhabditis elegans influenciant, i probablement acoblant, els processos d’splicing i transcripció. / During the course of a large scale interference RNA (RNAi) screen in Caenorhabditis elegans, rsr-2 was identified as a genetic interactor of lin-35 Rb, the homolog of human Retinoblastoma. The rsr-2 gene encodes the ortholog of the human spliceosomal protein SRm300/SRRM2. In contrast to its yeast ortholog Cwc21, rsr-2 is essential for viability. Since strong inactivation of rsr-2 produces severe phenotypes, we took advantage of the mild effect of RNAi by feeding to study functions of rsr-2 during development. rsr-2 RNAi assays and genetic epistasis analysis locate rsr-2 within the germ line sex determination pathway but tiling arrays of rsr-2(RNAi) animals do not disclose significant splicing defects. By inmunofluorescence, we observe that an antibody specific for RSR-2 co-localizes with chromatin in germ line nuclei. Interestingly, ChIP-Seq experiments reveal that RSR-2 co-precipitates chromatin in a pattern similar to that of RNA Polymerase II. These ChIP-Seq assays also evidenced a splicing-independent recruitment of RSR-2 to chromatin and suggest that RSR-2 could have a role in regulating transcription. Moreover, we have explored the transcriptomes of rsr-2(RNAi) and prp-8(RNAi) L3 worms by RNA-Seq, which classified rsr-2 as a non-essential splicing factor. Altogether, our study shows that RSR-2 is a multifunctional protein that regulates development by influencing, and probably coupling, splicing and transcription.

The main goal of this thesis was to help in the identification of genetic variants that are responsible for complex traits, combining both linear and nonlinear approaches. First, two one-locus approaches were proposed. The first one defined and characterized a novel nonlinear test of genetic association, based on the mutual information measure. This test takes into account the genetic structure of the population. It was applied to the GAW17 dataset and compared to the standard linear test of association. Since the solution of the GAW17 simulation model was known, this study served to characterize the performance of the proposed nonlinear methods in comparison to the linear one. The proposed nonlinear test was able to recover the results obtained with linear methods but also detected an additional SNP in a gene related with the phenotype. In addition, the performance of both tests in terms of their accuracy in classification (AUC) was similar. In contrast, the second approach was an exploratory study on the relationship between SNP variability among species and SNP association with disease, at different genetic regions. Two sets of SNPs were compared, one containing deleterious SNPs and the other defined by neutral SNPs. Both sets were stratified depending on the region where the polymorphisms were located, a feature that may have influenced their conservation across species. It was observed that, for most functional regions, SNPs associated to diseases tend to be significantly less variable across species than neutral SNPs. Second, a novel nonlinear methodology for multiloci genetic association was proposed with the goal of detecting association between combinations of SNPs and a phenotype. The proposed method was based on the mutual information of statistical significance, called MISS. This approach was compared with MLR, the standard linear method used for genetic association based on multiple linear regressions. Both were applied as a relevance criterion of a new multi-solution floating feature selection algorithm (MSSFFS), proposed in the context of multi-loci genetic association for complex diseases. Both were also compared with MECPM, an algorithm for searching predictive multi-loci interactions with a criterion of maximum entropy. The three methods were tested on the SNPs of the F7 gene, and the FVII levels in blood, with the data from the GAIT project. The proposed nonlinear method (MISS) improved the results of traditional genetic association methods, detecting new SNP-SNP interactions. Most of the obtained sets of SNPs were in concordance with the functional results found in the literature where the obtained SNPs have been described as functional elements correlated with the phenotype. Third, a linear methodological framework for the simultaneous study of several phenotypes was proposed. The methodology consisted in building new phenotypic variables, named metaphenotypes, that capture the joint activity of sets of phenotypes involved in a metabolic pathway. These new variables were used in further association tests with the aim of identifying genetic elements related with the underlying biological process as a whole. As a practical implementation, the methodology was applied to the GAIT project dataset with the aim of identifying genetic markers that could be related to the coagulation process as a whole and thus to thrombosis. Three mathematical models were used for the definition of metaphenotypes, corresponding to one PCA and two ICA models. Using this novel approach, already known associations were retrieved but also new candidates were proposed as regulatory genes with a global effect on the coagulation pathway as a whole.

La present tesi doctoral consta de 5 publicacions i un manuscrit en preparació que aprofundeixen en l'estudi dels mecanismes de lesió mitocondrial secundaris al contacte amb determinats agents tòxics pel mitocondri (mitotòxics) com el virus de la immunodeficiència humana (VIH), el tractament antiretroviral (TARV) administrat per tractar aquesta infecció, un antibiòtic anomenat linezolid, diferents tipus d'antipsicòtics i el monòxid de carboni (CO). Tots aquests estudis s'han realitzat sempre ex-vivo emprant mostres humanes.Molts agents mitotòxics poden induir una lesió mitocondrial similar a la característica de les malalties mitocondrials primàries (innates i genètiques) amb les que sovint comparteixen simptomatologia clínica. Si bé les mitocondriopaties primàries no són massa freqüents, gran part de la població està exposada a molts d'aquests agents mitotòxics, molts dels quals són fàrmacs habitualment emprats en la pràctica clínica.Els tres primers treballs tracten sobre la toxicitat mitocondrial del VIH i el TARV i pretenen establir mètodes menys invasius per determinar l'abast de la lesió mitocondrial i la reversibilitat de la mateixa. A través de l'estudi de la funció mitocondrial en teixit muscular, el primer dels treballs valida l'ús de cèl·lules mononuclears de sang perifèrica com a model d'estudi de la funció mitocondrial en pacients VIH-positius que sota TARV desenvolupen una crisis d'hiperlactatèmia. Per això la resta de treballs s'han realitzat en cèl·lules mononuclears. Aquest estudi també valida l'aplicació d'un test d'esforç aeròbic de l'avantbraç, inicialment dissenyat per detectar disfunció mitocondrial primària (genètica), en el seguiment i diagnòstic de la disfunció mitocondrial secundària (tòxica) d'aquest tipus de pacients. Mitjançant tots aquests tests es determina que la funció mitocondrial en aquests individus es recupera un cop superat l'episodi d'hiperlactatèmia.El segon dels treballs determina la reversibilitat de la lesió mitocondrial induïda per un TARV de contrastada potència mitotòxica com són els dideoxinucleòsids quan són substituïts per un tractament teòricament menys lesiu pel mitocondri consistent en saquinavir potenciat amb ritonavir, tenofovir i enfuvirtide. Transcorreguts 6 mesos el canvi de TARV només aconsegueix una recuperació mitocondrial parcial amb una millora de la funció però no de la genètica (contingut en ADN mitocondrial o ADNmt) d'aquest orgànul.El tercer dels treballs avalua com la reducció de la dosi d'un dels components del TARV pot reduir la toxicitat mitocondrial d'aquesta teràpia. Concretament es valora la reducció de dosi de didanosina de 400 a 250 mg/d quan s'administra conjuntament amb tenofovir i