Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Kateřina Šedivá Supervisor: Mgr. Eva Novotná, Ph.D. Title of diploma thesis: Cloning, expression and purification of mycobacterial dihydrofolate reductase Dihydrofolate reductase is an enzyme essential for the metabolism of folic acid - it catalyzes the reduction of dihydrofolate to tetrahydrofolate. Tetrahydrofolate is an important cofactor involved in one-cabron transfer reactions. Dihydrofolate reductase plays a key role in the synthesis of DNA, RNA and proteins. Dihydrofolate reductase was also found in M. tuberculosis. This bacterium is the most common causative agent of tuberculosis in humans. Thus dihydrofolate reductase could be a potential target for the design of new antituberculotics. The recombinant protein dihydrofolate reductase was prepared in several steps. The coding sequence of the protein was first amplified by polymerase chain reaction. A recombinant plasmid, obtained by the ligation of an amplified segment of DNA with plasmid pET-28b(+), was transformed into competent cells E. coli strain BH101 by the heat shock method. Cells E. coli strain BL21(DE3) were used for the protein expression. The expression was induced by the addition of isopropyl-β-D-...

Os venenos de serpentes contém uma mistura complexa de toxinas (proteínas e enzimas) que destroem os processos bioquímicos ou fisiológicos da presa. A crotamina é um dos principais componentes do veneno da cascavel Sul Americana Crotalus durissus terrificus. Essa proteína pertence à família dos polipeptídeos miotóxicos de baixo peso molecular (SBMPs). Uma importante atividade da crotamina é a habilidade de penetrar rapidamente em células proliferamente ativas, podendo ser usada como nanocarreadora, levando DNA plasmidial e drogas para dentro de células tumorais. Outra atividade interessante desta toxina é a indução de morte celular dose dependente em células cancerígenas proliferamente ativas sem prejudicar células normais, demonstrando promissora atividade anticâncer. A crotamina apresenta forte atividade antifúngica e moderada atividade contra procariotos, age bloqueando canais de potássio dependente de voltagem, sendo seletiva para os canais Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3, e induz paralisia dos membros posteriores de camundongo. Dada a importância das atividades da crotamina, a toxina foi usada para produzir na forma recombinante. De forma geral, as toxinas animais são peptídeos secretados para o lúmen da glândula de veneno e são ricos em pontes dissulfeto, comumente expressas em sistemas procarióticos na forma de corpúsculos de inclusão ou em sistemas de expressão periplasmática. Foram construídos três genes sintéticos, um para a expressão em citoplasma e dois para a expressão em periplasma bacteriano utilizando o vetor pRSET-A (Invitrogen ®). Para a expressão de crotamina em citoplasma bacteriano, a região do DNA que codifica a região do peptídeo maduro foi clonada em fusão com uma cauda simples de 6 x His separada por uma seqüência codificante do sítio de clivagem de enterokinase em substituição à proteína de fusão do vetor comercial pRSETA. Para a expressão em periplasma a região codificante da crotamina madura foi clonada sob o controle da seqüência sinal da OmpA de E. coli. Todos os códons raros da crotamina madura foram otimizados de acordo com os códons preferenciais de E. coli. Em uma das construções para a expressão em periplasma, além da crotamina madura, o peptídeo sinal de OmpA também teve seus códons raros otimizados. Os plasmídeos desenhados para a expressão da crotamina madura em citoplasma e periplasma foram transformados em bactéria competente BL21(DE3) e BL21-AI e a indução da proteína foi feita por IPTG e arabinose, respectivamente. A expressão foi analisada por SDS-PAGE e Western Blotting, mostrando que foi possível expressar as três construções em BL21-AI. / Snake venoms contain a complex cocktail of toxins (proteins and enzymes) which disrupt physiological or biochemical processes of the pray. Crotamine is one of the major components present in the venom of the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus. It belongs to the small basic myotoxins peptide SBMPs. An important activity of crotamine is the ability to rapidly penetrate proliferative cells, acting as a nanocarrier, carrying plasmid DNA and drugs into tumor cells. Another interesting activity of this toxin is the ability to promote cell death of actively proliferating cancer cells in a dose dependent manner. Crotamine shows strong antifungical activity and modest activities against prokaryotes, it acts by blocking voltage-dependent potassium channels being selective for channels Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3 and inducing paralysis of the hind limbs of mice. Given the importance of the activities of crotamine, the toxin was chosen for production in the recombinant form. Generally, animal toxins are peptides secreted into the lumen of the venom gland and are rich in disulfide bridges. When expressed in prokaryotic system, animal toxins are commonly found in the form of inclusion bodies. They can also be expressed in periplasmic sytem. Three synthetic genes were constructed, one for expression in the cytoplasm and two for expression in the bacterial periplasm using pRSET-A (Invitrogen ®) system. For cytoplasm expression, the DNA region encoding the mature peptide was cloned in fusion with a 6 x His tag separated by a site. For expression in the periplasm, the mature crotamine coding region was cloned in fusion with E. coli OmpA signal sequence. All crotamine and OmpA signal peptide rare codons were optimized according to E. coli preferred codon usage. The plasmids designed for crotamine expression in periplasm and cytoplasm have been transformed in strains BL21(DE3) and BL21-AI were used as hosts, and the induction of recombinant protein was done by IPTG and arabinose, respectively. The induced culture products were analyzed by SDSPAGE and Western Blot, showing that it was possible to express the three constructs in BL21-AI.

