Orientador : Julia Prado Franceschi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-16T16:31:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hertel_Ruth_M.pdf: 3845508 bytes, checksum: 0b5c05f8d8290aafab50fec3f33eccc2 (MD5) Previous issue date: 1977 / Resumo: A peçonha da cascavel sul-americanas, submetida à precipitação fracionada pelo sulfato de amônio, foi separada em vários componentes ('F IND. I¿ , 'F IND. II¿ , 'F IND. III¿ e 'S IND. I¿ , 'S IND. II¿, 'S IND. III¿). As frações 'F IND. II¿, 'F IND. III¿ e 'F IND. II¿¿ , 'F IND. III¿¿, representando cerca de 50% do rendimento da precipitação, são contituídas principalmente de crotoxina amorfa que foi cristalizada. A imunoeletroforese e imunodifusão, a crotoxina cristalizada revelou dói s sistemas precipitantes: fosfolipase A e crotapotica. Tanto a crotoxina assim obtida, como a marcada com 'I POT. 131¿, foram utilizadas com antígeno. A purificação do anticorpo específico para a crotoxina foi obtida por dois métodos: 1- o antígeno reagiu com o soro anticrotálico no ponto de equivalência e o precipitado AgAc foi dissociado em ácido fórmico e cromatografdo em Sephadex G-100; 2- o antígeno insolúvel, covalente ligado a uma matriz, Sepharose 4B ativada com CNBr, foi purificado por afinidade cromatográfica. O anticorpo, obtido pelos dois processos mencionados acima, foi ensaido por imunoeletroforese e imunodifusão. A capacidade neutralizante específica deste anticorpo foi 13 vezes maior do que a do soro anticrotálico, quando testado em pombos / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Oswaldo Vital Brazil / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T01:42:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lomba_MauricioGomes_D.pdf: 4947897 bytes, checksum: 3aed60720e0c4fbfa20e44fc720b3471 (MD5) Previous issue date: 1969 / Resumo: A finalidade do presente trabalho foi investigar a cinética e distribuição, em cães, da crotoxina, principal fração da peçonha de Crotalus durissus terrificus. Para tanto a crotoxina foi radioiodada, usando-se o 'ICL ANTPOT. 131¿. O comportamento eletroforético, químico e biológico da crotoxina 'I ANTPOT. 131¿ foi idêntico ao da não marcada, podendo-se presumir que esse traçador espelhe fielmente o comportamento da proteína que não sofreu qualquer tratamento radioativo. Um modelo de três compartimentos foi escolhido e testado para o estudo da cinética da crotoxina. O compartimento 1 foi identificado como sendo o intravascular que, unido ao 2, representa presumivelmente o espaço extracelular. O compartimento 3 provavelmente o espaço coberto pela porção celular que fixa firmemente a crotoxina. O ritmo de remoção da crotoxina calculado, para NÃO PROTEGIDOS, através de 'alfa IND. 1¿ e o determinado experimentalmente através da amostragem de urina são da mesma ordem de grandeza e correspondem a aproximadamente 38,8% da massa total injetada por dia (T ½ - 2.633 min.). As concentrações de crotoxina 'I ANTPOT. 131¿ relativamente altas existentes nos músculos e extremamente baixas o liquor e cérebro corroboram a hipótese de uma ação periférica para a crotoxina. Os rins foram os órgãos que apresentaram, no caso dos NÃO PROTEGIDOS, maior concentração de radioatividade... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador : Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-01T04:10:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ponce-Soto_LuisAlberto_M.pdf: 12886909 bytes, checksum: d45d6b46b5f324d21504b1ca07ebdfde (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Crotalus durissus collilineatus é uma serpente de grande importância médica na região Centro Oeste do Brasil. Desta forma justifica-se o interesse em isolar e caracterizar compostos como a crotoxina que representa a principal fração do veneno bruto, com importantes atividades farmacológicas. Aproximadamente 20 mg de veneno total foram aplicados em uma coluna Protein Pack SW 300 (0,78X30cm Waters) acoplada a um sistema HPLC (Waters) resultando no isolamento da crotoxina. Nessa fase o perfil cromatográfico não mostrou a fração correspondente á crotamina o que reforça a importância do estudo da crotoxina desse veneno. O isolamento das frações crotapotina e fosfolipase A2 a partir da crotoxina purificada foi realizado em uma coluna de fase reversa, C-18 J.l-Boundapak em HPLC. Quatro isoformas de crotapotina, sendo as isoformas F3 e F4 majoritariamente recuperadas e apenas uma de fosfolipase A2, (F6) foram purificadas com um alto grau de pureza segundo a caracterização bioquímica e estudos eletroforéticos como SDS-PAGE revelando a massa mo/ecular a crotoxina de 24 kDa e da PLA2 de 15 kDa e das crotapotinas F3 e F4 com 9 kDa. O estudo em forma cruzada do efeito inibitório das crotapotinas sobre as PLA2 provenientes de Cdcoll, Cdt e Cdcas, sugere que as diferenças estruturais são responsveis pelas diferenças no mecanismo de inibição. A caracterização cinética da fosfolipase A2 de Cdcoll evidencia um comportamento de enzima alostérica em nossas condições experimentais, dado não relatado ainda na literatura especializada. Este fato reforçou nosso interesse em estabelecer comparações entre outras fosfolipases dependentes de calcio provenientes de veneno de serpentes que possuam um comportamento michaeliano. O efeito neurotóxico do veneno total, crotoxina, isoformas de crotapotina (F3 e F4); assim como a fração, PLA2 (F6) isolados, suas reassociações com a PLA2 (F6) de Cdcoll, foi estudada em registros miográficos, em preparações nervo frênico-diafragma isolado de camundongo e