nevirapina. Un any de tractament a elevades dosis d'aquest fàrmac disminueix el contingut en ADNmt i la funció mitocondrial en aquests pacients i l'administració consecutiva durant un altre any de la dosi reduïda de l'antiretroviral només permet una recuperació mitocondrial parcial que possibilita que es restableixi el contingut en ADNmt però no la funció d'aquest orgànul.El quart dels treballs avalua la toxicitat mitocondrial de l'antibiòtic linezolid en pacients que desenvolupen hiperlactatèmia associada al tractament prolongat amb aquest fàrmac. Estableix que el linezolid inhibeix la síntesi de proteïnes mitocondrials amb la conseqüent disminució de l'activitat enzimàtica de la cadena respiratòria d'aquest orgànul, malgrat l'augment en la taxa de transcripció mitocondrial (probablement en un intent infructuós d'augmentar la síntesi proteica bloquejada pel linezolid), i que aquesta podria ser la etiologia de la hiperlactatèmia associada a l'administració d'aquest antibiòtic. Totes aquestes alteracions són reversibles en retirar el fàrmac.El cinquè dels treballs estudia la toxicitat mitocondrial dels antipsicòtics, caracteritzada per la inhibició de la funció de la cadena respiratòria mitocondrial a nivell del complex I, i en el cas de l'haloperidol, a més a més, per l'augment de l'estrès oxidatiu. La capacitat mitotòxica dels antipsicòtics és proporcional al grau de manifestacions adverses de tipus extrapiramidal associades per a cadascun dels fàrmacs considerats (haloperidol > risperidona > clozapina), i podria ser doncs part de la base fisiopatològica responsable de l'aparició dels efectes secundaris. El sisè dels treballs (l'únic que no està publicat) empra l'estudi de la funció mitocondrial per avaluar les diferents opcions terapèutiques disponibles per tractar la intoxicació aguda per CO. El CO inhibeix la funció del complex IV de la cadena respiratòria independentment de la gravetat de la intoxicació, sense que augmenti el nivell d'estrès oxidatiu. En els intoxicats la funció mitocondrial es recupera al llarg del temps, de manera independent al tractament d'oxigen aplicat. Per tant, la recuperació de la funció mitocondrial només requereix una sessió d'oxigen hiperbàric per als intoxicats greus i l'oxigen normobàric per als lleus. Caldrà cerciorar aquests resultats un cop finalitzada la inclusió de pacients. / This thesis is composed by 5 articles and one manuscript on preparation which analyse the mechanisms of mitochondrial lesion induced by some mitochondrial toxic (mitotoxic) agents such as the human immunodeficiency virus (HIV), the antiretroviral treatment (ARVT) used to treat HIV infection, an antibiotic named linezolid, different antipsychotics and carbon monoxide (CO). All these studies have been performed on humans samples that have been analysed ex-vivo.Many mitotoxic agents induce mitochondrial lesion and clinical symptoms common to primary (hereditary or genetic) mitochondriopathies. Primary mitochondrial disorders are not much frequent on general population, but many people is exposed to mitotoxic agents, many of them, because are routinely drugs in clinical practice.The first three studies of the present thesis analyse mitochondrial toxicity of both HIV and ARVT to establish less invasive methods to study mitochondrial dysfunction and the reversibility of HIV and ARVT-induced mitochondrial damage. They have validated the use of peripheral blood mononuclear cells and the forearm aerobic effort test to study mitochondrial lesion in HIV-infected and ARV-treated patients. These studies have determined that mitochondrial lesion reverts after an hyperlactatemic episode and partially recovers after changing potent mitotoxic ARVT (dideoxynucleosides) by theoretically less mitotoxic drugs (saquinavir/ritonavir+tenofovir+enfuvirtide) or after reducing ARV doses (didanosine from 400 to 250 mg/d+tenofovir+nevirapine).The forth study analyses mitochondrial toxicity of linezolid in patients suffering from hyperlactatemia. It demonstrates that linezolid inhibits mitochondrial protein synthesis and respiratory chain function, albeit increased mitochondrial transcription rates (maybe as an homeostatic intent to upregulate linezolid inhibited translation), and that all these mitochondrial abnormalities revert with linezolid withdrawal.The fifth study analyses mitochondrial toxicity of antipsychotics, which inhibit mitochondrial complex I function, and in case of haloperidol, indeed, increases oxidative stress. Antipsychotic mitochondrial lesion is proportional to their capacity to induce extrapiramidal disorders (haloperidol > risperidona > clozapina). Maybe mitochondrial lesion could be partially responsible of clinical adverse manifestations.The sixth study (unique work not published) use mitochondrial function monitorisation to evaluate different therapeutic options to treat acute CO intoxication. CO binds to mitochondrial complex IV inhibiting its function, independent to intoxication severity, without increasing oxidative stress. In CO poisoning mitochondrial function is recovered along the time independent to oxygen treatment option. Thus, recover of mitochondrial function after CO intoxication only requires of one hyperbaric oxygen session for severe poisoned patients and normobaric oxygen for the moderate ones, although these results have to be validated with a bigger amount of patients.

In this thesis we developed two approaches to study positive selection and genetic adaptation in the human genome. Both approaches are based on applications of network theory. In the first approach, we studied how the signals of selection are distributed among the genes of a metabolic pathway. We use a network representation of the Asparagine N-Glycosylation pathway, and determine if given positions are more likely to be involved in selection events. We determined a different distribution of signals between the upstream part of this pathway, which has a linear structure and is involved in a conserved process, and the downstream part of the pathway, which has a complex network structure and is involved in adaptation to the environment. In the second approach, we applied a network representation of the set of genotypes observed in a population (Genotype Network) to next-generation sequencing data. The main result is a genome-wide picture of how the populations of the 1000 Genomes dataset have explored the genotype space. We found that the genotype networks of coding regions tend to be more connected and more expanded in the space than non coding regions, and that simulated sweeps have similar patterns compared to simulated neutral regions. / En esta tesis hemos desarrollado dos métodos para estudiar los patrones de selección positiva y adaptación genética en el genoma humano. Ambos métodos se basan en aplicaciones de teoría de redes. En la primera aplicación hemos investigado cómo las señales de selección están distribuidas a lo largo de una ruta metabólica. Hemos utilizado una representación de la ruta de N-Glicosilación, para estudiar si determinadas posiciones tienen más probabilidades de estar implicadas en eventos de selección positiva. Hemos comparado la distribución de las señales de selección entre la primera parte de la ruta metabólica, que tiene una estructura muy lineal y está involucrada en un proceso conservado, y la segunda parte de la ruta, que tiene una estructura de redes compleja y está involucrada en adaptación al ambiente. En la segunda aplicación hemos aplicado el concepto de redes de genotipos (Genotype Networks) a datos de secuencia de nueva generación. El resultado es un análisis completo de cómo las poblaciones de 1000 Genomas han explorado el espacio de genotipo. Las redes de genotipos de regiones codificantes suelen estar más conectadas y más expandidas que las regiones no-codificantes. Además, por medio de simulaciones hemos observado los patrones esperados para eventos de selección positiva.