Sufficient vitamin D is important for overall health. However, cutaneous production of vitamin D is limited by season and little vitamin D naturally occurs in food. Therefore, vitamin D supplementation is necessary. Vitamin D is available in pharmacies as vitamin D2 and vitamin D3, and can also be obtained by irradiating mushrooms to produce vitamin D2. Types of vitamin D supplementation were tested to compare their ability to increase vitamin D status and their effect on broad gene expression in human white blood cells. 2000 IU of vitamin D2, vitamin D3 or vitamin D2 in irradiated mushroom powder were given to subjects daily for twelve weeks. A placebo mushroom powder group was included in the second half of the study. To determine the effect of different supplementation on vitamin D status, whole blood was obtained weekly and serum was assayed for 25(OH)D2 and 25(OH)D3. Change in total 25(OH)D was determined from baseline to twelve weeks; 25(OH)D levels in the placebo mushroom powder group did not change significantly at 1.8 ± 1.8 ng/ml (9.6 ± 9.6%), the mushroom D2 group increased by 10.9 ± 10.2 ng/ml (53.2 ± 49.8%), the supplemental D2 group increased by 11.8 ± 7.4 ng/ml (60.2 ± 37.8%) and the supplemental D3 group increased by 21.7 ± 8.9 ng/ml (114.2 ± 46.8%). As expected, the total active form of vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D) showed no change in all groups because of its tight regulation. To determine the potential influence of vitamin D supplementation on differential gene expression in the immune system, white blood cells were isolated from whole blood samples taken before and after supplementation. RNA was extracted, and microarray assays were performed. Gene Set Enrichment Analysis was completed to determine strongly influenced pathways. However, due to the numerous variables between halves of the study, gene expression data was treated as separate studies. Even so, pathways involving RNA activation and degradation were significant between mushroom powder and mushroom D2 supplementation in both halves of the study, indicating the influence of compounds in mushrooms on RNA metabolism pathways. Supplemental vitamin D2 affected gene expression, though only two pathways showed significant change. Supplemental vitamin D3 was found to influence pathways involved in replication, transcription, and translation in both halves of the study. In conclusion, mushrooms powder, mushroom vitamin D2, supplemental vitamin D2, and supplemental vitamin D3 all influence differential gene expression in human white blood cells.