biventer cervicis de pintainho. Evidenciou-se ainda que a reassociação das isoformas da crotapotina de Cdcoll (F3 e F4) e a PLA2 (F6) restabelece o efeito bloqueador neuromuscular característico da crotoxina nativa. Foram realizadas abordagens bioquímica e farmacológica comparando as duas isoformas de crotapotina (F3 e F4) e reassociação de ambas com a fosofolipase isolada da mesma crotoxina de Cdcoll, são resultados ainda não registrados na bibliografía. Portanto este trabalho é importante para comprender a integridade ou pureza dos componentes isolados, assim como para identificar o efeito neurotóxico. É importante ressaltar que a reassociação entre as isoformas de crotapotina e fosfolipase (PLA2) não implicou em perda do efeito biológico, o que mostra que a metodologia utilizada foi satisfatória para a purificação das proteínas, preservando a integridade estrutural e funcional das isoformas estudadas / Abstract: Crotalus durissus collilineatus is a serpent of great medical importance in the region Center West of Brazil. af this form the interest in isolating is justified and characterizing composites as the crotoxina like that they present the main fraction of the raw poison, with important pharmacology activities. Approximately 20 mg of total poison had been applied in a column Protein Pack SW 300 (0,78X30cm Waters) coupled to a system HPLC (Waters) resulting in the isolation of the crotoxina. In this phase the chromatographic profile did not show crotamina to the corresponding fraction a what it strengthens the importance of the study of the crotoxina of this poison. The isolation of the fractions crotapotina and fosfolipase A2 from the crotoxina purificaty was carried through in a phase column reversa, C-18 I-l-Boundapak in HPLC. Four. isoformas of crotapotina (F3 and F4) to greater recover, and only one of phospholipase A2, (F6) they had been purificatory with one high degree of pureness according to characterization electrophoretics biochemist and studies as SDS-PAGE disclosing relative the molecular mass of the 24 kDa crotoxina of 15 kDa PLA2 kDa and the crotapotinas F3 and F4 with 9 kDa respectively. The inibitory effect of the crotapotins on the PLA2 in crossed form proceeding from CdcolI, Cdt and Cdcas discloses to differences structured in the inhibition mechanism. The kinetic characterization of phospholipase A2 de Cdcoll evidences a alosteritic enzyme behavior in our experimental conditions, still dates not told in specialized literature. This fact strengthened our interest in establishing matchings among others fosfolipases dependents of calcio proceeding from poison of serpents that possess a michaeliano behavior. The neurotoxicity effect of the total poison, as well as of the crotoxina, beyond the components of the crotoxina; isoforms of crotapotina (F3 and F4); as well as the fraction, PLA2 (F6) isolated, as of of these reasociations with PLA2 (F6) of Cdcoll, was studied in miographics registers, red tapes isolated nerve frenic-diaphragm of mouse and to biventer cervicis of chick. It was still proven that the to reconstruct of isoformas of the crotapotina of Cdcoll (F3 and F4) and PLA2 (F6) commit the effect choke to neuromuscular characteristic of the native crotoxina. Boardíngs the two biochemist and pharmacology comparing isoformas of crotapotina (F3 and F4) and to reconstruct of both with phospholipase isolated of the same crotoxina of Cdcoll, still not registered in the bibliography, for in such a way this whork were important to comprender the integrity or purity of the isolatedcomponents, as well as identifying the neurotoxocity effect. It is important to resaltar that the to reconstruct enters isoformas of crotapotina and phospholipase (PLA2) did not imply in loss of the biological effect, what sample that the used methodology was satisfactory for the purification of proteins, preserving studied the structural and functional integrity of isoformas / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Julia Prado Franceschi, Stephen Hyslo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-23T06:36:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_MauraAntoniada_M.pdf: 1221291 bytes, checksum: 0f6f3631d0431cb70417e37cbdc6bc88 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: O objetivo deste estudo foi verificar a distribuição de proteínas imunológicamente semelhantes à crotoxina venenos botrópicos, e isolar e caracterizar, a partir do veneno de Bothrops jararacussu, a(s) proteína(s) com esta imunoreatividade. Utilizando um anticorpo anti¬crotoxina, verificamos através dos métodos de ELISA e "immunoblotting" que, de modo geral, os venenos botrópicos possuem um baixo conteúdo de proteínas imunológicamente relacionadas à crotoxina. O teste ELISA foi dez vezes mais sensível que o immunoblotting para demonstrar a relação imunológica destes veneno. Através de cromatografia por imunoafinidade, purificamos uma proteína do veneno de B. jararacussu que foi reconhecida pelo anticorpo anti-crotoxina. A eletroforese na presença de SDS mostrou que essa proteína possue uma massa molecular em tomo de 100 kDa e que, na presença de p-mercaptoetanol esse peso cai para a faixa de 30 kDa (região da crotoxina), sugerindo que a proteína normalmente ocorre em forma multimérica. A proteína purificada não possui atividade fosfolipásica, não causa bloqueio neuromuscular na preparação biventer-cervicis de pintainho e não corresponde à bothropstoxina I (BthTx) ou à lectina presentes neste mesmo veneno, uma vez que estas duas proteínas não reagiram com o anticorpo anti-crotoxina / Abstract: This thesis examines the distribution in Bothrops venoms of proteins immunologieally related to erotoxin and deseribes the purifieation and partia! eharaeterizatin of one sueh protein ftom the venom of Bothrops jararacussu. