Mediante a técnica de espalhamento de raio-X a baixos ângulos por macromoléculas em solução, estudou-se as variações de forma e tamanho da crotamina, proteína básica e neurotóxica do veneno das cascavéis (crotalus durissus terrificus), em diferentes condições de pH e uma concentração de 10% visando a determinação dos valores do raio de giro. Este raio, RG, é definido como RG = (&#8747vr2 &#961 rσ dvσ) 1 &#8260 2 onde v é o volume da macromolécula, r o módulo do vetor posição r&#963 com origem no centro de massa, &#961 (r&#963) a densidade eletrônica e n o número de elétrons da macromolécula. Este parâmetro não conduz obviamente ao conhecimento completo da estrutura da macromolécula, mas a sua determinação possibilita estudo de variações conformacionais de forma relativamente simples em sistemas com condições semelhantes às biológicas. Os valores do raio de giro foram determinados mediante gráficos de Guinier (Log JN(s) vs s2, onde s é o módulo do vetor posição do espaço recíproco e JN(s) a intensidade normalizada e livre de espalhamento parasita). Preliminarmente, foi feito um estudo com oxi-hemoglobina, Insulina e hemoglobina de caramujo, por apresentarem características semelhantes às da crotamina, isto é, serem do tipo globular e de forma aproximadamente esférica com o objetivo de familiarizar-se com a técnica experimental e testar a aparelhagem. Os valores de raio de giro deduzidos para a oxi-hemoglobina RGOX= 23.9 &#177 0.7 (A &#176), Insulina RGI= 18.4 &#177 0.5 (A &#176), e hemoglobina de caramujo RGhc= 92 &#177 2 (A&#176), concordam satisfatoriamente com resultados previamente encontrados na literatura. Os valores de raio de giro medido para as diferentes soluções de crotamina encontram-se em bom acordo com a teoria e com o valor do raio de giro esperado de crotamina REC= 9.7 A&#176 / The small angle x-ray scattering technique was used in order to determine the radius of gyration of crotamine, a basic and neurotoxic protein from rattle snake venom, in 10% solutions at different PHs. The radius of gryration, RG is defined as: RG = (&#8747vr2 &#961 rσ e dvσ) 1 &#8260 2 Where: v is the volume of the macromolecule, r is the modulus of the position vector r with origin at the center of mass, &#961 (r&#963) is the electronic density and n the number of electrons of the macromolecule. This parameter does not give a complete information about the structure of the macromolecule but it is possible to get information about conformation to close to the biological ones. The values of the radius of gyration were fdetermined by means of the Guinier graphics (Log JN(s) vs s2, where s is the magnitude of the scattering vetor and JN(s) is the normalized intensity. In order to get familiar wi th the experimental technique and to test the equipment the study of oxihaemoglobin, Insulin and sea-mail hemoglobin was done. This proteins are very similar to crotamine in the sense that they are globular type and almost of the same spherical shape. The values of the radius of gyration obtained agree very well with the reported ones: Oxihaemoglobin RGOX= 23.9 &#177 0.7 (A &#176), Insulin RGI= 18.4 &#177 0.5 (A &#176), and sea-mail hemoglobin RGhc= 92 &#177 2 (A&#176). The values od the radius of gyration measured for the different solution of crotamine are in good agreement with the calculated and with the expected value REC= 9.7 A&#176

Resumo: O veneno da serpente Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) é constituído pelas toxinas: Crotoxina, Crotamina, Giroxina e Convulxina. A crotamina possui ação miotóxica, sendo que esta toxina pode ser expressa ou não por animais de uma mesma região. Variações bioquímicas, enzimáticas e farmacológicas dos venenos, podem estar associadas a fatores geográficos, clima, sexo, idade, dieta, bem como tempo decorrido de cativeiro e entre extrações. Esta pesquisa teve como objetivo caracterizar o veneno de C.d.t, da micro-região de Botucatu (São Paulo) pela determinação de suas propriedades bioquímicas, farmacológicas e enzimáticas. Para isto, foi realizada a comparação de venenos de serpentes recém capturadas da natureza com o de cativeiro, para verificar a influência da variação sexual, ambiental (tempo de cativeiro) e ontogenética na sua composição. Foram utilizadas técnicas de dosagem protéica, eletroforese (SDS-PAGE), perfil cromatográfico (HPLC-RP), atividade coagulante e índice de coagulação, atividade proteolítica sobre a caseína, tóxica(DL50) e atividade da crotamina. As atividades das 93 