O objetivo inicial deste trabalho foi estudar a expressão de genes regulados por cAMP durante o desenvolvimento do eucarioto inferior Dictyostelium discoideum. Foram analisados vários clones de uma biblioteca de cDNA construída a partir de mRNAs de células estimuladas com cAMP. A análise de um destes clones revelou que este codificava para a proteína de adesão celular gp80, que é expressa durante a fase de agregação no início do desenvolvimento. A regulação da expressão do gene da gp80 foi então estudada. Baixas concentrações de cAMP induzem o aparecimento de mRNA para gp80. A indução ocorre via o receptor de cAMP da superfície celular, e por um mecanismo que não envolve mudanças de cAMP intracelular. Por outro lado, altas concentrações de cAMP, que levam à \"down-regulation\" do receptor de cAMP, causam uma rápida desestabilização do mRNA para gp80 em células competentes para agregação. O mecanismo pelo qual cAMP em altas concentrações desestabiliza o mRNA para gp80 foi investigado. Foi observado que este tratamento, também causa um aumento da tomada de Ca2+. Devido à esta observação, nós procuramos um papel para Ca2+ como um mensageiro secundário na degradação do mRNA para gp80. Mudanças nos níveis de mRNA foram examinadas após tratamento das células com compostos que alteram a concentração intracelular de Ca2+. A soma dos dados sugere que um influxo de cálcio através da membrana celular, em oposição à liberação de cálcio de compartimentos intracelulares, ativa a degradação do mRNA para gp80. Além disso, incubação das células com um inibidor da proteína quinase C previne parcialmente a ação do cAMP, sugerindo um papel para proteína quinase C neste fenômeno. A regulação por cAMP da estabilidade do mRNA para gp80 foi também estudada durante o crescimento vegetativo de uma linhagem de D. discoideum que expressa constitutivamente o cDNA para gp80. Os resultados indicam que, assim como as células da fase de agregação, as células da fase de crescimento também possuem os elementos necessários para degradar a mensagem para gp80 em resposta a um aumento na concentração intracelular de cálcio. Contudo, estas células não são capazes de degradar a mensagem em resposta a altas concentrações de cAMP. / The initial goal of the present work was the study of gene expression regulated by cAMP in Dictyostelium discoideum development. For this, several cDNA clones, from a Iibrary constructed using mRNA of cells stimulated with cAMP, were analyzed. Analysis of one of this clones showed that it corresponded to gp80, a cell adhesion molecule expressed during cell aggregation in early development. gp80 gene regulation was then studied. Low concentrations of cAMP induces gp80 mRNA expression. The induction seems to be via the cell surface cAMP receptor and by a mechanism that does not involve changes in intracellular cAMP. Interestingly, high concentrations of cAMP, which down-regulate the cell surface cAMP receptor, elicit destabilization of gp80 mRNA in agregation competent cells. The mechanism by which high concentrations of cAMP selectively destabilize the gp80 mRNA was investigated. This treatment which leads to down-regulation of the cAMP receptor was found to also cause an increase in calcium uptake. Given this observation, we sought a role for calcium as a second messenger in the degradation of the gp80 mRNA. Changes in the mRNA leveis were examined after treating cells with compounds known to alter the intracellular Ca2+ concentrations. The sum of the data suggest that it is the cAMP-induced influx of Ca2+ across the plasma membrane, as apposed to a cAMP-mediated release of Ca2+ from intracellular stores, that initiates gp80 mRNA degradation. Also, cell incubation with staurosporin partially prevents the action of cAMP, implicating a possible role of protein kinase C. Regulation by cAMP of the message stability during vegetative growth was also studied in cells which constitutively express the gp8ü cDNA. The results indicate that like aggregation competent cells, these cells are able to evoque destabilization of the mRNA in response to a raise in intracellular calcium concentration. However, they are unable to induce the mRNA degradation after cAMP treatment.