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and immunoblotting showed that Bothrops venoms generally possess few proteins that interaet with anti-erotoxin antibodies. The ELISA was generally more useful than immunoblotting for investigating these relationships beeause of its greater sensitivity. Immunoaflinity ehromatography of B. jararacussu venom on Sepharose 4B eoupled to anti-erotoxin antibodies yielded a protein with a of 100,000 by SDS-PAGE. Sinee in the presence of mercaptoetanol this MW decreased to 30 kDa (approx. MW of crotoxin), it seems likely that the protein normally exists in a multimeric formo The purified protein had no phospholipase aetivity nor did it produce neuromuscular blockade in the chick biventer cervicis preparation. This protein does not correspond to either bothropstoxin I or to a lectin isolated ftom this same venom sinee neither of the latter reacted with the anti-crotoxin antibody in the ELISA / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências Médicas

AMORA, Daniela Nascimento. Estudos dos efeitos renais do veneno da serpente Crotalus durrissus collilineatus. 2005. 100 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2005. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-09T16:25:34Z No. of bitstreams: 1 2005_dis_dnamora.pdf: 2079060 bytes, checksum: 4c0e0d1661e484a80753314f168cfcd4 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-12T12:12:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2005_dis_dnamora.pdf: 2079060 bytes, checksum: 4c0e0d1661e484a80753314f168cfcd4 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-12T12:12:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2005_dis_dnamora.pdf: 2079060 bytes, checksum: 4c0e0d1661e484a80753314f168cfcd4 (MD5) Previous issue date: 2005 / Crotalus durissus collilineatus is a snake usually found in semideciduous forest, the Cerrado region and its bites constitutes an important health problem. The most serious systemic change and primary cause of death is acute renal failure although the mecanisms of the damaging effects are not totally understood. We investigated the biological effects promoted by Crotalus durissus collilineatus crude venom and its fractions crotoxin and phopholipase A2. The toxic effects of C d collilineatus crude venom were evaluated by the histopathological analysis of organs such as heart, kidney, brain, lung and liver. Wistar rats were inoculated intraperitoneally with C d collilineatus crude venom. The liver showed steatosis and microvacuolation.The other organs showed normal morphological aspects. Renal effects were evaluated by the isolated perfused rat kidney method.The crude venom used at the lowest dose (10µg) increased perfusion pressure (PP), urinary flow (UF), and glomerular filtration rate (GFR), with maximal effect at 120min (PP: control(120) 110.3+/-3.69; venom(120) 126.8+/-10.2; UF: control(120) 0.19+/-0.03; venom(120) 0.23+/-0.06; GFR: control(120) 0.79+/-0.07; venom(120) 1.17+/-0.4). There was no effect on the percent of sodium tubular transport (%TNa+), the percent of potassium tubular transport (%TK+) and the percent of chloride tubular transport (%TCl-) The highest dose of the crude venom (30µg) caused a significantly decrease in PP (control(120) 110.3±3.69; venom(120) 96.7±8.1), RVR (control(120) 6.42±0.78; venom(120)4.8±0.56), UF (control(120) 0.19±0.03; venom(120) 0.12±0.01) and GFR (control(120) 0.79±0.07; venom(120)0.53±0.09). There was not effect on the percent of electrolytes tubular transport (%TNa+, %TK+ and %TCl-). Crotoxin (10mcg) produced a decrease in GFR (control(120) 0.79±0.07; crotoxin(120) 0.31±0.10), while PP, RVR and UF remained stable. Crotoxin also reduced %TK+ (control(120) 69.94±6.49; crotoxin(120) 33.28±4.78) and %TCl- (control(120) 79.53±2.67; crotoxin (120) 64.62±6.93) with maximal effect at 120min. Kidney perfused with phospholipase A2 (PLA2) showed a decrease in GFR (control(120) 0.79±0.07; PLA2 (120) 0.52±0.07) at 120min, whereas PP, RVR, UF and %TNa+ remained stable. PLA2 also reduced %TK+ (control(120) 69.94±6.49; PLA2 (120) 56.26±6.81) and %TCl- (control(60) 82.25±2.72; PLA2 (60) 75.04±4.26) at 60min. These results altogether indicate that Crotalus durissus collilineatus venom caused significative alterations in the renal parameters as well as hepatic damage. / A serpente Crotalus durissus collilineatus é encontrada na região do Cerrado e o acidente causado por esta espécie constitui um problema de saúde pública. A insuficiência renal aguda é a alteração sistêmica mais séria, apesar dos seus mecanismos não serem completamente esclarecidos. