A produção de soro no Brasil, único tratamento eficaz nos casos de acidentes ofídicos, utiliza equinos que apesar do grande porte, apresentam diminuição da longevidade quando comparado com os cavalos não imunizados. A radiação ionizante tem se mostrado como excelente ferramenta na diminuição da toxicidade de venenos e toxinas isoladas, além de promover a obtenção de melhores imunógenos para a produção de soro. Sabe-se, contudo, que os efeitos da radiação ionizante em materiais protéicos caracterizam-se por diversas alterações químicas, como fragmentação, cross-linking, agregação e oxidação devido aos produtos gerados pela radiólise da água. Porém, a ação da radiação gama em toxinas ainda não está totalmente esclarecida do ponto de vista estrutural e farmacológico, fato que impede a aplicação de tal metodologia no processo de produção do soro. Assim, foi proposto nesse trabalho a caracterização da crotamina, uma das principais proteínas do veneno da espécie Crotalus durissus terrificus, irradiada com raios gama de 60Co. Após o isolamento da toxina por técnicas cromatográficas e a realização de testes para comprovar a obtenção da crotamina pura, a toxina, nos estados nativo e irradiado, foi submetida às análises estruturais de Fluorescência e Dicroísmo Circular. Testes utilizando altas pressões hidrostáticas também foram realizados com o intuito de verificar se as alterações conformacionais causadas pela radiação sofreriam modificações sob altas pressões. Do ponto de vista farmacológico, testes de contração muscular foram realizados com o objetivo de delimitar a ação da crotamina em musculatura lisa, bem como a mudança na ação da toxina frente às alterações estruturais ocasionadas. As análises de Fluorescência e Dicroísmo Circular mostraram que há mudanças na conformação da crotamina quando submetida à radiação gama e que tais alterações possivelmente ocorrem na estrutura terciária e secundária da proteína. O observado nos testes farmacológicos mostraram que a crotamina irradiada foi menos eficaz na diminuição da contração muscular do ducto deferente de ratos em comparação com a crotamina nativa. Além disso, o comportamento da toxina irradiada na contração tônica, modulada por noradrenalina, foi distinto daquele observado para a toxina nativa. / The serum production in Brazil, the only effective treatment in cases of snakebites, uses horses that although large size, have reduced llifespan compared with horses not immunized. Ionizing radiation has been shown as an excellent tool in reducing the toxicity of venoms and toxins isolated, and promote the achievement of better immunogens for serum production, and contributing to the welfare of serum-producing animals. It is known, however, that the effects of ionizing radiation on protein are characterized by various chemical modifications, such as fragmentation, cross-linking due to aggregation and oxidation products generated by water radiolysis. However, the action of gamma radiation on toxins is not yet fully understood structurally and pharmacologically, a fact that prevents the application of this methodology in the serum production process. So we proposed in this paper the characterization of crotamine, an important protein from the venom of Crotalus durissus terrificus species, irradiated with 60Co gamma rays. After isolating the toxin by chromatographic techniques and testing to prove the obtaining of pure crotamine, it was irradiated with gamma rays and subjected to structural analysis, Fluorescence and Circular Dichroism. Using high hydrostatic pressure tests were also conducted in order to verify that the conformational changes caused by radiation suffer modifications under high pressures. From the pharmacological point of view, muscle contraction tests were conducted with the objective of limiting the action of crotamine in smooth muscle as well as the change in the action of toxin caused structural changes to the front. Analysis of Circular Dichroism and Fluorescence showed changes in structural conformation of crotamine when subjected to gamma radiation and that such changes possibly occurring in the secondary and tertiary structure of the protein. The observed in pharmacological tests showed that the irradiated crotamine was less effective in lowering the vas deferens twitch in rats in comparison to native crotamine. In addition, the behavior of irradiated toxin in tonic contraction, modulated by noradrenaline, was different from that observed for the native toxin.