Os venenos de serpentes contém uma mistura complexa de toxinas (proteínas e enzimas) que destroem os processos bioquímicos ou fisiológicos da presa. A crotamina é um dos principais componentes do veneno da cascavel Sul Americana Crotalus durissus terrificus. Essa proteína pertence à família dos polipeptídeos miotóxicos de baixo peso molecular (SBMPs). Uma importante atividade da crotamina é a habilidade de penetrar rapidamente em células proliferamente ativas, podendo ser usada como nanocarreadora, levando DNA plasmidial e drogas para dentro de células tumorais. Outra atividade interessante desta toxina é a indução de morte celular dose dependente em células cancerígenas proliferamente ativas sem prejudicar células normais, demonstrando promissora atividade anticâncer. A crotamina apresenta forte atividade antifúngica e moderada atividade contra procariotos, age bloqueando canais de potássio dependente de voltagem, sendo seletiva para os canais Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3, e induz paralisia dos membros posteriores de camundongo. Dada a importância das atividades da crotamina, a toxina foi usada para produzir na forma recombinante. De forma geral, as toxinas animais são peptídeos secretados para o lúmen da glândula de veneno e são ricos em pontes dissulfeto, comumente expressas em sistemas procarióticos na forma de corpúsculos de inclusão ou em sistemas de expressão periplasmática. Foram construídos três genes sintéticos, um para a expressão em citoplasma e dois para a expressão em periplasma bacteriano utilizando o vetor pRSET-A (Invitrogen ®). Para a expressão de crotamina em citoplasma bacteriano, a região do DNA que codifica a região do peptídeo maduro foi clonada em fusão com uma cauda simples de 6 x His separada por uma seqüência codificante do sítio de clivagem de enterokinase em substituição à proteína de fusão do vetor comercial pRSETA. Para a expressão em periplasma a região codificante da crotamina madura foi clonada sob o controle da seqüência sinal da OmpA de E. coli. Todos os códons raros da crotamina madura foram otimizados de acordo com os códons preferenciais de E. coli. Em uma das construções para a expressão em periplasma, além da crotamina madura, o peptídeo sinal de OmpA também teve seus códons raros otimizados. Os plasmídeos desenhados para a expressão da crotamina madura em citoplasma e periplasma foram transformados em bactéria competente BL21(DE3) e BL21-AI e a indução da proteína foi feita por IPTG e arabinose, respectivamente. A expressão foi analisada por SDS-PAGE e Western Blotting, mostrando que foi possível expressar as três construções em BL21-AI. / Snake venoms contain a complex cocktail of toxins (proteins and enzymes) which disrupt physiological or biochemical processes of the pray. Crotamine is one of the major components present in the venom of the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus. It belongs to the small basic myotoxins peptide SBMPs. An important activity of crotamine is the ability to rapidly penetrate proliferative cells, acting as a nanocarrier, carrying plasmid DNA and drugs into tumor cells. Another interesting activity of this toxin is the ability to promote cell death of actively proliferating cancer cells in a dose dependent manner. Crotamine shows strong antifungical activity and modest activities against prokaryotes, it acts by blocking voltage-dependent potassium channels being selective for channels Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3 and inducing paralysis of the hind limbs of mice. Given the importance of the activities of crotamine, the toxin was chosen for production in the recombinant form. Generally, animal toxins are peptides secreted into the lumen of the venom gland and are rich in disulfide bridges. When expressed in prokaryotic system, animal toxins are commonly found in the form of inclusion bodies. They can also be expressed in periplasmic sytem. Three synthetic genes were constructed, one for expression in the cytoplasm and two for expression in the bacterial periplasm using pRSET-A (Invitrogen ®) system. For cytoplasm expression, the DNA region encoding the mature peptide was cloned in fusion with a 6 x His tag separated by a site. For expression in the periplasm, the mature crotamine coding region was cloned in fusion with E. coli OmpA signal sequence. All crotamine and OmpA signal peptide rare codons were optimized according to E. coli preferred codon usage. The plasmids designed for crotamine expression in periplasm and cytoplasm have been transformed in strains BL21(DE3) and BL21-AI were used as hosts, and the induction of recombinant protein was done by IPTG and arabinose, respectively. The induced culture products were analyzed by SDSPAGE and Western Blot, showing that it was possible to express the three constructs in BL21-AI.