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos biológicos produzidos pelo veneno bruto de Crotalus durissus collilineatus e pelas frações crotoxina e fosfolipase A2. Foi realizado o estudo da toxicidade aguda do veneno bruto de C d collilineatus, através da análise histológica de coração, cérebro, rins, pulmões e fígado de ratos tratados com doses crescente do veneno. Nesse estudo foi observada a presença de alterações hepáticas como microvacualização e esteatose, enquanto os demais órgãos apresentaram aspectos normais. Os efeitos renais foram avaliados através do método de perfusão de rim isolado de rato. O veneno bruto, usado na dose de 10µg, causou um aumento na pressão de perfusão (PP), no fluxo urinário (FU) e no ritmo de filtração glomerular (RFG), com efeito máximo aos 120min (PP: controle(120) 110,3+/-3,69; veneno(120) 126,8+/-10,2;FU: controle(120) 0,19+/-0,03; veneno(120) 0,23+/-0,06; RFG: controle(120) 0,79+/-0,07; veneno(120) 1,17+/-0,4). Essa dose não produziu alterações no transporte tubular de sódio (%TNa+), potássio (%TK+) e de cloreto (%TCl-). A dose mais elevada de veneno bruto (30µg) causou um decréscimo significativo, com efeito máximo, aos 120min, na PP(controle(120) 110,3+/-3,69; veneno(120) 96,7+/-8,1), na RVR (controle(120) 6,42+/-0,78; veneno(120) 4,8+/-0,56), no FU (controle(120) 0,19+/-0,03; veneno(120) 0,12+/-0,01) e no RFG (controle(120) 0,79+/-0,07; veneno(120) 0,53+/-0,09). Não ocorreram alterações no transporte tubular de eletrólitos. A fração crotoxina não produziu alterações no RFG (controle(120) 0,79+/-0,07; crotoxina(120) 0,31+/-0,10). Esta fração também reduziu os %TK+ (controle(120) 69,94+/-6,49; crotoxina(120) 33,28+/-4,78) e %TCl- (controle(120) 79,53+/-2,67, crotoxina(120) 64,62+/-6,93). O grupo perfundido com FLA2 apresentou um decréscimo no RFG (controle(120) 0,79+/-0,07; FLA2 (120) 0,52+/-0,07), enquanto a PP, a RVR, o FU e o %TNa+ permaneceram estáveis. Foram observadas reduções no %TK+ aos 120min (controle(120) 69,94+/-6,49; FLA2(120) 56,26+/-6,81) e aos 60min, no %TCl- (controle(60) 82,25+/-2,72; FLA2(60) 75,04+/-4,26). Foi observada degeneração hidrópico vacuolar e a presença de material proteináceo nos túbulos renais, na análise histológica dos rins perfundidos tanto com veneno bruto quanto com as frações. Estes resultados indicam que o veneno de Crotalus durissus collilineatus causou alterações significativas nos parâmetros renais e nos aspectos morfológicos hepáticos.

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-29T00:01:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Beghini_DanielaGois_M.pdf: 6701245 bytes, checksum: f8e5f5c2c65a683c66f0576fe4912f89 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A serpente Crotalus durissus cascavel/a é encontrada no cerrado do nordeste do Brasil (BARRA VI ERA, 1990) e apesar de pouco estudada sua picada constitui um importante problema de saúde pública (MARTINS et aI., 1998). A crotoxina é um complexo heterodimérico com atividade de fosfolipase A2 sendo o principal componente neurotóxico do veneno da Cascavel Sul Americana Crotalus durissus terrificus. A crotoxina atua bloqueando a transmissão de impulsos nervosos na junção neuromuscular causando uma paralisia flácida nas vítimas. O complexo crotoxina consiste em uma fosfolipase A2 (PLA2), componente básico, e um componente ácido, não enzimático conhecido como crotapotina. Acrotoxina do veneno de C. d. terrificus tem sido extensivamente estudada, enquanto que a crotoxina de outros venenos de Crotalus durissus sp tem sido pouco investigada.O objetivo deste trabalho foi a caracterização bioquímica e biológica do veneno e da crotoxina de Crotaus durissus cascavel/a, permitindo também um melhor entendimento do complexo crotoxina (PLA2 e crotapotina). PLA2 e crotapotina, foram purificadas através de dois passos cromatográficos: cromatografia de exclusão molecular em Superdex G-75 e cromatografia em HPLC de fase reversa. A análise cromatográfica em HPLC de fase reversa revelou quatro isoformas de crotapotina (F2, F3, F4 e F5) e apenas uma PLA2 (F6) na crotoxina do veneno de C. d. cascavel/a. A crotoxina de C. d. terrificus, ao contrário, contém três isoformas de PLA2 (Cdt F15, F16 e F17) e somente duas isoformas de crotapotina (Cdt F5 e F7). O grau de pureza das frações foi confirmado pela eletroforese em PAGE-SDS-Tricina onde mostrou que PLA2 e crotapotina migram como uma única banda com massa molecular estimada de 15 kDa e 9 kDa, respectivamente. A composição de aminoácidos da PLA2 mostrou uma grande quantidade de resíduos de meia-cisteína e um alto conteúdo de resíduos básicos, enquanto que as crotapotinas F3 e IF4 mostraram maior quantidade de resíduos carregados negativamente. Para uma melhor caracterização bioquímica avaliou-se a cinética da enzima PLA2 de C. d. cascavel/a. A PLA2 mostrou um comportamento alostérico, com atividade máxima em pH 8,3 e 35-40°C. A PLA2 de C. d. cascavel/a requer Ca2+ para exibir sua atividade, mas foi inibida por Zn2+ e CU2+. Crotapotina e heparina inibiram a atividade catalítica da enzima atuando como inibidores alostéricos. Com o objetivo de estudar a atividade biológica do veneno e da crotoxina de C. d. cascavel/a foi verificado a neurotoxicidade em preparação nervo frênico-diafragma de camundongo e preparação biventer cervicis de pintainho. O veneno de C. d. cascavel/a aqui reportado, bem como seu componente crotoxina, apresentou potente atividade neurotóxica, principalmente em preparação biventer cervicis de pintainho. O estudo miográfico, portanto, revelou que a preparação biventer cervicis de pintainho é mais sensível ao efeito paralisante do veneno e crotoxina quando comparada à preparação nervo frênico-diafragma de camundongo. A principal conclusão deste trabalho é que o veneno de C. d. cascavel/a contém pelo menos quatro isoformas de crotoxina formadas por diferentes combinações das crotapotinas com uma única isoforma de PLA2. Essa situação difere da crotoxina do veneno de C. d. terrificus, onde a heterogeneidade resulta da presença de três ou quatro isoformas de PLA2. Desde que a toxicidade do veneno depende principalmente de seu conteúdo de crotoxina, a presença das isoformas