El Diagnòstic Genètic Preimplantacional (PGD) utilitzant la hibridació in situ fluorescent (FISH) per identificar embrions cromosòmicament anòmals analitzant nou cromosomes ha permès incrementar les taxes d'embaràs en certs grups de pacients. Malgrat això, aquesta estratègia presenta certes limitacions, sent la més important el nombre de cromosomes que poden ser analitzats. En aquest treball hem avaluat la fiabilitat de la hibridació genòmica comparada (CGH) per a analitzar el complement cromosòmic sencer, com una alternativa al PGD utilitzant FISH. La CGH proporciona un anàlisi més complert del cariotip i per tant, permetria la transferència de només embrions cromosòmicament normals, que són els més idonis per produir un embaràs viable. La validació de la CGH s'ha realitzat avaluant la complementarietat entre els resultats obtinguts en els primers corpuscles polars (1CP) i els obtinguts en l'oòcit en metafase II (MII). S'han analitzat un total de 106 oòcits donats per 71 dones. En 81 casos s'ha analitzat tant la MII com el 1CP, mentre que en 25 casos s'ha analitzat tan sols un dels membres de la parella. L'eficiència de la CGH ha estat del 80,1% i la taxa de complementarietat del 87,4%. En alguns casos s'ha detectat una manca de complementarietat entre el 1CP i la corresponent MII, explicable per la existència d'un mosaïcisme gonadal en alguna d'aquestes pacients.La incidència d'aneuploïdies ha estat del 45,3%. S'han trobat un total de 80 aneuploïdies, afectant a gairebé tots els cromosomes tot i que en general, els cromosomes petits, tendeixen a mostrar-ne més.Pràcticament el 50% d'aquestes aneuploïdies corresponen a cromosomes que no són analitzats amb l'estratègia de FISH de nou cromosomes degut a que aquests cromosomes no són els responsables de descendència trisòmica viable o de la majoria d'avortaments espontanis. No obstant, les nostres dades indiquen que els errors per aquests cromosomes si deuen ser freqüents en el moment de la concepció però fallen en implantar causant una davallada en les taxes de implantació. Aproximadament un 37% de les parelles 1CP-MII aneuploides mostren errors de cromosomes no inclosos en el cribatge d'aneuploïdies que es realitza en l'actualitat i per tant haurien estat incorrectament diagnosticades com a normals en un PGD emprant FISH per a l'anàlisi de nou cromosomes.S'ha trobat una major proporció d'anomalies en el grup d'oòcits de dones d'edat avançada (60,7%), comparant amb el grup d'oòcits de dones sota els 35 anys (28%). Aquestes diferencies han estat estadísticament significatives. Per una altra banda, les tècniques de FISH i cenM-FISH s'han utilitzat també en aquest treball per a diferenciar les alteracions de cromosoma de les de cromàtida, ja que això no sempre és possible utilitzant CGH. Aquestes dues tècniques han indicat l'existència de dos mecanismes d'aneuploïdia, la separació precoç de cromàtides germanes (PSSC) (68,1%), i la no-disjunció de cromosomes homòlegs (31,9%). La fiabilitat de la CGH no només per a detectar canvis en el nombre de còpies de qualsevol cromosoma en 1CP i oòcits en metafase II, sinó també per a detectar segregacions desequilibrades de translocacions maternes ha estat demostrada. Això fa que la CGH pugui ser utilitzada en PGD de translocacions, per analitzar tan els cromosomes involucrats com els cromosomes no involucrats en la reorganització. Finalment, la CGH s'ha aplicat per a l'estudi de 1CPs en un PGD d'una dona d'edat materna avançada. Aquest protocol és compatible amb una transferència embrionària a dia +4, sense necessitat de congelar els embrions. En conclusió, els nostres resultant indiquen que l'estratègia ideal en un PGD hauria de comportar l'anàlisi de la totalitat de cromosomes ja que algunes aneuploïdies no incloses en l'anàlisi amb FISH poden ser, en realitat, freqüents en el moment de la concepció. / Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) using fluorescent in situ hybridization (FISH) to analyze up to nine chromosomes to identify chromosomally abnormal embryos has resulted in an increase of pregnancy rates in certain groups of patients. However, PGD using FISH has several limitations; the most important one is the number of chromosomes that can be analyzed. In this work we evaluate the reliability of using comparative genomic hybridization (CGH) to analyze the whole set of chromosomes, as an alternative to PGD using FISH. The more extensive analysis of the karyotype provided by CGH may allow replacement of only chromosomally normal embryos, which are those most likely to establish a successful pregnancy. The validation of the CGH was performed by the analysis of both, first polar bodies (1PB) and metaphase II oocytes (MII). A total of 106 oocytes donated by 71 women were analyzed. These oocytes correspond to 81 1PB-MII doublets and 25 cells without its partner. The CGH efficiency was 80.1% and the reciprocity rate between the 1PBs and the MIIs was 87.4%. In some cases we detected a lack of reciprocity between the 1PB and the MII results, which can be explained, in part, by the existence of a gonadal mosaicism in some of these patients.The aneuploidy rate was 45.3%. A total of 80 aneuploid events were found. In general, smaller chromosomes were more prone to aneuploidy although almost all chromosomes showed abnormalities. It is worth emphasizing that almost 50% of these aneuploidies correspond to chromosomes that are not analyzed with the nine-chromosome FISH approach for not being commonly involved in trisomic offspring or spontaneous abortions. Nevertheless, errors affecting these chromosomes may be common at conception but fail to implant, causing a decrease in the implantation rate. To date, 37.5% of the aneuploid doublets had aneuploidies affecting chromosomes not included in the current panels for aneuploidy screening. Consequently, they would have been misdiagnosed as normal in a PGD using FISH for 9 chromosomes. We have found a higher proportion of abnormalities in the group of older women (60.7%) compared to the group of women below 35 years old (28%). These differences are statistically significant. On the other hand, FISH and cenM-FISH analysis enable the distinction between chromosome and chromatid anomalies, which is not always possible using CGH. Using these two techniques, we have detected unequivocally two mechanisms of aneuploidy, revealing that as much as two thirds of the aneuploidy events (68.1%) were due to a premature separation of sister chromatids (PSSC), while only one third (31.9 %) were due to chromosome non-disjunction.Additionally, we have demonstrated the reliability of CGH not only to detect single copy number changes involving whole chromosomes in 1PB and MII oocytes, but also to detect unbalanced segregations of maternal translocations. This indicates that CGH could be used for PGD of maternal translocations, detecting also the presence of chromosome abnormalities involving other chromosomes different from those implicated in the rearrangement. Finally, we have applied the CGH to analyze 1PBs within a PGD of an advanced maternal age woman. This protocol was compatible with embryo replacement on day +4, without embryo freezing. In conclusion, our results strength the arguments for the complete karyotyping as an ideal PGD strategy, since aneuploidies affecting chromosomes that are not included in FISH analysis may be common at conception.