A produção de soro no Brasil, único tratamento eficaz nos casos de acidentes ofídicos, utiliza equinos que apesar do grande porte, apresentam diminuição da longevidade quando comparado com os cavalos não imunizados. A radiação ionizante tem se mostrado como excelente ferramenta na diminuição da toxicidade de venenos e toxinas isoladas, além de promover a obtenção de melhores imunógenos para a produção de soro. Sabe-se, contudo, que os efeitos da radiação ionizante em materiais protéicos caracterizam-se por diversas alterações químicas, como fragmentação, cross-linking, agregação e oxidação devido aos produtos gerados pela radiólise da água. Porém, a ação da radiação gama em toxinas ainda não está totalmente esclarecida do ponto de vista estrutural e farmacológico, fato que impede a aplicação de tal metodologia no processo de produção do soro. Assim, foi proposto nesse trabalho a caracterização da crotamina, uma das principais proteínas do veneno da espécie Crotalus durissus terrificus, irradiada com raios gama de 60Co. Após o isolamento da toxina por técnicas cromatográficas e a realização de testes para comprovar a obtenção da crotamina pura, a toxina, nos estados nativo e irradiado, foi submetida às análises estruturais de Fluorescência e Dicroísmo Circular. Testes utilizando altas pressões hidrostáticas também foram realizados com o intuito de verificar se as alterações conformacionais causadas pela radiação sofreriam modificações sob altas pressões. Do ponto de vista farmacológico, testes de contração muscular foram realizados com o objetivo de delimitar a ação da crotamina em musculatura lisa, bem como a mudança na ação da toxina frente às alterações estruturais ocasionadas. As análises de Fluorescência e Dicroísmo Circular mostraram que há mudanças na conformação da crotamina quando submetida à radiação gama e que tais alterações possivelmente ocorrem na estrutura terciária e secundária da proteína. O observado nos testes farmacológicos mostraram que a crotamina irradiada foi menos eficaz na diminuição da contração muscular do ducto deferente de ratos em comparação com a crotamina nativa. Além disso, o comportamento da toxina irradiada na contração tônica, modulada por noradrenalina, foi distinto daquele observado para a toxina nativa. / The serum production in Brazil, the only effective treatment in cases of snakebites, uses horses that although large size, have reduced llifespan compared with horses not immunized. Ionizing radiation has been shown as an excellent tool in reducing the toxicity of venoms and toxins isolated, and promote the achievement of better immunogens for serum production, and contributing to the welfare of serum-producing animals. It is known, however, that the effects of ionizing radiation on protein are characterized by various chemical modifications, such as fragmentation, cross-linking due to aggregation and oxidation products generated by water radiolysis. However, the action of gamma radiation on toxins is not yet fully understood structurally and pharmacologically, a fact that prevents the application of this methodology in the serum production process. So we proposed in this paper the characterization of crotamine, an important protein from the venom of Crotalus durissus terrificus species, irradiated with 60Co gamma rays. After isolating the toxin by chromatographic techniques and testing to prove the obtaining of pure crotamine, it was irradiated with gamma rays and subjected to structural analysis, Fluorescence and Circular Dichroism. Using high hydrostatic pressure tests were also conducted in order to verify that the conformational changes caused by radiation suffer modifications under high pressures. From the pharmacological point of view, muscle contraction tests were conducted with the objective of limiting the action of crotamine in smooth muscle as well as the change in the action of toxin caused structural changes to the front. Analysis of Circular Dichroism and Fluorescence showed changes in structural conformation of crotamine when subjected to gamma radiation and that such changes possibly occurring in the secondary and tertiary structure of the protein. The observed in pharmacological tests showed that the irradiated crotamine was less effective in lowering the vas deferens twitch in rats in comparison to native crotamine. In addition, the behavior of irradiated toxin in tonic contraction, modulated by noradrenaline, was different from that observed for the native toxin.