pode contribuir para variações na potência da neurotoxicidade / Abstract: Crotalus durissus cascavel/a is a snake usually found in scrubland of Brazilian Northeast (BARRA VI ERA, 1990) and in spite of little studied its bite constitutes an important public health problem (MARTINS et aI., 1998). The crotoxin is a heterodimeric complex with phospholipase A2 activity and is the main neurotoxic component in venom of the South American rattlesnake Crotalus durissus terrifícus. Crotoxin acts blocking the transmission of nervous pulses in the neuromuscular junction causing a flaccid paralysis in the victims. The crotoxin complex consists of a phospholipase A2 (PLA2), basic component, and an acid component, nonenzymatic known as crotapotin. The crotoxin of the C. d. terrifícus venom has been studied extensively, while crotoxin of others Crotalus durissus sp venoms have been poorly investigated. The objective of this work was the biochemical and biological characterization of the venom and of the crotoxin of Crotaus durissus cascavel/a, also allowing a better understanding of the crotoxin complex (PLA2 and crotapotin). PLA2 and crotapotin, were purified through two chromatography's steps: molecular exclusion chromatography in Superdex G-75 and in HPLC of reverse phase. The chromatographyc analysis in HPLC of reverse phase revealed four crotapotin isoforms (F2, F3, F4 and F5) and just a PLA2 (F6) in the crotoxin of the C. d. cascavel/a venom. Crotoxin from C. d. terrifícus contained three PLA2 isoforms (Cdt F15, F16 and F17), but only two crotapotin isoforms (Cdt F5 e F7). The degree of purity of the fractions was confirmed by the electrophoresis in Page-SDS-Tricina that showed that PLA2 and crotapotin migrated as single band with estimated molecular masses of 15 kDa and 9 kDa, respectively. The composition of amino acids of PLA2 showed a great amount of residues of half-cysteines and a high content of basic residues, while the crotapotins F3 and F4 showed larger amount of residues carried negatively. For a better biochemical characterization, the kinetics of the enzyme PLA2 of C. d cascavella was evaluated. The PLA2 showed allosteric behavior, with maximal activity at pH 8,3 and 35-40°C. The C. d. cascavella PLA2 required Ca2+ for activity, but was inhibited by Cu2+ and Zn2+. Crotapotin and Heparin inhibited the catalytic activity of the enzyme by acting as allosteric inhibitors. Aiming to study the biological activity of the venom and of the crotoxin of C. d. cascavella the neurotoxicity was verified in the mouse phrenic nerve diaphragm preparation and chick biventer cervicis preparation. The C. d. cascavella venom here reported, as well as its crotoxin component, presented potent neurotoxic activity, mainly in chick biventer cervicis preparation. The myographic study also revealed remarkable differences in the sensibility of the mouse phrenic nerve diaphragm preparation and chick biventer cervicis preparation. The preparation mouse nerve-muscle was shown less sensitive to the action neuromuscular blocking of both crotoxin and total venom, when submitted to indirect stimulus. The main conclusion of this work it is that C. d. cascavella venom contains at least four crotoxin isoforms formed by different combinations of crotapotins with the single PLA2 isoform. This situation differs from that of crotoxin in C. d. terrificus venom, where the heterogeneity results from the presence of three or four PLA2 isoforms. Since the toxicity of the venom depends mainly on its content of crotoxin, the presence of isoforms may contribute to variations in neurotoxicity / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T11:36:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camara_PaulaRubyadeSouza_M.pdf: 3153329 bytes, checksum: fb99d8d7c48803cbe26b33c704d1c14c (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: o fracionamento do veneno total de Crotalus durissus terrificus (C.d.terrificus), Crotalus duríssus collilineatus (C.d.collilíneatus) e Crotalus durissus cascavella (C.d.cascavella) em coluna Superdex G-75 mostrou a presença de quatro picos principais. O pico reconhecido como crotoxina nas três espécies crotálicas foi purificado em HPLC de fase reversa, e mostrou a presença das isoformas de crotapotinas (CA) e fosfolipase A2 (PLA2), que variam quantitativamente entre os três venenos. A eletroforese também foi compatível quanto as regiões de massa molecular esperadas para a frações (Crtx, PLA2 e CA) dos três venenos, mostrando que há alta homogeneidade molecular entre as mesmas. O extravasamento plasmático evocado pela (CA; 1j../g/sítio) e (P_ ; O,5j../g/sítio) de C.d.terrificus, C.d.collílineatus e C.d.cascavells foi avaliado na microvasculatura de pele dorsal de ratos através do acúmulo local da mistura de albumina bovina marcada com 125 e azul de Evans, previamente administrada pela via endovenosa (e.v.). A injeção intradérmica (Ld.) das CA e PLA2 dos três venenos crotálicos induziu aumento na permeabilidade microvascular de maneira significativa para as PLA2s, mas não para as Caso tratamento prévio (30 min) com o antagonista de receptores de histamina e 5-HT (ciproheptadina; 2mg/Kg) inibiu significativamente o extravasamento plasmático evocado pelas PLA2 dos três venenos testados (0,5 j../g/sítio). O antagonista seletivo de receptores NK1 de taquicininas, SR140333 (1nmol/sítio), inibiu significativamente o extravasamento plasmático evocado pelas PLA2S. Em ratos neonatos tratados com capsaicina (50mg/Kg; s.c.), o extravasamento plasmático induzido