Durant la profase I meiòtica els cromosomes homòlegs s'uneixen mitjançant sinapsi formant els bivalents i intercanvien material genètic per recombinació homòloga. Al llarg de l'eix de sinapsi s'estructura el complex sinaptinemal (CS). Anomalies de la sinapsi i de la recombinació meiòtica s'han considerat com dos possibles causes de bloqueig total o parcial de la meiosi. L'objectiu general d'aquet treball és estudiar la incidència d'anomalies sinàptiques i de recombinació en individus controls i infèrtils per a caracteritzar diferents graus d'anomalies en aquests processos en la infertilitat idiopàtica.S'han processat biòpsies testiculars de set individus control i de tretze infèrtils. La detecció immunofluorescent de proteïnes de CS (SCP1 i SCP3) i de llocs de recombinació (MLH1) s'ha utilitzat por primera vegada en combinació amb un mètode de hibridació in situ fluorescent amb múltiples sondes subtelomèriques específiques (stM-FISH), que permet la identificació de tots els SCs d'una cèl·lula a paquitè.Les regions d'heterocromatina no centromèrica, 9qh, 1qh, 16qh i braços curts dels cromosomes acrocèntrics, han presentat una major incidència d'anomalies sinàptiques, indicant que són les últimes regions del genoma en fer sinapsi. La incidència d'anomalies sinàptiques en aquestes zones varia entre individus, fet explicable per polimorfismes d'aquestes regions en la població general. Anomalies sinàptiques en altres zones, aquelles que afecten a varis CSs en un mateix nucli o aquelles presents en estadi de paquitè tardà podrien indicar una afectació severa de la sinapsis. Els CSs dels cromosomes 15 i 21 s'associen més freqüentment al parell de cromosomes sexuals possiblement degut a l'homologia existent entre les regions heterocromàtiques d'aquests cromosomes i la del cromosoma Y.L'anàlisi de la recombinació meiòtica ha mostrat que la recombinació homòloga en el parell XY pot ser un indicador de la freqüència general de recombinació i de la progressió de la meiosi. Els resultats confirmen que una menor freqüència de recombinació pot augmentar el risc d'univalents a metafase I i que les diferències entre individus en aquesta freqüència podrien explicar la variabilitat en la freqüència d'aneuploïdies en espermatozoides humans. Els resultats de distribució de punts de MLH1 en cada CS i de les distancies entre aquests punts ens ha permès proposar un model de com es distribueixen aquests punts al llarg del CS.L'anàlisi de la longitud del CS ha mostrat que cada un dels braços del CS, de manera independent a l'altre, pot variar la seva longitud relativa en comparació a la longitud relativa dels cromosomes mitòtics. En el treball s'evidencia que aquesta variació de la longitud relativa pot reflectir la quantitat de fibres compactes i no compactes de cromatina presents a la zona.Finalment, la observació d'una cèl·lula tetraploide en estadi de paquitè, possiblement originada per endoreduplicació, demostra que la sinapsi i la recombinació meiòtica poden tenir lloc en aquestes cèl·lules en humans. A més a més, permet suposar que aquestes cèl·lules són un altre possible origen de espermatozoides diploides.Durant el transcurs d'aquest estudi s'ha caracteritzat citogenèticament un isocromosoma dicèntric Yq(p11.32) en mosaic en un individuo azoospermic, mitjançant FISH amb sondes específiques pel cromosoma Y. / During meiotic prophase I, homologous chromosomes are joined forming bivalents and they exchange genetic material by the processes of synapsis and crossing over. The synaptonemal complex (SC) appears along the synapsis axis. Synapsis and crossover anomalies have been considered as two possible causes of partial or total meiotic arrest. The general aim of this study is to analyse the incidence of synaptic and crossover anomalies in controls and infertile men in order to characterise different degrees of anomaly in these processes in idiopathic infertility.Testicular biopsies from seven controls and thirteen infertile men have been processed. Immunolabelling of SC proteins (SCP1and SCP3) and of DNA mismatch repair proteins present in crossover foci (MLH1) has been applied, for the first time, in combination with the seven-fluorochrome subtelomere-specific multiplex FISH assay (stM-FISH) in order to analyse synapsis and crossovers individually in each SC of a nucleus at pachytene.SCs regions with non-centromeric heterochromatin, 9qh, 1qh, 16qh and short arms of acrocentric chromosomes, have presented the highest incidence of gaps and splits, indicating that these are the last regions in the genome to synapse. Interindividual variability in the incidence of synaptic anomalies in these regions may be explained by polymorphisms of these regions in the general population. Synaptic anomalies in other SC regions, those affecting several SCs or present in late pachytene nuclei may indicate nuclei with a severely affected synapsis. Autosomal SC15 and SC21 associate with the XY pair more frequently than other SCs, possibly due to the homology between non-centromeric heterochromatins in the short arm of chromosomes 15 and 21 and in the q arm of chromosome Y.The analysis of crossovers shows that the amount of XY pairs with a crossover could be an indicator for general crossover frequency and for a successful meiotic process. Results confirm that reduction in the crossover frequency may increase the risk of achiasmatic small bivalents, and that interindividual differences in crossover frequency could explain the variability in the frequencies of aneuploidy in human sperm. How MLH1 foci are positioned within the SC is discussed based on detailed MLH1 foci distributions and interfoci distances.SC length analysis has shown that SC arms can be longer or shorter than the corresponding mitotic ones. Moreover, for a given SC, the variation in length found in one arm was independent of the variation observed in the other one. Evidence that the variation of the SC arm length may reflect the abundance of open and of compact chromatin fibres in the arm is shown.The finding of a tetraploid pachytene, possibly originated by endoreduplication, demonstrates that synapsis and crossover events can occur in these cells in humans. Moreover, it indicates that diploid sperm may also originate from tetraploid meiotic cells.During this study, a dicentric Yq(p11.32) isochromosome has been cytogenetically characterised in an azoospermic male by FISH using specific probes for chromosome Y.