A análise de proteínas como redes é uma ferramenta poderosa para compreender as suas propriedades e a importância relativa de seus resíduos. Nesta análise, os resíduos que interagem entre si, covalentemente ou não, são chamados conectados. Nesta abordagem, alguns resíduos contribuem mais fortemente para manter as propriedades da rede, sendo chamados de centrais. Diversos trabalhos têm apontado que resíduos centrais da Rede de Estrutura Proteica também são importantes nas propriedades das proteínas, desempenhando papéis na catálise, estabilidade térmica e alosteria. No entanto, existe falta de trabalhos desenhados de forma sistemática para confirmar esta hipótese. Neste sentido, esta tese tem como objetivo avaliar se existe correlação entre a centralidade dos resíduos de uma enzima, a beta-glicosidase de Spodoptera frugiperda, Sfβgli, e a importância destes resíduos na determinação das suas propriedades. Para isso, foram utilizadas duas abordagens (capítulo 1): Na primeira, os resíduos centrais foram diretamente perturbados substituindo-os, através de mutação sítio-dirigida, por alanina. Na segunda, perturbações no resíduo central foram feitas modificando a vizinhança deste resíduo através de mutações que introduziram ou removeram volume de seu entorno. A partir disso, foi avaliado se estas perturbações afetaram as propriedades Sfβgli. De forma geral, foi observado (capítulo 2) que as perturbações nos resíduos centrais por ambas abordagens afetam significativamente a termoestabilidade da proteína, reduzindo a sua Tm em até 15°C e aumentando a velocidade de sua desnaturação térmica em até mais de 20 vezes. Além disso, a atividade catalítica de Sfβgli é reduzida por estas perturbações (capítulo 3), sendo que este efeito e a perda da termoestabilidade parecem resultar da mesma causa, a perturbação do resíduo central. No capítulo 4, a investigação do estado oligomérico da Sfβgli por SAXS revelou que esta ocorre preponderantemente como dímero em citrato-fosfato 100 mM pH 6,0, mas como um grande oligômero, possivelmente um dodecâmero, em fosfato 10 mM pH 6,0. Paralelamente foi demonstrado que Sfβgli passa por uma ativação quando em tampão fosfato 10 mM, convergindo para as propriedades cinéticas de Sfβgli em citrato-fosfato 100 mM. Redes de Estrutura Proteica foram produzidas considerando-se também a interação entre as cadeias polipeptídicas constituintes de oligômeros de Sfβgli (dímeros, tetrâmeros e hexâmeros). Assim, observou-se que cinco resíduos são sempre centrais por betweeness, mesmo considerando diferentes oligomêros da Sfgli. Destes, E187, P188 e N329 desempenham papéis conhecidos na catálise e S247 e N249 foram caracterizados nesta tese. Por fim, no capítulo 5, analisando a centralidade dos resíduos da Rede Estrutural da Sfβgli, observa-se uma preponderante presença de resíduos centrais por CΔLp, closeness e betweeness no topo do beta-barril, demonstrando que esta região é muito próxima dos demais resíduos da proteína. Além disso, uma análise da centralidade dos resíduos de 21 beta-glicosidases GH1 revelou que resíduos centrais por closeness são bastante conservados, sendo encontrados predominantemente no sítio ativo destas enzimas, enquanto que dentre os centrais por betweeness há variabilidade. Portanto os resultados apresentados nesta tese suportam experimentalmente a hipótese de que a centralidade dos resíduos na Rede de Estrutura Proteica é correlacionada com propriedades funcionais das proteínas. / Analysis of protein structures as networks has been shown a powerful tool to understand their properties and to identify important residues. In the network analysis, residues that interact with each other are called connected. Some residues are essential to shorten the connection pathways between distant residues in the protein structure, being called central. Central residues have been proposed to have important roles in catalysis, thermal stability and allostery. In order to experimentally assess the correlation between the residue centrality and its importance in the protein properties, we use two approaches (chapter 1): The first one is to make single mutations at the central residues of a betaglucosidase Sfβgly, changing those residues to alanine. The second one is to perturb a central residue (F251) by changing its environment through single mutations that introduces voids or additional volume. Next, we evaluate how those