pelas três PLA2S crotálicas foi significativamente inibido. Em resumo, nossos resultados fornecem evidências que PLA2S de C.d.terrlficus, C.d.coIlilineatus e C.d.cascavella podem atuar como substâncias neurogênicas próinflamatórios, enquanto que as CAs não têm papel semelhante / Abstract: The fractionament of the crude poison of Crotalus durissus terrificus (C.d.terrificus) , Crotalus durissus collilíneatus (C.d.coJlílíneatus) and Crotalus. durissus cascaveiJa (C.d.cascaveJ/a) in calumn Supherdex G-75 showed the presence of faur main picks. The pick recognized as crotoxina in the three species crotalics was purified in reverse phase HPLC , and showed the presence of the crotapotins (CA) and fosfolipase Az (PLAz) isoforms, that vary Quantitativamente amang the three poisans. The eletrofaresis was also compatible as the areas af molecular mass expected for the fractions (Crtx, PLA2 and CA) af the three poisans, showing that there is discharge malecular hamogeneity among them. Plasma extravasation evoked by the (CA; 1(Jg/site) and (PLA2; O,5jJg/site) af C.d.terrificus, C.d.colfilíneatus and C.d.cascavella was evaluated in the mierovasculature af rats dorsal skin through the local accumulation of the mixture of bovine albumin marked with 1125 and Evans bJue previously administered by the endovenosa road (e.v.). The intradermic injection (Ld.) of CA and PLA2 of the three erotalics poisons indueed an inerease in the mierovaseular permeability in a sígnificant way for PLA2S, but not for Caso Previous treatment (30 min) with histamine and 5HT receptor antagonist (ciproheptadina; 2mg/Kg; i.p.) inhibited the plasma extravasation signmcantJy evoked by PLA2 from the three venons tested (0,5 (Jglsíte). The takicinin NK1 receptor selective antagonist, SR140333 (1 nmol/site), inhibited the plasma extravasation significantly evoked by PLAzs. In neonatal capsaiein treated rats (50mglKg; s.e.), the plasma extravasation induced by three crotalics PLA2S was significantly inhibited. In summary, our results supply evidences that PLA2S trom C.d.terrificus, C.d.co/lilíneatus and C.d.cascaveJ/a can aet as proinflammatory neurogenics substances, while CAs don't have similar role / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T14:12:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nogueira_TatianeCristinadeAraujo_M.pdf: 6446233 bytes, checksum: b7dca032457cdd61b13fb51d4cca6714 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: As fosfolipases A2 (PLA2) desempenham importante papel no metabolismo de lipídios de membrana e estão intimamente relacionadas com a liberação de ácido araquidônico (AA), derivado dos lisofosfolípideos e estão presentes em diversos venenos extraídos de animais peçonhentos. A crotoxina é um composto extraído de venenos de cascavel e é constituída pela crotapotina e pela PLA2. A homologia das PLA2 de venenos com as dos mamíferos têm sido de grande utilidade no estudo de identificação de proteínas alvo, classificação de receptores de PLA2 endógenas e estudos funcionais de diferentes tecidos. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar o papel da crotoxina-like, extraída do veneno da cascavel Crotalus durissus collilineatus, e suas subunidades sobre a secreção de insulina por ilhotas de Langerhans, visando elucidar os mecanismos que estariam envolvidos na modulação da secreção de insulina em presença de diferentes agentes. Em experimentos realizados em ilhotas de Langerhans de ratos Wistar verificou-se que a crotoxina potencializa a secreção de insulina estimulada por 16.7 mM de glicose e este efeito é devido à subunidade PLA2 presente nesta toxina,uma vez que a crotapotina não afetou a secreção de insulina estimulada por glicose. Além disso, a PLA2 do veneno induziu aumento da secreção de insulina de maneira dose-dependente. A adição de glicose marcada na ausência de PLA2 induziu um aumento de liberação de 14CO2 de 30 ± 0.6 pmol/ilhota/90 min que foi similar aos valores obtidos na presença de PLA2 (32 ±1. 7 pmol/ilhota/min) Nifedipina (10 mM), um bloqueador de canais de cálcio, reduziu a secreção de insulina estimulada por potássio, mas não afetou a potencialização da secreção de insulina pela PLA2. O bloqueador de canais de sódio, tetrodotoxina (TTX) na concentração de 10 mM não alterou o aumento da secreção de insulina induzido pela PLA2. A quelação de cálcio extracelular por EGT A (0,5 mM) também não afetou a potencialização da secreção de insulina nas ilhotas de Langerhans de ratos estimulada pela PLA2. Estes resultados mostram que os mecanismos pelos quais a PLA2 eleva a secreção de insulina em ilhotas de Langerhans de ratos não envolvem o metabolismo da glicose, a ativação de canais de cálcio e sódio e a participação direta dos íons cálcio do meio extracelular. No entanto, a secreção de insulina potencializada pela PLA2 foi significativamente atenuada tanto pela incubação prévia das ilhotas de Langerhans com heparina (5 UI/m1) quanto pela adição de dexametasona (5 e 10 mM). Paralelo a potencialização da secreção de insulina, um aumento significativo do efluxo de ácido araquidônico foi observado em ilhotas de Langerhans de ratos em presença de PLA2. Assim, estes achados sugerem que a potencialização da secreção de insulina induzida pela PLA2 em baixa concentração ou concentração supralimiar de glicose está possivelmente relacionada com a mobilização de ácido araquidônico / Abstract: The crotoxin results from phospholipase A2 (PLA2) and crotapotin interaction. The PLA: acts in the membrane phospholipids generating