amostras de veneno foram comparadas com as do Veneno Referência Nacional. A dosagem protéica não evidenciou variação entre os grupos formados por adultos (75%), mas mostrou diferença quando comparada a do grupo de filhotes (60%). A análise eletroforética (SDS-PAGE 15%) evidenciou que a variação da presença da crotamina não teve relação com a distribuição dos grupos, sendo que 65% das amostras foram crotaminanegativa. O perfil cromatográfico corroborou os resultados da eletroforese, a respeito da variação da crotamina, mostrando grandes variações nas concentrações das proteínas, além de evidenciar grande quantidade de isoformas de crotoxina. Na caracterização coagulante dos venenos, não houve variação entre os grupos formados por adultos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) venom is composed by the following toxins: crotoxin, crotamine, gyroxin and convulxin. Crotamine possess a myotoxic action that can be expressed or not by snakes from the same region. Biochemical, enzymatic and pharmacological variations of venoms may be associated with geographic factors, climate, gender, age, and diet as well as length of captivity and venom extractions. The present study was carried out in order to characterize the C.d.t. venom of Botucatu micro-region, São Paulo State, by defining its biochemical, pharmacological and enzymatic properties. A comparative characterization of venoms from newly captured snakes and already-captured animals was performed to verify the sexual, environmental (length of captivity) and ontogenetic variations that influence the venom composition. Protein concentration, electrophoresis (SDS-PAGE), chromatographic profile (RPHPLC), coagulant activity and coagulation index, proteolytic activity upon casein, toxic (LD50) and crotamine activity were employed. The venom activities of 93 samples were compared with the National Reference Venom. Protein concentrations did not evidence a variation among the groups of adults (75%), but revealed some difference when compared with newborn groups (60%). The electrophoresis analysis (SDS-PAGE 15%) presented a crotamine variation that had no relation with the distribution of groups, which showed that 65% of the samples were crotamine negative. The chromatographic profile confirmed the results of electrophoresis regarding crotamine variation, and also showed great variation in the protein concentration, besides revealing a high quantity of crotoxin isoforms. Concerning coagulant characterization, there was no variation among adult groups; however, the National Reference Venom and newborn groups presented higher coagulant activities. Toxic (LD 50) and proteolytic activicties... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Coorientador: Andreimar Martins Soares / Banca: Daniel Carvalho Pimenta / Banca: Patrick Kack Spencer / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-28Bitstream added on 2014-06-13T19:51:39Z : No. of bitstreams: 1 lourencojunior_a_me_botfm.pdf: 1329256 bytes, checksum: 4e8b2e54b89603c559c64dfee4a7c8a2 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O veneno da serpente Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) é constituído pelas toxinas: Crotoxina, Crotamina, Giroxina e Convulxina. A crotamina possui ação miotóxica, sendo que esta toxina pode ser expressa ou não por animais de uma mesma região. Variações bioquímicas, enzimáticas e farmacológicas dos venenos, podem estar associadas a fatores geográficos, clima, sexo, idade, dieta, bem como tempo decorrido de cativeiro e entre extrações. Esta pesquisa teve como objetivo caracterizar o veneno de C.d.t, da micro-região de Botucatu (São Paulo) pela determinação de suas propriedades bioquímicas, farmacológicas e enzimáticas. Para isto, foi realizada a comparação de venenos de serpentes recém capturadas da natureza com o de cativeiro, para verificar a influência da variação sexual, ambiental (tempo de cativeiro) e ontogenética na sua composição. Foram utilizadas técnicas de dosagem protéica, eletroforese (SDS-PAGE), perfil cromatográfico (HPLC-RP), atividade coagulante e índice de coagulação, atividade proteolítica sobre a caseína, tóxica(DL50) e atividade da crotamina. As atividades das 93 amostras de veneno foram comparadas com as do Veneno Referência Nacional. A dosagem protéica não evidenciou variação entre os grupos formados por adultos (75%), mas mostrou diferença quando comparada a do grupo de filhotes (60%). A análise eletroforética (SDS-PAGE 15%) evidenciou que a