L'anàlisi citogenètica del 1er corpuscle polar (1CP) permet una caracterització indirecta de l'oòcit en metafase II (MII) sense comprometre la seva capacitat reproductiva. Això permet, dins un programa de fecundació in vitro (FIV), desenvolupar una variant del diagnòstic genètic preimplantacional en la que s'analitza el 1CP (DGP-1CP).L'objectiu general d'aquest treball és estudiar la incidència d'aneuploïdia en la línia germinal femenina i en els primers estadis del desenvolupament embrionari.S'han utilitzat oòcits descartats de cicles de FIV per a desenvolupar una metodologia de hibridació in situ fluorescent (FISH) que permet detectar nou cromosomes en 1CPs i en MII. Fins ara, les absències de cromosomes o cromàtides en 1CP es consideraven artefactes però la valoració de la complementarietat 1CP- MII realitzada constata que només ho són una minoria (25,8%). Tant la freqüència d'aneuploïdia obtinguda per als nou cromosomes estudiats (47,5%) com el risc estimat d'aneuploïdia per els 23 cromosomes (57,2%) són molt elevats. El risc estimat de segregació anòmala per cromosoma analitzat és del 0,89%.S'han identificat diferents mecanismes de generació d'aneuploïdies en l'oòcit: separació precoç de cromàtides germanes (observada amb més freqüència al 1CP que a la MII) i no-disjunció de cromosomes homòlegs en la meiosi i segregació anòmala en la mitosi de l'etapa proliferativa de la línia germinal (mosaïcisme gonadal). Aquest fenomen s'ha detectat en un 25,7% de les pacients analitzades i fa recomanable el diagnòstic prenatal a les pacients que quedin gestants després d'un DGP-1CP.Aplicant DGP-1CP a dones amb cariotip normal (dones d'edat avançada), la incidència d'aneuploïdia per als nou cromosomes ha estat del 60,4%, corroborant a aquest grup com a grup de risc per la presència d'aneuploïdies. Aplicant-lo a dues pacients portadores de translocacions robertsonianes s'ha trobat una taxa d'aneuploïdia molt alta per als cromosomes no implicats en la translocació (91,7% i 72,7%), independentment de les alteracions observades per als cromosomes de la translocació. L'anàlisi d'aneuploïdies en blastòmers de pacients portadors i portadores de translocacions recíproques mostra un alt índex d'aneuploïdies de cromosomes no implicats en la translocació (60,3%) i també un alt percentatge de mosaïcisme (58,7%), tenint en compte tant els cromosomes implicats com els no implicats en la translocació. S'han trobat embrions normals o equilibrats per la translocació però aneuploides per altres cromosomes.Sembla necessari l'estudi seqüencial de la segregació dels cromosomes implicats en la translocació i de les aneuploïdies per altres cromosomes, en pacients portadors de translocacions.Per a validar la interpretació del resultat de la FISH en l'anàlisi d'aneuploïdia en cèl·lules proliferants, s'han estudiat cèl·lules en estadi de G0 (cèl·lules de Sertoli) i cèl·lules proliferants (limfòcits). En aplicar FISH en cèl·lules en proliferació s'estima que el 10,8% de dobles marques en excés trobades, en comparació amb les trobades en cèl·lules no proliferants, no són senyals partits, sinó deguts al procés de replicació. L'aplicació de FISH en cèl·lules en proliferació, com són els blastòmers, pot dificultar la interpretació dels resultats de FISH. Caldria incloure marcadors de l'inici o el final de la replicació per tal de ser usats simultàniament amb les sondes diagnòstiques de FISH en realitzar un DGP en blastòmers.El DGP per a la detecció d'aneuploïdies és un procediment més del que es disposa per tal d'oferir als pacients amb risc tot i que s'ha de valorar, en cada cas, si la seva aplicació pot ser beneficiosa. / Cytogenetic analysis of the 1st polar body (1PB) allows an indirect characterisation of the oocyte in the metaphase II stage (MII) without compromising its reproductive capability. This allows, in an in vitro fertilisation treatment (IVF), the development of a variant of preimplantation genetic diagnosis in which the 1PB is analysed (PGD-1PB).The aim of this study is to analyse the aneuploidy rate in the female germ-cell line and in its first embryo development stages.We have used oocytes discarded from IVF cycles to develop a fluorescent in situ hybridisation (FISH) method that allows for the detection of nine chromosomes in 1PBs and in MII. Until now, missing chromosomes or chromatids in the 1PB have been considered as artefacts but the evaluation of the 1PB-MII complement could proves that they are only a minority (25.8%). Both the aneuploidy rate found for the nine chromosomes analysed (47.5%) and the estimated risk of aneuploidy for the 23 chromosomes (57.2%) are very high. The abnormal segregation percentage per analysed chromosome is 0.89%.Different mechanisms for the generation of aneuploidies have been identified: predivision of sister chromatids (more frequently observed in 1PB than in MII) and non-disjunction of homologous chromosomes in meiosis I and altered segregation in mitosis during the proliferative stage in the germ-cell line (gonadal mosaicism). This phenomenon has been found in 25.7% of the analysed patients and makes the application of prenatal diagnosis in patients which become pregnant after a PGD-1PB advisable.When applying PGD-1PB in females with a normal karyotype (advanced maternal age), the aneuploidy rate for the nine chromosomes is 60.4%, corroborating this group as a risk group for the presence of aneuploidies. Applying it to two female carriers of Robertsonian translocations, a high aneuploidy rate for the chromosomes not implicated in the translocation has been found (91.7% and 72.7%), independently of the alterations observed in the chromosomes of the translocation.The analysis of aneuploidies in blastomeres of male and female reciprocal translocation carriers shows a high aneuploidy rate for the chromosomes not involved in translocations (60.3%) and also a high percentage of mosaicism (58.7%), including both the chromosomes implicated and not implicated in the translocation. Normal and balanced embryos for the translocation, but with aneuploidies for other chromosomes, have been found.In translocation carriers, the sequential analysis of the segregation of the chromosomes involved in the translocation and the aneuploidy screening for other chromosomes seems necessary, In order to validate the interpretation of FISH results in the aneuploidy screening of proliferating cells, G0 stage cells (Sertoli cells) and proliferating cells (lymphocytes) have been studied. When applying FISH in proliferating cells, 10.8% extra double-dots found, in comparison with the ones found in non-proliferating cells, are not splits but are due to the replicating process. The use of FISH in proliferating cells as blastomeres could make the interpretation of FISH results difficult. It would be necessary to include markers of the beginning or the end of replication to be simultaneously used with other FISH probes in PGD-analysed blastomeres.PGD for aneuploidy screening is another procedure which is available to be offered to patients at risk although it has to be evaluated, case by case, to determine if its application can be beneficial.