mutations affect the protein thermostability and function. In general, we have observed (chapter 2) that mutations at central residues reduce the Tm in 2 - 15°C and increase the unfolding rate up to 20 times, suggesting that damages in the central residues make the protein more unstable. Moreover, we have observed (chapter 3) that the perturbation of the central residues reduces Sfβgly catalysis, which seems to arise from the same cause that lead to the loss of thermal stability. Besides that, in chapter 4, the investigation of oligomeric state of Sfgli using SAXS indicated that this protein is mainly a dimer in 100 mM citrate-phosphate pH 6,0, whereas it forms large oligomers, possibly dodecamers, in 10 mM phosphate pH 6,0. In parallel it was shown that Sfβgly undergoes an activation process in 10 mM phosphate and its kinetic parameters converge to those observed for Sfβgly in 100 mM citrate-phosphate. Protein Structural Networks were built considering also that there are links between the polypeptidic chains of the Sfβgly oligomers. We observed 5 residues that are central in all kind of oligomeric structures here analyzed. Three of these residues, E187, P188 and N329, play important roles in the catalysis of this enzyme, and two of them (S247 and N249 are described in this thesis. Lastly, in the chapter 5, we observed that central residues by closeness, betweeness and CΔLp are concentrated at the top of the beta-barrel (C-terminal end of the beta-strands and subsequent loops), suggesting that this region, where the active site is placed, is close, in terms of contacts, to the whole Sfβgly structure. Moreover, we have built the Protein Structural Network of 21 beta-glucosidases of the Glucoside Hydrolases family 1, revealing that the closeness central residues are highly conserved, being located in the active site of these enzymes. On the other hand, betweeness central residues are located in the same sites in the structure of different beta-glucosidases, but they are not always conserved. Shortly, these data experimentally support the hypothesis that the residue centrality in Protein Structural Network is correlated with the protein properties, as catalysis and stability.

A análise de proteínas como redes é uma ferramenta poderosa para compreender as suas propriedades e a importância relativa de seus resíduos. Nesta análise, os resíduos que interagem entre si, covalentemente ou não, são chamados conectados. Nesta abordagem, alguns resíduos contribuem mais fortemente para manter as propriedades da rede, sendo chamados de centrais. Diversos trabalhos têm apontado que resíduos centrais da Rede de Estrutura Proteica também são importantes nas propriedades das proteínas, desempenhando papéis na catálise, estabilidade térmica e alosteria. No entanto, existe falta de trabalhos desenhados de forma sistemática para confirmar esta hipótese. Neste sentido, esta tese tem como objetivo avaliar se existe correlação entre a centralidade dos resíduos de uma enzima, a beta-glicosidase de Spodoptera frugiperda, Sfβgli, e a importância destes resíduos na determinação das suas propriedades. Para isso, foram utilizadas duas abordagens (capítulo 1): Na primeira, os resíduos centrais foram diretamente perturbados substituindo-os, através de mutação sítio-dirigida, por alanina. Na segunda, perturbações no resíduo central foram feitas modificando a vizinhança deste resíduo através de mutações que introduziram ou removeram volume de seu entorno. A partir disso, foi avaliado se estas perturbações afetaram as propriedades Sfβgli. De forma geral, foi observado (capítulo 2) que as perturbações nos resíduos centrais por ambas abordagens afetam significativamente a termoestabilidade da proteína, reduzindo a sua Tm em até 15°C e aumentando a velocidade de sua desnaturação térmica em até mais de 20 vezes. Além disso, a atividade catalítica de Sfβgli é reduzida por estas perturbações (capítulo 3), sendo que este efeito e a perda da termoestabilidade parecem resultar da mesma causa, a perturbação do resíduo central. No capítulo 4, a investigação do estado oligomérico da Sfβgli por SAXS revelou que esta ocorre preponderantemente como dímero em citrato-fosfato 100 mM pH 6,0, mas como um grande oligômero, possivelmente um dodecâmero, em fosfato 10 mM pH 6,0. Paralelamente foi demonstrado que Sfβgli passa por uma ativação quando em tampão fosfato 10 mM, convergindo para as