variação da presença da crotamina não teve relação com a distribuição dos grupos, sendo que 65% das amostras foram crotaminanegativa. O perfil cromatográfico corroborou os resultados da eletroforese, a respeito da variação da crotamina, mostrando grandes variações nas concentrações das proteínas, além de evidenciar grande quantidade de isoformas de crotoxina. Na caracterização coagulante dos venenos, não houve variação entre os grupos formados por adultos... / Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) venom is composed by the following toxins: crotoxin, crotamine, gyroxin and convulxin. Crotamine possess a myotoxic action that can be expressed or not by snakes from the same region. Biochemical, enzymatic and pharmacological variations of venoms may be associated with geographic factors, climate, gender, age, and diet as well as length of captivity and venom extractions. The present study was carried out in order to characterize the C.d.t. venom of Botucatu micro-region, São Paulo State, by defining its biochemical, pharmacological and enzymatic properties. A comparative characterization of venoms from newly captured snakes and already-captured animals was performed to verify the sexual, environmental (length of captivity) and ontogenetic variations that influence the venom composition. Protein concentration, electrophoresis (SDS-PAGE), chromatographic profile (RPHPLC), coagulant activity and coagulation index, proteolytic activity upon casein, toxic (LD50) and crotamine activity were employed. The venom activities of 93 samples were compared with the National Reference Venom. Protein concentrations did not evidence a variation among the groups of adults (75%), but revealed some difference when compared with newborn groups (60%). The electrophoresis analysis (SDS-PAGE 15%) presented a crotamine variation that had no relation with the distribution of groups, which showed that 65% of the samples were crotamine negative. The chromatographic profile confirmed the results of electrophoresis regarding crotamine variation, and also showed great variation in the protein concentration, besides revealing a high quantity of crotoxin isoforms. Concerning coagulant characterization, there was no variation among adult groups; however, the National Reference Venom and newborn groups presented higher coagulant activities. Toxic (LD 50) and proteolytic activicties... (Complete abstract click electronic access below)

Mediante a técnica de espalhamento de raio-X a baixos ângulos por macromoléculas em solução, estudou-se as variações de forma e tamanho da crotamina, proteína básica e neurotóxica do veneno das cascavéis (crotalus durissus terrificus), em diferentes condições de pH e uma concentração de 10% visando a determinação dos valores do raio de giro. Este raio, RG, é definido como RG = (&#8747vr2 &#961 rσ dvσ) 1 &#8260 2 onde v é o volume da macromolécula, r o módulo do vetor posição r&#963 com origem no centro de massa, &#961 (r&#963) a densidade eletrônica e n o número de elétrons da macromolécula. Este parâmetro não conduz obviamente ao conhecimento completo da estrutura da macromolécula, mas a sua determinação possibilita estudo de variações conformacionais de forma relativamente simples em sistemas com condições semelhantes às biológicas. Os valores do raio de giro foram determinados mediante gráficos de Guinier (Log JN(s) vs s2, onde s é o módulo do vetor posição do espaço recíproco e JN(s) a intensidade normalizada e livre de espalhamento parasita). Preliminarmente, foi feito um estudo com oxi-hemoglobina, Insulina e hemoglobina de caramujo, por apresentarem características semelhantes às da crotamina, isto é, serem do tipo globular e de forma aproximadamente esférica com o objetivo de familiarizar-se com a técnica experimental e testar a aparelhagem. Os valores de raio de giro deduzidos para a oxi-hemoglobina RGOX= 23.9 &#177 0.7 (A &#176), Insulina RGI= 18.4 &#177 0.5 (A &#176), e hemoglobina de caramujo RGhc= 92 &#177 2 (A&#176), concordam satisfatoriamente com resultados previamente encontrados na literatura. Os valores de raio de giro medido para as diferentes soluções de crotamina encontram-se em bom acordo com a teoria e com o valor do raio de giro esperado de crotamina REC= 9.7 A&#176 / The small angle x-ray scattering technique was used in order to determine the radius of gyration of crotamine, a basic and neurotoxic protein from rattle snake venom, in 10% solutions at different PHs. The radius of gryration, RG