arachidonic acid (AA). Venom PLA2 has been used as a pharmacological tool to identify target protein, mammalian receptor, and physiological cellular function. Therefore, the aim of this work was to study the role of crotoxin-like from Crotalus durissus colfjfjneatus and its subunits on the insulin secretion of the isolated rat Langerhans islets. Also, we investigated the underlying mechanisms by which the venom PLA2 would evoke insulin secretion in the presence of insulinotropic agents. Our experiments demonstrated that insulin secretion was potentialized by crotoxin in a dose-dependent manner in presence of low and high glucose concentration and this effect is related to PLA2. Neither glucose metabolism nor ionic channels (Ca+2 and Na+ channels) are involved in the enhancement of insulin secretion induced by PLA2 in isolated Langerhans islets since label glucose, nifedipine (10 mM) and tetrodotoxin (10 mM) did not affect this response. EGT A also did not interfere with the potentiation of insulin secretion induced PLA2 showing that extracellular calcium is not directly involved in this phenomenon. However, heparin and dexametasone significantly attenuated the increase of insulin secretion in response to PLA2.Moreover, the efflux of AA was markedly increased in parallel to enhancement of insulin secretion in isolated rat Langerhans islets. In conclusion, these findings show that the potentiation of insulin secretion induced by PLA2 in presence of glucose may be related to AA mobilization of Langerhans islets from rats / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Daniel Carvalho Pimenta / Resumo: O veneno de Crotalus durissus terrificus (Cdt), baseado no critério do perfil da cromatografia de exclusão molecular, pode ser descrito como sendo composto de quatro principais toxinas: Giroxina, Crotamina, Crotoxina e Convulxina. A crotoxina é uma neutoroxina, é um heterodímero não covalente, composta por duas subunidades: fosfolipase A2 (PLA2) e crotapotina (Ctp). A crotapotina constitui o componente da crotoxina que apresenta atividade anti-inflamatória além de ser chaperona de PLA2. Esta molécula é constituída por três cadeias peptídicas ligadas por pontes dissulfeto. Além disso, já foram descritas isoformas para a crotapotina. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método cromatográfico para isolar a crotapotina, separar suas cadeias e analisá-las por LC/MS e LC-MS/MS para análise proteômica e/ou seqüenciamento de novo e avaliação da possível existência de um padrão de variação nas substituições de aminoácidos. O método C8-RP-HPLC foi capaz de separar os componentes do veneno de Cdt que puderam ser identificados por espectrometria de massas, de acordo com a sua massa molecular. A crotapotina foi isolada, reduzida e alquilada e submetida à outra separação cromatográfica RP-HPLC (C18) para isolamento das subunidades alquiladas. Conforme descrito na literatura, a cadeia α da crotapotina é composta por 40 resíduos de aminoácidos, enquanto que a cadeia β possui 35 resíduos e a cadeia γ 14, pelo que as subunidades podem ser identificadas pelas suas massas moleculares. As a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Crotalus durissus terrificus venom (Cdt), based on molecular size chromatography, can be described as being composed of four main toxins: Giroxin, Crotamine, Crotoxin and Convulxin. Crotoxin is a neutoroxin, a non-covalent heterodimer composed of two subunits: phospholipase A2 (PLA2) and crotapotin (Ctp). Crotapotin is the component of crotaxin that has anti-inflammatory activity besides being a PLA2 chaperone. This molecule consists of three peptide chains linked by disulfide bonds. In addition, isoforms for crotapotin have been described. The objective of this study was to develop a chromatographic methodology to isolate a crotapotin, separate its chains and analyze by LC/MS and LC-MS/MS for proteomic analysis and/or de novo sequencing and evaluation of the possibility of a variation pattern amino acid substitutions. The C8-RPHPLC method was able to separate the Cdt venom components that could be identified by mass spectrometry, according to their molecular mass. The crotapotin was isolated, reduced and alkylated and subjected to another RP-HPLC (C18) chromatographic separation for isolation of the alkylated subunits. As described in the literature, the α chain of crotapotin is composed of 40 amino acid residues, while the β chain has 35 residues and the γ chain, 14, and thus the subunits can be identified by their molecular masses. The analyzes of isolated chains of crotapotin showed the presence of more than one molecule per fraction, indicating the presence of isofor... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Lea Rodrigues Simioni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T07:49:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 OliveiraeSilva_SaraguaciHernandezde_D.pdf: 978243 bytes, checksum: 7e35557ec13bc4cdfff9957cdfcaf502 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Este trabalho está dividido em três momentos, o primeiro trata-se de um estudo comparativo do efeito dos venenos brutos de Crotalus durissus terrificus; C. d. ruruima; C. d. cascavella e C. d. collilineatus, bem como da crotoxina e da crotamina sobre a junção neuromuscular. O veneno C. d. ruruima foi purificado pela primeira vez através de HPLC em uma coluna Protein Pack SW 300, onde foi obtida a crotoxina e a crotamina (os demais venenos já foram purificados e os dados publicados). O estudo neurotóxico foi