propriedades cinéticas de Sfβgli em citrato-fosfato 100 mM. Redes de Estrutura Proteica foram produzidas considerando-se também a interação entre as cadeias polipeptídicas constituintes de oligômeros de Sfβgli (dímeros, tetrâmeros e hexâmeros). Assim, observou-se que cinco resíduos são sempre centrais por betweeness, mesmo considerando diferentes oligomêros da Sfgli. Destes, E187, P188 e N329 desempenham papéis conhecidos na catálise e S247 e N249 foram caracterizados nesta tese. Por fim, no capítulo 5, analisando a centralidade dos resíduos da Rede Estrutural da Sfβgli, observa-se uma preponderante presença de resíduos centrais por CΔLp, closeness e betweeness no topo do beta-barril, demonstrando que esta região é muito próxima dos demais resíduos da proteína. Além disso, uma análise da centralidade dos resíduos de 21 beta-glicosidases GH1 revelou que resíduos centrais por closeness são bastante conservados, sendo encontrados predominantemente no sítio ativo destas enzimas, enquanto que dentre os centrais por betweeness há variabilidade. Portanto os resultados apresentados nesta tese suportam experimentalmente a hipótese de que a centralidade dos resíduos na Rede de Estrutura Proteica é correlacionada com propriedades funcionais das proteínas. / Analysis of protein structures as networks has been shown a powerful tool to understand their properties and to identify important residues. In the network analysis, residues that interact with each other are called connected. Some residues are essential to shorten the connection pathways between distant residues in the protein structure, being called central. Central residues have been proposed to have important roles in catalysis, thermal stability and allostery. In order to experimentally assess the correlation between the residue centrality and its importance in the protein properties, we use two approaches (chapter 1): The first one is to make single mutations at the central residues of a betaglucosidase Sfβgly, changing those residues to alanine. The second one is to perturb a central residue (F251) by changing its environment through single mutations that introduces voids or additional volume. Next, we evaluate how those mutations affect the protein thermostability and function. In general, we have observed (chapter 2) that mutations at central residues reduce the Tm in 2 - 15°C and increase the unfolding rate up to 20 times, suggesting that damages in the central residues make the protein more unstable. Moreover, we have observed (chapter 3) that the perturbation of the central residues reduces Sfβgly catalysis, which seems to arise from the same cause that lead to the loss of thermal stability. Besides that, in chapter 4, the investigation of oligomeric state of Sfgli using SAXS indicated that this protein is mainly a dimer in 100 mM citrate-phosphate pH 6,0, whereas it forms large oligomers, possibly dodecamers, in 10 mM phosphate pH 6,0. In parallel it was shown that Sfβgly undergoes an activation process in 10 mM phosphate and its kinetic parameters converge to those observed for Sfβgly in 100 mM citrate-phosphate. Protein Structural Networks were built considering also that there are links between the polypeptidic chains of the Sfβgly oligomers. We observed 5 residues that are central in all kind of oligomeric structures here analyzed. Three of these residues, E187, P188 and N329, play important roles in the catalysis of this enzyme, and two of them (S247 and N249 are described in this thesis. Lastly, in the chapter 5, we observed that central residues by closeness, betweeness and CΔLp are concentrated at the top of the beta-barrel (C-terminal end of the beta-strands and subsequent loops), suggesting that this region, where the active site is placed, is close, in terms of contacts, to the whole Sfβgly structure. Moreover, we have built the Protein Structural Network of 21 beta-glucosidases of the Glucoside Hydrolases family 1, revealing that the closeness central residues are highly conserved, being located in the active site of these enzymes. On the other hand, betweeness central residues are located in the same sites in the structure of different beta-glucosidases, but they are not always conserved. Shortly, these data experimentally support the hypothesis that the residue centrality in Protein Structural Network is correlated with the protein properties, as catalysis and stability.