is defined as: RG = (&#8747vr2 &#961 rσ e dvσ) 1 &#8260 2 Where: v is the volume of the macromolecule, r is the modulus of the position vector r with origin at the center of mass, &#961 (r&#963) is the electronic density and n the number of electrons of the macromolecule. This parameter does not give a complete information about the structure of the macromolecule but it is possible to get information about conformation to close to the biological ones. The values of the radius of gyration were fdetermined by means of the Guinier graphics (Log JN(s) vs s2, where s is the magnitude of the scattering vetor and JN(s) is the normalized intensity. In order to get familiar wi th the experimental technique and to test the equipment the study of oxihaemoglobin, Insulin and sea-mail hemoglobin was done. This proteins are very similar to crotamine in the sense that they are globular type and almost of the same spherical shape. The values of the radius of gyration obtained agree very well with the reported ones: Oxihaemoglobin RGOX= 23.9 &#177 0.7 (A &#176), Insulin RGI= 18.4 &#177 0.5 (A &#176), and sea-mail hemoglobin RGhc= 92 &#177 2 (A&#176). The values od the radius of gyration measured for the different solution of crotamine are in good agreement with the calculated and with the expected value REC= 9.7 A&#176

Os venenos de serpentes são alvos de pesquisas constantes, pois possuem 90 a 95% do seu peso seco em proteínas que exercem diversas atividades fisiológicas em suas presas. As espécies do gênero Crotalus estudadas no presente trabalho possuem venenos capazes de induzir alterações neurotóxicas, miotóxicas e causam distúrbios de coagulação no caso do veneno de Crotalus vegrandis. A crotamina é um peptídeo catiônico proveniente do veneno de Crotalus durissus terrificus, com atividade miotóxica e antimicrobiana já descritas. O trabalho avaliou a atividade antimicrobiana de crotamina e crotamina-símile provenientes do veneno de serpentes do gênero Crotalus. O veneno bruto foi fracionado por três diferentes métodos cromatográficos, e, para avaliar a técnica, utilizou-se SDS-PAGE. Na etapa de identificação e caracterização de crotamina, foi feito ELISA, utilizando como anticorpo primário uma IgG policlonal anti-crotamina. A fim de analisar a atividade antimicrobiana foram realizados os ensaios de difusão em gota e CIM (Concentração inibitória mínima). A citoxicidade em células murinas, foi avaliada por MTS. A purificação por duas etapas cromatográficas foi suficiente para observarmos a presença da crotamina e crotamina-símile puras (SDS-PAGE). Foram identificados dois peptídeos promissores com relação à atividade antimicrobiana no veneno de C. vegrandis. Todas as amostras testadas foram imunorreativas. Os peptídeos apresentam atividade antimicrobiana com diferentes especificidades e potências. Não houve alta toxicidade frente à linhagem celular murina, apresentando-se como um futuro protofármaco. / Snake venoms are common targets of research due to their high protein content (up to 90 to 95% of dry weight) which affect several biological functions. The species of the genus Crotalus that were studied in the present document have venoms able to induce neurotoxic, myotoxic and coagulation disorders (Crotalus vegrandis). Crotamine is a cationic polypeptide from the venom of rattlesnake Crotalus durissus terrificus, described as myotoxic and displaying antimicrobial activity. The present study aimed to evaluate the antimicrobial activity of crotamine and crotamine-like toxins from the genus Crotalus. Crude venom was fractionated by three different chromatographic methods, and to confirm the efficiency of purification SDS-PAGE was used. In the purification and characterization stage of crotamine, we performed ELISA, using as primary antibody a polyclonal anti-crotamine IgG. To analyze the antimicrobial activity, antibiograms (droplet diffusion) and MIC (minimal inhibitory concentration) assays were performed. Citotoxicity in murine cells was evaluated by MTS. The results of two chromatographic steps were enough to obtain isolated crotamine and crotamine-like (SDS-PAGE). Two promising peptides from C vegrandis were identified for antimicrobial activity. Crude venom and crotamine-like fraction from C. d. ruruima were immunoreactive in ELISA assays. Peptides showed antimicrobial activity with different specificities and potencies. The toxicity towards murine cells was low, indicating the potential of these peptides as a model to future drug.