A fosforilação reversível de proteínas em resíduos de serina e treonina, catalisada por quinases e fosfatases desempenha papel chave na regulação do crescimento e na diferenciação celular em eucariotos. As serina/treonina proteínas fosfatases (PSTPs) são atualmente divididas em três famílias denominadas PPP (PhosphoProtein Phosphatase), PPM (Phosphoprotein Phosphatase Magnesium-dependent) e FCP/SCP (RNA polymerase II CTD phosphatase), sendo que os membros da família PPP são, frequentemente, holoenzimas compostas de uma subunidade catalítica associada a uma ou mais subunidades reguladoras, as quais definem a função, localização e especificidade ao substrato da fosfatase. Neste trabalho, analisamos, através de RT-qPCR, o perfil de expressão dos genes codificadores de subunidades catalíticas de PPPs de Dictyostelium discoideum (PP1c, PP2Ac, PP4c, PP4c-like, PP6c e PP5c) e de 16 potenciais parceiros moleculares de algumas destas subunidades catalíticas, tais como DdI-2 e DdI-3, sabidamente inibidores da PP1c. Em resposta ao estresse térmico de células da fase de crescimento, detectamos o aumento dos níveis de transcritos de PP4c e PP6c e também de DdI-2, DdI-3 e DDB_G0292194, esta última, uma proteína de função desconhecida que interage com a PP1c em ensaios de duplo-híbrido em leveduras. Por outro lado, durante o estresse hiper-osmótico observamos a diminuição dos níveis de transcritos de quase todos os genes analisados com exceção de DdI-2 e DDB_G0292194. O nível de expressão de DdPP1c, DdI-2, DdI-3 e DDB_G0292194 também foi analisado em resposta ao estresse oxidativo e apenas o DDB_G0292194 foi induzido nesta condição. Os genes de PP1c, PP4, PP5c e PP6c são expressos durante todo o ciclo de vida de D. discoideum, mas a expressão de alguns dos genes analisados aumenta em uma fase definida do ciclo de desenvolvimento como é o caso de DDB_G0292194 que tem níveis de transcritos aumentados na fase de agregação. Este gene codifica uma proteína hipotética de 559 aminoácidos, que apresenta um domínio FHA (ForkHead-Associated) em sua região aminoterminal, além de uma sequência similar ao motivo consenso de ligação à PP1c. Ensaios no sistema de duplo-híbrido em leveduras confirmaram que a interação entre DDB_G0292194 e DdPP1c independe do domínio FHA. Verificamos, também, que o mutante nocaute de DDB_G0292194 apresenta uma morfologia alterada em condições padrões de cultivo, tanto na fase de crescimento como durante o desenvolvimento, além de uma maior sensibilidade ao estresse oxidativo causado pelo peróxido de hidrogênio quando comparado à linhagem selvagem. Em conjunto, nossos resultados evidenciam a importância das PPPs na resposta a diferentes tipos de estresse e para o crescimento e desenvolvimento de D. discoideum. / Reversible phosphorylation of proteins on serine and threonine residues, catalyzed by kinases and phosphatases plays a key role in growth and cell differentiation regulation in eukaryotes. Protein serine/threonine phosphatases (PSTPs) are currently divided into three families named PPP (Phosphoprotein Phosphatase), PPM (Phosphoprotein Phosphatase Magnesium-dependent) and FCP/SCP (RNA polymerase II CTD phosphatase). The PPP family members are often holoenzymes composed of a catalytic subunit associated with one or more regulatory subunits, which define function, localization and substrate specificity of the phosphatase. In this work, we have examined, by RT-qPCR, the expression profile of genes encoding PPP catalytic subunits of Dictyostelium discoideum (PP1c, PP2Ac, PP4c, PP4c-like, PP6c and PP5c) and 16 potential molecular partners for some of these catalytic subunits, such as DdI-2 and DdI-3, both known as PP1c inhibitors. In response to heat stress of growth phase cells, we detected increased levels of transcripts of PP4c and PP6c as well as of DdI-2, DdI-3, and DDB_G0292194, the latter a protein of unknown function that interacts with PP1c in yeast two-hybrid assays. Moreover, during the hyperosmotic stress we observed decreased transcript levels of nearly all genes examined except DdI-2 and DDB_G0292194. The expression level of DdPP1c, DdI-2, DdI-3 and DDB_G0292194 was also analyzed in response to oxidative stress and only DDB_G0292194 was induced in this condition. PP1c, PP4c, PP5c and PP6c genes are expressed throughout growth and development of D. discoideum while transcript levels of some the analysed genes were increased at a defined stage of the developmental cycle as in the case of DDB_G0292194, which increased during aggregation. This gene encodes a hypothetical protein of 559 amino acids bearing a FHA (ForkHead-Associated) domain in its aminoterminal region and a sequence matching the PP1c binding consensus motif. Yeast two-hybrid assays confirmed that DDB_G0292194 and DdPP1c interaction does not depend on FHA domain. We also found that DDB_G0292194 knockout mutant exibits an altered morphology on standard growth and developmental conditions and shows an increased sensitivity to oxidative stress induced by hydrogen peroxide in comparison to the wild type strain. Taken together, our results highlight the importance of PPPs in the response to different types of stress and for growth and development of D. discoideum.