O processo de auto-organização da estrutura proteica a partir da cadeia de aminoácidos é conhecido como enovelamento. Apesar de conhecermos a estrutura tridimencional de muitas proteínas, para a maioria delas, não possuímos uma compreensão suficiente para descrever em detalhes como a estrutura se organiza a partir da sequência de aminoácidos. É bem conhecido que a formação de núcleos de estruturas locais, conhecida como estrutura secundária, apresenta papel fundamental no enovelamento final da proteína. Desta forma, o desenvolvimento de métodos que permitam não somente predizer a estrutura secundária adotada por um dado resíduo, mas também, a maneira como esse processo deve ocorrer ao longo do tempo é muito relevante em várias áreas da biologia estrutural. Neste trabalho, desenvolvemos dois métodos de predição de estruturas secundárias utilizando modelos com o potencial de fornecer informações mais detalhadas sobre o processo de predição. Um desses modelos foi construído utilizando autômatos celulares, um tipo de modelo dinâmico onde é possível obtermos informações espaciais e temporais. O outro modelo foi desenvolvido utilizando redes neurais residuais profundas. Com este modelo é possível extrair informações espaciais e probabilísticas de suas múltiplas camadas internas de convolução, o que parece refletir, em algum sentido, os estados de formação da estrutura secundária durante o enovelamento. A acurácia da predição obtida por esse modelo foi de ~78% para os resíduos que apresentaram consenso na estrutura atribuída pelos métodos DSSP, STRIDE, KAKSI e PROSS. Tal acurácia, apesar de inferior à obtida pelo PSIPRED, o qual utiliza matrizes PSSM como entrada, é superior à obtida por outros métodos que realizam a predição de estruturas secundárias diretamente a partir da sequência de aminoácidos. / The process of self-organization of the protein structure is known as folding. Although we know the structure of many proteins, for a majority of them, we do not have enough understanding to describe in details how the structure is organized from its amino acid sequence. In this work, we developed two methods for secondary structure prediction using models that have the potential to provide detailed information about the prediction process. One of these models was constructed using cellular automata, a type of dynamic model where it is possible to obtain spatial and temporal information. The other model was developed using deep residual neural networks. With this model it is possible to extract spatial and probabilistic information from its multiple internal layers of convolution. The accuracy of the prediction obtained by this model was ~ 78% for residues that showed consensus in the structure assigned by the DSSP, STRIDE, KAKSI and PROSS methods. Such value is higher than that obtained by other methods which perform the prediction of secondary structures from the amino acid sequence only.

O processo de auto-organização da estrutura proteica a partir da cadeia de aminoácidos é conhecido como enovelamento. Apesar de conhecermos a estrutura tridimencional de muitas proteínas, para a maioria delas, não possuímos uma compreensão suficiente para descrever em detalhes como a estrutura se organiza a partir da sequência de aminoácidos. É bem conhecido que a formação de núcleos de estruturas locais, conhecida como estrutura secundária, apresenta papel fundamental no enovelamento final da proteína. Desta forma, o desenvolvimento de métodos que permitam não somente predizer a estrutura secundária adotada por um dado resíduo, mas também, a maneira como esse processo deve ocorrer ao longo do tempo é muito relevante em várias áreas da biologia estrutural. Neste trabalho, desenvolvemos dois métodos de predição de estruturas secundárias utilizando modelos com o potencial de fornecer informações mais detalhadas sobre o processo de predição. Um desses modelos foi construído utilizando autômatos celulares, um tipo de modelo dinâmico onde é possível obtermos informações espaciais e temporais. O outro modelo foi desenvolvido utilizando redes neurais residuais profundas. Com este modelo é possível extrair informações espaciais e probabilísticas de suas múltiplas camadas internas de convolução, o que parece refletir, em algum sentido, os estados de formação da estrutura secundária durante o enovelamento. A acurácia da predição obtida por esse modelo foi de ~78% para os resíduos que apresentaram consenso na estrutura atribuída pelos métodos DSSP, STRIDE, KAKSI e PROSS. Tal acurácia, apesar de inferior à obtida pelo PSIPRED, o qual utiliza matrizes PSSM como entrada, é superior à obtida por outros métodos que realizam a predição de estruturas secundárias diretamente a partir da sequência de aminoácidos. / The process of self-organization of the protein structure is known as folding. Although we know the structure of many proteins, for a majority of them, we do not have enough understanding to describe in details how the structure is organized from its amino acid sequence. In this work, we developed two methods for secondary structure prediction using models that have the potential to provide detailed information about the prediction process. One of these models was constructed using cellular automata, a type of dynamic model where it is possible to obtain spatial and temporal information. The other model was developed using deep residual neural networks. With this model it is possible to extract spatial and probabilistic information from its multiple internal layers of convolution. The accuracy of the prediction obtained by this model was ~ 78% for residues that showed consensus in the structure assigned by the DSSP, STRIDE, KAKSI and PROSS methods. Such value is higher than that obtained by other methods which perform the prediction of secondary structures from the amino acid sequence only.