Os venenos de serpentes são alvos de pesquisas constantes, pois possuem 90 a 95% do seu peso seco em proteínas que exercem diversas atividades fisiológicas em suas presas. As espécies do gênero Crotalus estudadas no presente trabalho possuem venenos capazes de induzir alterações neurotóxicas, miotóxicas e causam distúrbios de coagulação no caso do veneno de Crotalus vegrandis. A crotamina é um peptídeo catiônico proveniente do veneno de Crotalus durissus terrificus, com atividade miotóxica e antimicrobiana já descritas. O trabalho avaliou a atividade antimicrobiana de crotamina e crotamina-símile provenientes do veneno de serpentes do gênero Crotalus. O veneno bruto foi fracionado por três diferentes métodos cromatográficos, e, para avaliar a técnica, utilizou-se SDS-PAGE. Na etapa de identificação e caracterização de crotamina, foi feito ELISA, utilizando como anticorpo primário uma IgG policlonal anti-crotamina. A fim de analisar a atividade antimicrobiana foram realizados os ensaios de difusão em gota e CIM (Concentração inibitória mínima). A citoxicidade em células murinas, foi avaliada por MTS. A purificação por duas etapas cromatográficas foi suficiente para observarmos a presença da crotamina e crotamina-símile puras (SDS-PAGE). Foram identificados dois peptídeos promissores com relação à atividade antimicrobiana no veneno de C. vegrandis. Todas as amostras testadas foram imunorreativas. Os peptídeos apresentam atividade antimicrobiana com diferentes especificidades e potências. Não houve alta toxicidade frente à linhagem celular murina, apresentando-se como um futuro protofármaco. / Snake venoms are common targets of research due to their high protein content (up to 90 to 95% of dry weight) which affect several biological functions. The species of the genus Crotalus that were studied in the present document have venoms able to induce neurotoxic, myotoxic and coagulation disorders (Crotalus vegrandis). Crotamine is a cationic polypeptide from the venom of rattlesnake Crotalus durissus terrificus, described as myotoxic and displaying antimicrobial activity. The present study aimed to evaluate the antimicrobial activity of crotamine and crotamine-like toxins from the genus Crotalus. Crude venom was fractionated by three different chromatographic methods, and to confirm the efficiency of purification SDS-PAGE was used. In the purification and characterization stage of crotamine, we performed ELISA, using as primary antibody a polyclonal anti-crotamine IgG. To analyze the antimicrobial activity, antibiograms (droplet diffusion) and MIC (minimal inhibitory concentration) assays were performed. Citotoxicity in murine cells was evaluated by MTS. The results of two chromatographic steps were enough to obtain isolated crotamine and crotamine-like (SDS-PAGE). Two promising peptides from C vegrandis were identified for antimicrobial activity. Crude venom and crotamine-like fraction from C. d. ruruima were immunoreactive in ELISA assays. Peptides showed antimicrobial activity with different specificities and potencies. The toxicity towards murine cells was low, indicating the potential of these peptides as a model to future drug.

Os venenos de serpentes contém uma mistura complexa de toxinas (proteínas e enzimas) que destroem os processos bioquímicos ou fisiológicos da presa. A crotamina é um dos principais componentes do veneno da cascavel Sul Americana Crotalus durissus terrificus. Essa proteína pertence à família dos polipeptídeos miotóxicos de baixo peso molecular (SBMPs). Uma importante atividade da crotamina é a habilidade de penetrar rapidamente em células proliferamente ativas, podendo ser usada como nanocarreadora, levando DNA plasmidial e drogas para dentro de células tumorais. Outra atividade interessante desta toxina é a indução de morte celular dose dependente em células cancerígenas proliferamente ativas sem prejudicar células normais, demonstrando promissora atividade anticâncer. A crotamina apresenta forte atividade antifúngica e moderada atividade contra procariotos, age bloqueando canais de potássio dependente de voltagem, sendo seletiva para os canais Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3, e induz paralisia dos membros posteriores de camundongo. Dada a importância das atividades da crotamina, a toxina foi usada para produzir na forma recombinante. De forma geral, as toxinas animais são peptídeos secretados para o lúmen da glândula de veneno e são ricos em pontes dissulfeto, comumente expressas em sistemas procarióticos na forma de corpúsculos de inclusão ou em sistemas de expressão periplasmática. Foram construídos três genes sintéticos, um para a expressão em citoplasma e dois para a expressão em periplasma bacteriano utilizando o vetor pRSET-A (Invitrogen ®). Para a expressão de crotamina em citoplasma bacteriano, a região do DNA que codifica a região do peptídeo maduro foi clonada em fusão com uma cauda simples de 6 x His separada por uma seqüência codificante do sítio de clivagem de enterokinase em substituição à proteína de fusão do vetor comercial pRSETA. Para a expressão em periplasma a região codificante da crotamina madura foi clonada sob o controle da seqüência sinal da OmpA de E. coli. Todos os códons raros da crotamina madura foram otimizados de acordo