A fosforilação reversível de proteínas em resíduos de serina e treonina, catalisada por quinases e fosfatases desempenha papel chave na regulação do crescimento e na diferenciação celular em eucariotos. As serina/treonina proteínas fosfatases (PSTPs) são atualmente divididas em três famílias denominadas PPP (PhosphoProtein Phosphatase), PPM (Phosphoprotein Phosphatase Magnesium-dependent) e FCP/SCP (RNA polymerase II CTD phosphatase), sendo que os membros da família PPP são, frequentemente, holoenzimas compostas de uma subunidade catalítica associada a uma ou mais subunidades reguladoras, as quais definem a função, localização e especificidade ao substrato da fosfatase. Neste trabalho, analisamos, através de RT-qPCR, o perfil de expressão dos genes codificadores de subunidades catalíticas de PPPs de Dictyostelium discoideum (PP1c, PP2Ac, PP4c, PP4c-like, PP6c e PP5c) e de 16 potenciais parceiros moleculares de algumas destas subunidades catalíticas, tais como DdI-2 e DdI-3, sabidamente inibidores da PP1c. Em resposta ao estresse térmico de células da fase de crescimento, detectamos o aumento dos níveis de transcritos de PP4c e PP6c e também de DdI-2, DdI-3 e DDB_G0292194, esta última, uma proteína de função desconhecida que interage com a PP1c em ensaios de duplo-híbrido em leveduras. Por outro lado, durante o estresse hiper-osmótico observamos a diminuição dos níveis de transcritos de quase todos os genes analisados com exceção de DdI-2 e DDB_G0292194. O nível de expressão de DdPP1c, DdI-2, DdI-3 e DDB_G0292194 também foi analisado em resposta ao estresse oxidativo e apenas o DDB_G0292194 foi induzido nesta condição. Os genes de PP1c, PP4, PP5c e PP6c são expressos durante todo o ciclo de vida de D. discoideum, mas a expressão de alguns dos genes analisados aumenta em uma fase definida do ciclo de desenvolvimento como é o caso de DDB_G0292194 que tem níveis de transcritos aumentados na fase de agregação. Este gene codifica uma proteína hipotética de 559 aminoácidos, que apresenta um domínio FHA (ForkHead-Associated) em sua região aminoterminal, além de uma sequência similar ao motivo consenso de ligação à PP1c. Ensaios no sistema de duplo-híbrido em leveduras confirmaram que a interação entre DDB_G0292194 e DdPP1c independe do domínio FHA. Verificamos, também, que o mutante nocaute de DDB_G0292194 apresenta uma morfologia alterada em condições padrões de cultivo, tanto na fase de crescimento como durante o desenvolvimento, além de uma maior sensibilidade ao estresse oxidativo causado pelo peróxido de hidrogênio quando comparado à linhagem selvagem. Em conjunto, nossos resultados evidenciam a importância das PPPs na resposta a diferentes tipos de estresse e para o crescimento e desenvolvimento de D. discoideum. / Reversible phosphorylation of proteins on serine and threonine residues, catalyzed by kinases and phosphatases plays a key role in growth and cell differentiation regulation in eukaryotes. Protein serine/threonine phosphatases (PSTPs) are currently divided into three families named PPP (Phosphoprotein Phosphatase), PPM (Phosphoprotein Phosphatase Magnesium-dependent) and FCP/SCP (RNA polymerase II CTD phosphatase). The PPP family members are often holoenzymes composed of a catalytic subunit associated with one or more regulatory subunits, which define function, localization and substrate specificity of the phosphatase. In this work, we have examined, by RT-qPCR, the expression profile of genes encoding PPP catalytic subunits of Dictyostelium discoideum (PP1c, PP2Ac, PP4c, PP4c-like, PP6c and PP5c) and 16 potential molecular partners for some of these catalytic subunits, such as DdI-2 and DdI-3, both known as PP1c inhibitors. In response to heat stress of growth phase cells, we detected increased levels of transcripts of PP4c and PP6c as well as of DdI-2, DdI-3, and DDB_G0292194, the latter a protein of unknown function that interacts with PP1c in yeast two-hybrid assays. Moreover, during the hyperosmotic stress we observed decreased transcript levels of nearly all genes examined except DdI-2 and DDB_G0292194. The expression level of DdPP1c, DdI-2, DdI-3 and DDB_G0292194 was also analyzed in response to oxidative stress and only DDB_G0292194 was induced in this condition. PP1c, PP4c, PP5c and PP6c genes are expressed throughout growth and development of D. discoideum while transcript levels of some the analysed genes were increased at a defined stage of the developmental cycle as in the case of DDB_G0292194, which increased during aggregation. This gene encodes a hypothetical protein of 559 amino acids bearing a FHA (ForkHead-Associated) domain in its aminoterminal region and a sequence matching the PP1c binding consensus motif. Yeast two-hybrid assays confirmed that DDB_G0292194 and DdPP1c interaction does not depend on FHA domain. We also found that DDB_G0292194 knockout mutant exibits an altered morphology on standard growth and developmental conditions and shows an increased sensitivity to oxidative stress induced by hydrogen peroxide in comparison to the wild type strain. Taken together, our results highlight the importance of PPPs in the response to different types of stress and for growth and development of D. discoideum.