El primer corpúsculo polar (1CP) es una célula que acompaña al ovocito maduro (MII) y se produce como consecuencia de la primera división meiótica en la gametogénesis femenina. Ambas células tienen dotaciones cromosómicas complementarias y por ese motivo el 1CP puede informar indirectamente de la dotación cromosómica del correspondiente ovocito, sin que este pierda su capacidad reproductiva. Este hecho permite que en el marco de un programa de fecundación in vitro (FIV) se puedan biopsiar los 1CP y diagnosticar indirectamente los ovocitos, evitando la transferencia de embriones procedentes de ovocitos afectos de la anomalía genética o cromosómica estudiada. Este procedimiento se conoce con el nombre de diagnóstico genético preimplantacional mediante análisis de 1CP (DGP-1CP) y permite detectar alteraciones genéticas o anomalías cromosómicas de origen materno, en concreto de primera división meiótica.El objetivo general de este trabajo ha sido poner a punto un método de DGP-1CP mediante la técnica de análisis citogenético molecular conocida con el nombre de hibridación in situ fluorescente (FISH). Nos hemos centrado en la aplicación clínica del DGP-1CP en mujeres portadoras de translocaciones robertsonianas y mujeres portadoras de translocaciones recíprocas.La metodología de obtención de extensiones cromosómicas de 1CP para realizar el análisis citogenético, se ha puesto a punto en un modelo animal (hámster, Mesocricetus auratus) y se ha adecuado a ovocitos humanos descartados de ciclos de FIV antes o después de su inseminación. Los Comités Éticos de la Universidad Autónoma de Barcelona (UAB) y del Centro de FIV correspondiente han aprobado el protocolo a seguir para realizar el presente estudio y los ovocitos han sido donados por pacientes cuando estaban llevando a cabo su ciclo de FIV.Se han elaborado dos series de parejas 1CP-MII procedentes de ovocitos humanos no inseminados y descartados post inseminación, y se ha demostrado que las dotaciones cromosómicas son complementarias. La tasa de aneuploidia ha sido nula para ovocitos no inseminados y de un 5,1 % en ovocitos descartados por no mostrar signos de fecundación. La concordancia en parejas 1CP-MII en ovocitos no inseminados ha sido del 100 % y del 95,1 % en ovocitos descartados post inseminación. También se han estudiado citogeneticamente, ovocitos inmaduros y cigotos humanos anómalos, descartados de ciclos de FIV después de su inseminación y donados por las pacientes. Tras el análisis citogenético mediante FISH, se ha demostrado que un 25,4 % de los complementos cromosómicos correspondientes a ovocitos inmaduros son euploides en estadio de metafase I y el resto son aneuploides. Se ha observado una mayor incidencia de aneuploidia en ovocitos inmaduros descartados post inseminación (88,2 %) que en ovocitos inmaduros no inseminados (47,1 %). En cuanto a los cigotos anómalos descartados de ciclos de FIV con inseminación convencional por tener más de dos pronúcleos, en todos ellos la ploidía correspondía al número de núcleos observado. Por el contrario los cigotos con un único pronúcleo pueden ser diploides (88,9 %) o haploides (11,1 %).Aplicando el DGP-1CP a cinco mujeres portadoras de translocaciones robertsonianas y a cuatro mujeres portadoras de translocaciones recíprocas, y haciendo una revisión de los casos publicados hasta el momento, se ha hecho evidente que en mujeres portadoras de translocaciones robertsonianas la frecuencia de ovocitos cromosómicamente normales o equilibrados para la anomalía estudiada es del 60 % y en mujeres portadoras de translocaciones recíprocas es del 40 %. Se ha evidenciado una correlación estadísticamente positiva entre la frecuencia teórica de puntos calientes de recombinación y la incidencia observada de no disyunción de cromosomas homólogos en mujeres portadoras de translocaciones recíprocas con mínimo nuevo ovocitos diagnosticados. / In females, the particular characteristics of the gametogenesis allow the indirect characterization of the chromosome constitution of the gamete through the study of the first polar body (1PB) and these presents an opportunity for germ line analysis. The 1PB contents a chromosome set complementary to that of the oocyte. Thus, the 1PB can be analysed to obtain information on the chromosomal constitution of the corresponding oocyte, which is maintained in culture.Preimplantation genetic diagnosis (PGD) using the first polar body is a modality of PGD that can be used when the woman is the carrier of a genetic disease or of a balanced chromosomal reorganization.Here, we describe a procedure to obtain 1PB chromosome complements and our experience based on the analysis by fluorescent in situ hybridization (FISH) of unfertilized or fresh human oocytes and non-inseminated control human oocytes, by fixing separately the 1PB and the corresponding oocyte, and on the study of nine clinical cases of PGD using 1PB biopsy (five Robertsonian translocations and four reciprocal translocations).The method was developed in an animal model (Syrian hamster). Human samples were donated by patients undergoing in-vitro fertilization (IVF) cycles. The Informed Consent Form and the protocol for the study were approved by the Ethics Committees of the Universitat Autònoma de Barcelona (UAB) and the IVF Centre.In fresh oocytes, the chromosome morphology of the 1PB was well preserved, and the results were always concordant for each 1PB-oocyte pair. This indicates that the 1PB can be reliably used for the diagnosis of chromosome reorganizations. The frequency of aneuploidy was zero in fresh oocytes and 5.1 % in unfertilized oocytes.Moreover, we describe the study of immature oocytes and abnormal zygotes from IVF cycles. We observed that 25.4 % of the chromosome complements from immature oocytes, were euploid in metaphase I, and the rest of complements were aneuploid. We observed more aneuploidy in immature oocytes discarded post insemination (88.2 %) than in immature oocytes non-inseminated (47.1 %). The ploidy of all zygotes with more than two pronuclei was concordant with the number of nuclei observed. Nevertheless, the zygotes with only one pronucleus were 88.9 % diploids and 11.1 % haploids.Applying PGD-1PB to five female carriers of Robertsonian translocations and four carriers of reciprocal translocations, and reviewing the cases published, we observed that in women carriers of Robertsonian translocations robertsonianas and in women carriers of reciprocal translocations, the frequency of normal or balanced oocytes was 60 %, and 40 % respectively. In reciprocal translocation cases, published in the literature or studied by us, in whom at least nine oocytes had been diagnosed, a correlation has been found between the frequency of non-disjunction observed and the theoretical recombination rate.

El cerdo es la especie doméstica más importante económicamente, no solo por ser la principal fuente de carne en la dieta humana, sino también por su papel como modelo animal para la investigación biomédica. La buena compresión de los mecanismos moleculares que afectan a la calidad de la carne en cerdos es esencial para la obtención de carnes con un patrón saludable de ácidos grasos sin afectar el rendimiento productivo. La composición de ácidos grasos es un carácter muy importante para la calidad de la carne; no obstante, nuestro conocimiento sobre la compleja red de procesos y vías metabólicas que forman el metabolismo de los ácidos grasos sigue siendo limitado. Esta tesis tiene como objetivo general mejorar el entendimiento de estos procesos moleculares, con el fin de comprender mejor la arquitectura genética de la calidad de la carne en el cerdo. Se ha evaluado la implicación funcional de la variante DQ144454:c.2645GT presentó una alta asociación con la expresión del propio gen y el contenido de los ácidos palmítico y palmitoleico en músculo y tejido adiposo. Estudios funcionales del promotor del gen validaron la unión de SREBF1 y ERα, sugiriendo un papel importante de ambos factores de transcripción en la regulación del gen ELOVL6. Curiosamente, el SNP ELOVL6:c.-394G>A se encuentra en desequilibrio de ligamiento con el SNP ELOVL6:c.-533C>T y también se encuentra localizado en el único lugar de unión de ERα en el promotor. Además, los estudios realizados permitieron observar una unión diferencial de ERα en función del genotipo del ELOVL6:c.