com os códons preferenciais de E. coli. Em uma das construções para a expressão em periplasma, além da crotamina madura, o peptídeo sinal de OmpA também teve seus códons raros otimizados. Os plasmídeos desenhados para a expressão da crotamina madura em citoplasma e periplasma foram transformados em bactéria competente BL21(DE3) e BL21-AI e a indução da proteína foi feita por IPTG e arabinose, respectivamente. A expressão foi analisada por SDS-PAGE e Western Blotting, mostrando que foi possível expressar as três construções em BL21-AI. / Snake venoms contain a complex cocktail of toxins (proteins and enzymes) which disrupt physiological or biochemical processes of the pray. Crotamine is one of the major components present in the venom of the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus. It belongs to the small basic myotoxins peptide SBMPs. An important activity of crotamine is the ability to rapidly penetrate proliferative cells, acting as a nanocarrier, carrying plasmid DNA and drugs into tumor cells. Another interesting activity of this toxin is the ability to promote cell death of actively proliferating cancer cells in a dose dependent manner. Crotamine shows strong antifungical activity and modest activities against prokaryotes, it acts by blocking voltage-dependent potassium channels being selective for channels Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3 and inducing paralysis of the hind limbs of mice. Given the importance of the activities of crotamine, the toxin was chosen for production in the recombinant form. Generally, animal toxins are peptides secreted into the lumen of the venom gland and are rich in disulfide bridges. When expressed in prokaryotic system, animal toxins are commonly found in the form of inclusion bodies. They can also be expressed in periplasmic sytem. Three synthetic genes were constructed, one for expression in the cytoplasm and two for expression in the bacterial periplasm using pRSET-A (Invitrogen ®) system. For cytoplasm expression, the DNA region encoding the mature peptide was cloned in fusion with a 6 x His tag separated by a site. For expression in the periplasm, the mature crotamine coding region was cloned in fusion with E. coli OmpA signal sequence. All crotamine and OmpA signal peptide rare codons were optimized according to E. coli preferred codon usage. The plasmids designed for crotamine expression in periplasm and cytoplasm have been transformed in strains BL21(DE3) and BL21-AI were used as hosts, and the induction of recombinant protein was done by IPTG and arabinose, respectively. The induced culture products were analyzed by SDSPAGE and Western Blot, showing that it was possible to express the three constructs in BL21-AI.

A produção de soro no Brasil, único tratamento eficaz nos casos de acidentes ofídicos, utiliza equinos que apesar do grande porte, apresentam diminuição da longevidade quando comparado com os cavalos não imunizados. A radiação ionizante tem se mostrado como excelente ferramenta na diminuição da toxicidade de venenos e toxinas isoladas, além de promover a obtenção de melhores imunógenos para a produção de soro. Sabe-se, contudo, que os efeitos da radiação ionizante em materiais protéicos caracterizam-se por diversas alterações químicas, como fragmentação, cross-linking, agregação e oxidação devido aos produtos gerados pela radiólise da água. Porém, a ação da radiação gama em toxinas ainda não está totalmente esclarecida do ponto de vista estrutural e farmacológico, fato que impede a aplicação de tal metodologia no processo de produção do soro. Assim, foi proposto nesse trabalho a caracterização da crotamina, uma das principais proteínas do veneno da espécie Crotalus durissus terrificus, irradiada com raios gama de 60Co. Após o isolamento da toxina por técnicas cromatográficas e a realização de testes para comprovar a obtenção da crotamina pura, a toxina, nos estados nativo e irradiado, foi submetida às análises estruturais de Fluorescência e Dicroísmo Circular. Testes utilizando altas pressões hidrostáticas também foram realizados com o intuito de verificar se as alterações conformacionais causadas pela radiação sofreriam modificações sob altas pressões. Do ponto de vista farmacológico, testes de contração muscular foram realizados com o objetivo de delimitar a ação da crotamina em musculatura lisa, bem como a mudança na ação da toxina frente às alterações estruturais ocasionadas. As análises de Fluorescência e Dicroísmo Circular mostraram que há mudanças na conformação da crotamina quando submetida à radiação gama e que tais alterações possivelmente ocorrem na estrutura terciária e secundária da proteína. O observado nos testes farmacológicos mostraram que a crotamina irradiada foi menos eficaz na diminuição da contração muscular do ducto deferente de ratos em comparação com a crotamina nativa. Além disso, o comportamento da toxina irradiada na contração tônica, modulada por noradrenalina, foi distinto daquele observado para a toxina nativa. / The serum production in Brazil, the only effective treatment in cases of snakebites, uses horses that although large size, have reduced llifespan compared with horses not immunized. Ionizing radiation has been shown as an excellent tool in reducing the toxicity of venoms