realizado em duas preparações nervo-frênico diafragma de camundongo e biventer cervicis de pintainho. Dos experimentos realizados em mamíferos e aves obteve-se o efeito neurotóxico esperado nas concentrações de 10 mg/ml. Os venenos brutos e as crotoxinas das serpentes C. d. terrificus e C. d. ruruima em preparações de mamífero produziram aumento da amplitude seguido de bloqueio total da resposta contrátil, diferentemente dos venenos e das crotoxinas das serpentes C. d. cascaavella e C. d. collilineatus, que causaram apenas bloqueio total neuromuscular. Em preparações de aves os quatro venenos e crotoxinas estudados induziram bloqueio total, porém sem causar facilitação. As crotaminas-positivas, estudadas em nervo-frenico diafragma de camundongo das serpentes C. d. terrificus e C. d. ruruima, na concentração de 10 mg/ml, causaram efeito facilitatório retornando à amplitude controle após 120 min de incubação. Ao recombinar a crotoxina 10 mg/ml e crotamina 5 mg/ml houve o aumento da amplitude seguido de bloqueio total da resposta contrátil. Nas preparações ensaiadas em aves, apresentou um efeito facilitatório fugaz seguido de bloqueio neuromuscular total. No segundo momento, as isoformas de crotapotina e PLA2 isoladas a partir da crotoxina dos venenos das serpentes de C. d. terrificus, C. d. cascavella e C. d. collilineatus, foram ensaiadas em mamíferos e aves nas concentrações de 10 mg/ml. As crotapotinas e PLA2 isoladas não causaram diferenças significativas em relação ao controle em preparações de mamíferos. O mesmo não ocorrendo com as PLA2 testadas em aves que causaram bloqueio neuromuscular, efeito este não esperado. Após a recombinação (5 mg/ml crotapotina) + (5 mg/ml PLA2), o complexo crotoxina causou bloqueio neuromuscular total em ambas preparações. Na terceita etapa deste trabalho, foram produzidos antivenenos específicos contra o veneno bruto e crotoxina do veneno C. d ruruima e PLA2 do veneno de C. d. collilineatus. O título de anticorpos e a especificidade dos antivenenos produzidos foram avaliados por ELISA. A neutralização da atividade neurotóxica foi avaliada em preparações biventer cervicis de pintainho. A capacidade neutralizante dos antivenenos produzidos em coelhos foi comparável ao soro anticrotálico comercial contra o veneno e crotoxina na proporção 1:1. O veneno, a crotoxina e os antivenenos estudados induziram liberação de CK significativamente diferente do controle / Abstract: This work is divided at three moments, the first one if terrificus deals with a comparative study of the effect of the crude venoms of Crotalus durissus; C. d. ruruima; C. d. cascavella and C. d. collilineatus, as well as of the crotoxin and the crotamine on the junction neuromuscular. Venoms C. d. ruruima was purified for the first time through HPLC in a column Protein Pack sw 300, where it was gotten the crotoxin and the crotamine (the too much venoms already had been purified and the published data). The neurotoxic study nerve-frênico was carried through in two preparations diaphragm of mouse and to chick biventer cervicis. The experiments carried through in mammals and birds the waited neurotoxic effect in the was gotten concentrations of 10 mg/ml. The crude venoms and the crotoxin of rastnaks C. d. terrificus and C. d. ruruima in preparations of mammal had produced increase of the followed amplitude of complete blockade of the contractil reply, differently of the venoms and the crotoxin of rastnakes C. d. cascavella and C. d. collilineatus, that they had caused only complete blockade to neuromuscular. In preparations of birds the four studied venoms and crotoxin had induced complete blockade, however without causing facilitation. The crotamine-positive, studied in nerve-frenico diaphragm of mouse of snakes C. d. terrificus and C. d. ruruima, in the concentration of 10 mg/ml, had caused facilitatori effect returning to the 120 after amplitude have controlled min of incubation. When crotoxin being recombined 10 mg/ml and 5 crotamine mg/ml had the increase of the followed amplitude of complete blockade of the contractil reply. In the preparations assayed in birds, fast followed of blockade presented a facilitatori effect to neuromuscular complete. At as the moment, isoforms of isolated crotapotin and PLA2 from the crotoxin of the venoms of the rastnakes of C. d. terrificus, C. d. cascavella and C. d. collilineatus, had been assayed in mammals and birds in the concentrations of 10 mg/ml. Isolated crotapotin and PLA2 had not caused significant differences in relation to the control in preparations of mammals. The same not occurring with the PLA2 tested in birds that blockade caused to neuromuscular, effect this not waited. After the recombination (5 mg/ml crotapotin) + (5 mg/ml PLA2), the crotoxin complex caused blockade to neuromuscular complete in both preparations. In the third stage of this work, specific antivenoms against crotoxin the crude venoms and of C. d. ruruima had been produced and PLA2 of the poison of C. d. collilineatus. The heading of antibodies and the especific of the produced antivenoms had been evaluated by ELISA. The neutralization of the neurotoxic activity was evaluated in preparations to chick biventer cervicis. The neutralizing capacity of the antivenoms produced in rabbits was comparable to commercial the anticrotalic serum against the venoms and crotoxin in ratio 1:1. The venoms, the crotoxin and the antivenoms, studied had induced significantly different release of CK of the control / Doutorado / Doutor em Farmacologia