-394G>A, mostrando su unión solo en los animales portadores del alelo G. La unión de ERα ha sido asociada al reclutamiento de metilasas y, consecuentemente, al aumento de los niveles de metilación de los motivos CpG adyacentes. Por lo tanto, las diferencias en la unión de ERα y en el grado de metilación del promotor pueden ser los factores causales de la menor expresión del gen en animales con el alelo G. Por este motivo proponemos el SNP ELOVL6:c.-394G>A como el principal SNP causal de las variaciones fenotípicas del QTL. Finalmente, el transcriptoma del tejido adiposo de cerdos fenotípicamente extremos para la composición de ácidos grasos en músculo fue secuenciado mediante RNA-Seq. Se realizó un análisis de expresión diferencial que permitió identificar 396 genes diferencialmente expresados que modulaban principalmente la lipogénesis, probablemente debido a las diferencias en el contenido de ácidos grasos poliinsaturados entre grupos. Este efecto de la composición de ácidos grasos sobre la expresión de genes lipídicos sugiere que los genes diferencialmente expresados pueden desempeñar un papel importante en el metabolismo de los lípidos y de los ácidos grasos. / Pig is one of the most economically important domestic species, since they have been extensively used not only as the major human meat source, but also for biomedical research. A good understanding of the molecular mechanisms affecting meat quality traits in pigs is essential for obtaining meat with a fatty acids profile more in line with public health recommendations without affecting the production yield. Food fatty acid composition is highly relevant for determining meat quality traits, but its metabolism is composed by a complex network of processes and pathways that are not fully understood. Elucidating these molecular processes is the general objective of this thesis, in order to better understand the genetic architecture of meat quality traits in pigs. We evaluated the functional implication of the genetic variant DQ144454:c.2645GT SNP, identified in the promoter region, was highly associated with its own gene expression and the percentages of palmitic and palmitoleic fatty acids in muscle and adipose tissue. Functional analyses of ELOVL6 promoter showed the occupancy of SREBF1 and ERα, suggesting an important role of both transcription factors on the regulation of ELOVL6 gene expression. Interestingly, the ELOVL6:c.-394G>A SNP is in linkage disequilibrium with ELOVL6:c.-533C>T SNP and also is located within the only predicted ERE on ELOVL6 promoter. In addition, ChIP assays showed that ERα binding depends on ELOVL6:c.-394G>A genotype, showing union only in animals carrying the G allele. It has been described that ERα binding causes the recruitment of Dnmts and, consequently, an increase on the methylation levels of the surrounding CpG motifs. Therefore, differences on ERα binding and the methylation pattern may be the causal factors of the lower ELOVL6 expression in animals with the ELOVL6:c.-394G allele. Hence, we proposed ELOVL6:c.-394G>A SNP as the major putative causal mutation for explaining the phenotypic variation of the QTL analyzed. Finally, the adipose tissue transcriptomes of two groups of phenotypically extreme pigs for intramuscular fatty acid composition were sequenced using RNA-Seq. Differential expression analysis identified 396 genes differentially expressed between groups. The major metabolic pathway differentially modulated between groups was lipogenesis, probably caused by the differences on PUFA content between the two groups. Therefore, the linked effect of fatty acid composition on lipid-related gene expression suggested that differentially-expressed genes may play an important role in lipid and fatty acid metabolism.

La presente tesis es una aportación al conocimiento de las bases genéticas de la criptorquidia no sindrómica y de las formas idiopáticas de espermatogénesis anómala. RXFP2 y ESR1 son dos genes candidatos en la etiología de la criptorquidia no sindrómica debido al rol del receptor RXFP2 en el control hormonal del descenso testicular y al posible papel del receptor ESR1 como mediador de los efectos de substancias capaces de interferir con el desarrollo del tracto urogenital masculino. La primera parte de la tesis está enfocada en el estudio del papel de dos variantes de estos genes en la etiología de la criptorquidia: la variante de secuencia p.T222P del gen RXFP2 (previamente descrita como una mutación patogénica causante de criptorquidia) y el microsatélite (TA)n del promotor del gen ESR1 estudiado por primera vez en relación con la criptorquidia. Para cada una de las variantes hemos analizado 550 sujetos de origen italiana y 570 de origen española (entre pacientes y controles). En la población española la variante p.T222P se ha encontrado en una proporción parecida de casos (1.6%) y controles (1.8%). Estos resultados indican que dicha variante genética es un polimorfismo común sin significado clínico en esta población. En cambio en la población italiana la frecuencia de la p.T222P ha resultado ser significativamente más alta en pacientes que en controles, lo que sugiere un posible papel para dicha variante como factor de riesgo para la criptorquidia. No hemos observado diferencias significativas en la distribución de los alelos (TA)n entre casos y controles. La frecuencia del genotipo A (supuestamente asociado a mayor actividad del promotor de ESR1) ha resultado ser parecida en casos y controles en ambas poblaciones de estudio. Estos resultados indican que el polimorfismo (TA)n no está asociado con la criptorquidia no sindrómica ni en población española ni en población italiana. La segunda parte de la tesis investiga el papel de variantes de número de copias (CNVs) en los cromosomas Y y X en la etiología de la espermatogenésis anómala. El estudio de las CNVs del cromosoma Y incluye: i) el análisis de más de 800 pacientes infértiles (mayoritariamente españoles) para las microdeleciones del cromosoma Y; ii) el estudio de deleciones y duplicaciones parciales de la región AZFc (estas últimas estudiadas por primera vez en población española) en 330 infértiles idiopáticos y 385 controles normozoospermicos de origen española. Nuestros datos basados en 27 portadores de microdeleciones clasicas del Y (3.3%) junto con una amplia revisión de la literatura indican que el diagnóstico genético de rutina para las microdeleciones del Y se podría limitar a varones con concentración espermática ≤2x106 /ml; ii) la técnica de recuperación espermática testicular más adecuada para los pacientes azoospérmicos portadores de deleciones AZFc es la microTESE; iii) el background del Y podría explicar en parte que las microedeleciones del Y si encuentren en diferente frecuencia en distintas poblaciones. Con respecto al estudio de los reordenamientos parciales en AZFc, hemos corroborado que las deleciones gr/gr (deleciones parciales AZFc) representan un factor de riesgo para la espermatogénesis alterada en población caucásica y hemos descartado que las duplicaciones AZFc contribuyan a esta anomalía. Para estudiar el papel de las CNVs del cromosoma X en la etiología de la espermatogenésis anómala, hemos analizado 199 sujetos con diferente concentración espermática utilizando un array de CGH de alta resolución específico para el cromosoma X. Hemos identificado 73 CNVs entre las cuales 29 perdidas (mayoritariamente raras) y 44 ganancias. El número de deleciones por sujeto y la cantidad media de DNA delecionado han resultado ser significativamente mayores en pacientes que en controles, lo que sugiere que un aumento de la “carga de deleción” podría estar implicado en la etiología de la espermatogenésis anómala. Tres deleciones recurrentes localizadas en Xq27.3 (CNV64) y en Xq28 (CNV67 y CNV69) han sido consideradas de mayor interés por su presencia exclusiva (CNV67) o prevalente (CNV64, CNV69) en el grupo de los pacientes. Dichas deleciones han sido objeto de un estudio profundizado que incluye: i) el screening de 627 infértiles idiopáticos y 628 controles normozoospérmicos de dos poblaciones mediterráneas (española e italiana); ii) la caracterización molecular de las deleciones; iii) la identificación de elementos funcionales afectados por las deleciones. Las CNV64 y CNV69 se han encontrado más frecuentemente en pacientes que en controles. La CNV69 presenta al menos dos patrones de deleción (tipo A y tipo B) de los cuales solo el tipo B ha resultado ser significativamente más representado en pacientes, indicando que este tipo de deleción podría ser responsable del efecto deletéreo de la CNV69 en la espermatogenésis. Las