and toxins isolated, and promote the achievement of better immunogens for serum production, and contributing to the welfare of serum-producing animals. It is known, however, that the effects of ionizing radiation on protein are characterized by various chemical modifications, such as fragmentation, cross-linking due to aggregation and oxidation products generated by water radiolysis. However, the action of gamma radiation on toxins is not yet fully understood structurally and pharmacologically, a fact that prevents the application of this methodology in the serum production process. So we proposed in this paper the characterization of crotamine, an important protein from the venom of Crotalus durissus terrificus species, irradiated with 60Co gamma rays. After isolating the toxin by chromatographic techniques and testing to prove the obtaining of pure crotamine, it was irradiated with gamma rays and subjected to structural analysis, Fluorescence and Circular Dichroism. Using high hydrostatic pressure tests were also conducted in order to verify that the conformational changes caused by radiation suffer modifications under high pressures. From the pharmacological point of view, muscle contraction tests were conducted with the objective of limiting the action of crotamine in smooth muscle as well as the change in the action of toxin caused structural changes to the front. Analysis of Circular Dichroism and Fluorescence showed changes in structural conformation of crotamine when subjected to gamma radiation and that such changes possibly occurring in the secondary and tertiary structure of the protein. The observed in pharmacological tests showed that the irradiated crotamine was less effective in lowering the vas deferens twitch in rats in comparison to native crotamine. In addition, the behavior of irradiated toxin in tonic contraction, modulated by noradrenaline, was different from that observed for the native toxin.

Os acidentes ofídicos representam um sério problema de Saúde Pública, principalmente em países subtropicais. No Brasil, segundo o Ministério da Saúde, foram notificados cerca de 26 000 acidentes em 2008. O gênero Crotalus (cascavéis) é responsável por aproximadamente 7% do total, porém apresenta um alto índice de letalidade, sendo que 72% dos casos de acidentados sem o tratamento adequado com soro específico (soro anticrotálico) chegam ao óbito. A produção de soro no Brasil, único tratamento eficaz nos casos de acidentes ofídicos, utiliza equinos que, apesar do grande porte, apresentam diminuição da longevidade quando comparado com os cavalos não imunizados. A radiação ionizante tem se mostrado como excelente ferramenta na diminuição da toxicidade de venenos e toxinas isoladas e tem resultado na obtenção de melhores imunógenos para a produção de soro, além de contribuir para o bem estar dos animais soro-produtores. Visto que a ação da radiação gama em toxinas ainda não está totalmente esclarecida do ponto de vista estrutural, foi proposto neste trabalho, a caracterização de duas proteínas da espécie Crotalus durissus terrificus: a crotoxina e a crotamina. Após o isolamento das toxinas de interesse por técnicas cromatográficas, estas foram submetidas às análises estruturais com a aplicação das seguintes metodologias: Fluorescência, Dicroísmo Circular, Calorimetria Diferencial e Espectroscopia Infravermelho. Estas análises mostraram que tanto a crotamina como a crotoxina, quando submetidas à radiação gama, apresentaram alterações na conformação estrutural em comparação com as amostras no estado nativo. Tais alterações possivelmente ocorrem na estrutura terciária e secundária das proteínas e podem explicar as modificações quanto à atividade biológica destas toxinas. / Snake bites are a serious public health problem, especially in subtropical countries. In Brazil, the Ministry of Health notified around 26 000 accidents in 2008. The genus Crotalus (rattlesnakes) accounts for approximately 7% of the total, with a high mortality rate of 72% when untreated with the specific serum, the only effective treatment in case of snake bites. In Brazil, the serum is produced in horses which, despite the large size, have a reduced lifespan due to the high toxicity of the antigen. Ionizing radiation has proven to be an excellent tool for reducing the toxicity of venoms and isolated toxins, resulting in better immunogens for serum production, and contributing to the welfare of serumproducing animals. Since the action of gamma radiation on venoms and toxins has not been yet fully clarified from the structural point of view, we proposed in this paper, to characterize two toxins of the species Crotalus durissus terrificus: crotoxin and crotamine. After isolation of the toxins of interest by chromatographic techniques, they were subjected to structural analysis with the application of the following methods: Fluorescence, Circular Dichroism, Differential Calorimetry and Infrared Spectroscopy. These tests showed that both crotamine as crotoxin when subjected to gamma radiation, showed changes in their structural conformation compared with the samples in the native state. Such changes probably occur in the secondary and tertiary structure and may explain the changes on the biological activity of these toxins.

A produção de soro no Brasil, único tratamento eficaz nos casos de acidentes ofídicos, utiliza equinos que apesar do grande porte, apresentam diminuição da longevidade quando comparado com os cavalos não imunizados. A radiação ionizante tem se mostrado como excelente ferramenta na diminuição da toxicidade de venenos e toxinas isoladas, além de promover a obtenção de melhores imunógenos para a produção de soro. Sabe-se, contudo, que os efeitos da radiação ionizante em materiais protéicos caracterizam-se por diversas alterações químicas, como fragmentação, cross-linking, agregação e oxidação devido aos produtos gerados pela radiólise da água. Porém, a ação da radiação gama em toxinas ainda não está totalmente esclarecida do ponto de vista estrutural e farmacológico, fato que impede a aplicação de tal metodologia no processo de produção do soro. Assim, foi proposto nesse trabalho a caracterização da crotamina, uma das principais proteínas do veneno da espécie Crotalus durissus terrificus, irradiada com raios gama de 60Co. Após o isolamento da toxina por técnicas cromatográficas e a realização de testes para comprovar a obtenção da crotamina pura, a toxina, nos estados nativo e irradiado, foi submetida às análises estruturais de Fluorescência e Dicroísmo Circular. Testes utilizando altas pressões hidrostáticas também foram realizados com o intuito de verificar se as alterações conformacionais causadas pela radiação sofreriam modificações sob altas pressões. Do ponto de vista farmacológico, testes de contração muscular foram realizados com o objetivo de delimitar a ação da crotamina em musculatura lisa, bem como a mudança na ação da toxina frente às alterações estruturais ocasionadas. As análises de Fluorescência e Dicroísmo Circular mostraram que há mudanças na conformação da crotamina quando submetida à radiação gama e que tais alterações possivelmente ocorrem na estrutura terciária e secundária da proteína. O observado nos testes farmacológicos mostraram que a crotamina irradiada foi menos eficaz na diminuição da contração muscular do ducto deferente de ratos em comparação com a crotamina nativa. Além disso, o comportamento da toxina irradiada na contração tônica, modulada por noradrenalina, foi distinto daquele observado para a toxina nativa. / The serum production in Brazil, the only effective treatment in cases of snakebites, uses horses that although large size, have reduced llifespan compared with horses not immunized. Ionizing radiation has been shown as an excellent tool in reducing the toxicity of venoms and toxins isolated, and promote the achievement of better immunogens for serum production, and contributing to the welfare of serum-producing animals. It is known, however, that the effects of ionizing radiation on protein are characterized by various chemical modifications, such as fragmentation, cross-linking due to aggregation and oxidation products generated by water radiolysis. However, the action of gamma radiation on toxins is not yet fully understood structurally and pharmacologically, a fact that prevents the application of this methodology in the serum production process. So we proposed in this paper the characterization of crotamine, an important protein from the venom of Crotalus durissus terrificus species, irradiated with 60Co gamma rays. After isolating the toxin by chromatographic techniques and testing to prove the obtaining of pure crotamine, it was irradiated with gamma rays and subjected to structural analysis, Fluorescence and Circular Dichroism. Using high hydrostatic pressure tests were also conducted in order to verify that the conformational changes caused by radiation suffer modifications under high pressures. From the pharmacological point of view, muscle contraction tests were conducted with the objective of limiting the action of crotamine in smooth muscle as well as the change in the action of toxin caused structural changes to the front. Analysis of Circular Dichroism and Fluorescence showed changes in structural conformation of crotamine when subjected to gamma radiation and that such changes possibly occurring in the secondary and tertiary structure of the protein. The observed in pharmacological tests showed that the irradiated crotamine was less effective in lowering the vas deferens twitch in rats in comparison to native crotamine. In addition, the behavior of irradiated toxin in tonic contraction, modulated by noradrenaline, was different from that observed for the native toxin.