CNV64 y CNV69 no contienen genes en su interior pero podrían afectar una serie de elementos reguladores localizados <0.5 Mb. La CNV67, identificada únicamente en un 1.1% de los pacientes (p<0.01), podría directamente afectar el gen MAGEA9 y/o sus elementos reguladores. El análisis del pedigrí de dos portadores de CNV67 ha evidenciado que esta deleción es trasmitida por la madre. La condición de normozoospermico del hermano no portador de uno de los pacientes portador de CNV67 suporta el posible efecto patogénico de esta deleción en la espermatogenésis. Los resultados presentados en esta tesis suportan la visión que la etiología de la criptorquidia es probablemente poligénica y en la mayoría de los casos multifactorial. Es plausible que la aplicación de nuevas tecnologías de secuenciación masiva, garantizando un análisis más a gran escala del background genético del individuo, contribuyan a desenredar la complejidad de la etiología de esta enfermedad. Futuros estudios serán necesarios para corroborar el significado clínico de la CNV67 y confirmar, en otras poblaciones, la significativa asociación entre CNV64, CNV69 tipo B y espermatogenésis anómala. / The present thesis explores the role of specific genetic variants in the etiology of two forms of disturbed male reproductive fitness: non-syndromic cryptorchidism and idiopathic spermatogenic failure. The etiology of non-syndromic cryptorchidism, still largely unknown, is likely to be multifactorial reflecting the involvement of environmental and genetic factors. RXFP2 and ESR1 are interesting candidate genes due to the involvement of RXFP2 receptor in testis descent and the potential role of ESR1 receptor as mediator of substances able to interfere with the development of the male urogenital tract. The first part of the thesis presents the study of two genetic variants of RXFP2 and ESR1, aimed to explore their contribution to non syndromic cryptorchidism. These are the missense substitution T222P in exon 8 of RXFP2, previously proposed as a pathogenic mutation for cryptorchidism, and the VNTR polymorphism (TA)n within the ESR1 promoter, previously reported as a potential functional polymorphism in relation to bone mineralization and spermatogenesis and never studied so far in relation to cryptorchidism. Complessively 550 subjects from Italy and 570 from Spain (with and without history of cryptorchidism) were screened for each variant. The T222P was found at a similar frequency in both patients (1.6%) and controls (1.8%) in the Spanish population thus indicating that in this population it is a common polymorphism with no pathogenic effect. In the Italian study population the frequency of T222P was significantly higher in patients (p = 0.031) supporting a role for this variant as mild risk factor for cryptorchidism (OR= 3.17, 95% CI: 1.07–9.34). Nevertheless, the screening for this variant for diagnostic purposes is not advised because of the relatively high frequency of control carriers (1.4%). Two (TA)n genotypes (A and B) were defined based on the possible allelic combinations of high, medium or low number of repeats and their frequency was compared between cases and controls from the two study populations. Allelic distribution of (TA)n did not show significant differences between cases and controls. The frequency of genotype A, considered the functionally most active one, was also similar in cases and controls both in the Italian and Spanish study populations. These results indicate that the (TA)n within the ESR1 promoter is not associated with non syndromic cryptorchidism neither in the Spanish nor in the Italian population. The second part of the thesis explores the role of Y and X-linked Copy Number Variations (CNVs) in the etiology of spermatogenic impairment. The study of Y-linked CNVs includes: i) the retrospective analysis of 806 mainly Spanish infertile patients screened for Y microdeletions and ii) the study of partial AZFc deletions and duplications (the latter studied here for the first time in the Spanish population) including 330 idiopathic infertile patients and 385 controls from Spain. A total of 27/806 (3.3%) patients carried complete AZF deletions. All were azoo/cryptozoospermic, except for one whose sperm concentration was 1- 2x106/ml. This finding integrated with the literature suggests that routine AZF microdeletion testing could eventually include only men with ≤2x106/ml. In AZFc deleted men a lower sperm recovery rate was observed upon conventional TESE (9.1%) compared to the literature (60%-80% with microTESE) indicating that microTESE ensuring better outcomes, should be regarded as the best option. Haplogroup (hgr) E was the most represented among non- Spanish whereas hgr P among Spanish AZF deletion carriers supporting a potential contribution of Y background to the inter-population variability in deletion frequency. The gr/gr deletion was significantly associated with spermatogenic impairment, further supporting the inclusion of this genetic test in the work-up of infertile men, while partial AZFc duplications do not represent a risk for spermatogenic failure in the Spanish population. The present thesis addresses the topic of X-linked CNVs in spermatogenic defects by presenting the X-chromosome array-CGH (a-CGH) analysis of 199 men with different sperm count. A total of 73 CNVs were identified including 29 mostly rare losses and 44 gains. A significantly higher burden of deletions was found in patients compared to controls due to an excessive rate of deletions/person (0.57 versus 0.21, respectively; p =8.78x10-6) and to a higher mean sequence loss/person (11.79 Kb and 8.13 Kb, respectively; p = 3.43 x10-6). This finding suggests that an increased X chromosome deletion burden may be involved in the etiology of spermatogenic impairment. X-linked Cancer Testis Antigen (CTA) genes resulted to be frequently affected, indicating that their dosage variation may play a role in X-linked CNV-related spermatogenic failure. Three recurrent deletions, mapping to the Xq27.3 (CNV64) and Xq28 (CNV67 and CNV69), were considered of interest for their exclusive (CNV67) or prevalent (CNV64 and CNV69) presence in patients. These deletions were object of an in-depth analysis including: i) the screening of 627 idiopathic patients and 628 normozoospermic controls from two Mediterranean populations (Spanish and Italian); ii) the molecular characterization of deletions; iii) the exploration for functional elements. CNV64 and CNV69 were significantly more frequent in patients than controls (OR=1.9 and 2.2, for CNV64 and CNV69 respectively). CNV69 displayed at least two deletion patterns (type A and type B), of which type B, being significantly more represented in patients than controls, may account for the potential deleterious effect of CNV69 on sperm production. No genes have been identified inside CNV64 and CNV69, nevertheless a number of regulatory elements, have been found to be potentially affected. CNV67 deletion was exclusively found in patients at a frequency of 1,1% (p<0.01) thus resembling the AZF region of the Y chromosome. This deletion may involve the CTA gene MAGEA9 and/or of its regulatory elements. It may also affect regulatory elements of HSFX1/2 showing testis-specific expression. Pedigree analyses of two CNV67 carriers indicated that CNV67 deletion is maternally inherited. One of these families was especially informative since the pathological semen phenotype of the carrier versus his normozoospermic non-carrier brother was a strong indicator for a pathogenic effect of the deletion on spermatogenesis. The results of the present thesis are in line with the prevalent view that the etiology of nonsyndromic cryptorchidism is likely to be polygenic and in most of cases multifactorial. We are confident that high throughput technologies, especially next generation sequencing, will help to unravel the complexity of the etiology of this disease. We provide evidence for a significant association between recurrent X-linked deletions and impaired sperm production. Further studies in other ethnic-geographic groups are needed to confirm the association of CNV64 and CNV69 type B with spermatogenic failure. Due to the specific association of CNV67 with spermatogenic impairment a parallelism with AZF deletions of the Y chromosome is tempting. This CNV merits further investigation in order to provide a feasible substrate for fine molecular characterization, and to further evaluate its putative diagnostic value.