O objetivo inicial deste trabalho foi estudar a expressão de genes regulados por cAMP durante o desenvolvimento do eucarioto inferior Dictyostelium discoideum. Foram analisados vários clones de uma biblioteca de cDNA construída a partir de mRNAs de células estimuladas com cAMP. A análise de um destes clones revelou que este codificava para a proteína de adesão celular gp80, que é expressa durante a fase de agregação no início do desenvolvimento. A regulação da expressão do gene da gp80 foi então estudada. Baixas concentrações de cAMP induzem o aparecimento de mRNA para gp80. A indução ocorre via o receptor de cAMP da superfície celular, e por um mecanismo que não envolve mudanças de cAMP intracelular. Por outro lado, altas concentrações de cAMP, que levam à \"down-regulation\" do receptor de cAMP, causam uma rápida desestabilização do mRNA para gp80 em células competentes para agregação. O mecanismo pelo qual cAMP em altas concentrações desestabiliza o mRNA para gp80 foi investigado. Foi observado que este tratamento, também causa um aumento da tomada de Ca2+. Devido à esta observação, nós procuramos um papel para Ca2+ como um mensageiro secundário na degradação do mRNA para gp80. Mudanças nos níveis de mRNA foram examinadas após tratamento das células com compostos que alteram a concentração intracelular de Ca2+. A soma dos dados sugere que um influxo de cálcio através da membrana celular, em oposição à liberação de cálcio de compartimentos intracelulares, ativa a degradação do mRNA para gp80. Além disso, incubação das células com um inibidor da proteína quinase C previne parcialmente a ação do cAMP, sugerindo um papel para proteína quinase C neste fenômeno. A regulação por cAMP da estabilidade do mRNA para gp80 foi também estudada durante o crescimento vegetativo de uma linhagem de D. discoideum que expressa constitutivamente o cDNA para gp80. Os resultados indicam que, assim como as células da fase de agregação, as células da fase de crescimento também possuem os elementos necessários para degradar a mensagem para gp80 em resposta a um aumento na concentração intracelular de cálcio. Contudo, estas células não são capazes de degradar a mensagem em resposta a altas concentrações de cAMP. / The initial goal of the present work was the study of gene expression regulated by cAMP in Dictyostelium discoideum development. For this, several cDNA clones, from a Iibrary constructed using mRNA of cells stimulated with cAMP, were analyzed. Analysis of one of this clones showed that it corresponded to gp80, a cell adhesion molecule expressed during cell aggregation in early development. gp80 gene regulation was then studied. Low concentrations of cAMP induces gp80 mRNA expression. The induction seems to be via the cell surface cAMP receptor and by a mechanism that does not involve changes in intracellular cAMP. Interestingly, high concentrations of cAMP, which down-regulate the cell surface cAMP receptor, elicit destabilization of gp80 mRNA in agregation competent cells. The mechanism by which high concentrations of cAMP selectively destabilize the gp80 mRNA was investigated. This treatment which leads to down-regulation of the cAMP receptor was found to also cause an increase in calcium uptake. Given this observation, we sought a role for calcium as a second messenger in the degradation of the gp80 mRNA. Changes in the mRNA leveis were examined after treating cells with compounds known to alter the intracellular Ca2+ concentrations. The sum of the data suggest that it is the cAMP-induced influx of Ca2+ across the plasma membrane, as apposed to a cAMP-mediated release of Ca2+ from intracellular stores, that initiates gp80 mRNA degradation. Also, cell incubation with staurosporin partially prevents the action of cAMP, implicating a possible role of protein kinase C. Regulation by cAMP of the message stability during vegetative growth was also studied in cells which constitutively express the gp8ü cDNA. The results indicate that like aggregation competent cells, these cells are able to evoque destabilization of the mRNA in response to a raise in intracellular calcium concentration. However, they are unable to induce the mRNA degradation after cAMP treatment.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2014-10-08T18:44:27Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Renata Silva Brandão - 2012.pdf: 881645 bytes, checksum: 6eb66647a421b6919caad44ecf9145fd (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-10-09T11:25:38Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Renata Silva Brandão - 2012.pdf: 881645 bytes, checksum: 6eb66647a421b6919caad44ecf9145fd (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-09T11:25:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Renata Silva Brandão - 2012.pdf: 881645 bytes, checksum: 6eb66647a421b6919caad44ecf9145fd (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2012-09-10 / The fungus Trichoderma spp., is a microorganism naturally found in soil, which presents an important ecological function, as part of the decomposition and mineralization of plant residues, contributing to the availability of nutrients to plants. It is considered also a natural biofungicide, which reduces up to 100% the chances of achieving any fungus culture. The fungus Trichoderma is a fast growing, hence the advantage of use as a biocontrol agent in large scale, produces a variety of antifungal metabolites, including antibiotics and enzymes that degrade the cell wall of certain pathogens, is related to growth promotion in plants and the induction of resistance. The fungus Sclerotinia sclerotiorum is the etiological agent of the disease known as white mold in different cultures, such as soft rot, white mold, tipping pre-emergent and post-emergent plants. It is estimated that about 300 plant species are susceptible to S. sclerotiorum, such as the common bean (Phaseolus vulgaris) and soybean (Glycine max), both of great economic importance. Thus, this work needs to evaluate physiological, biochemical and molecular in common bean using the inductor Trichoderma harzianum against Sclerotinia sclerotiorum. Three isolates of T. harzianum and one isolate S. sclerotiorum were selected for inoculation in bean plants. In plants inoculated with isolates of T. harzianum 475/02 was possible to observe higher values related to the physiological aspects, as the plants inoculated with T. harzianum 479/01 had the highest enzyme activities in the R5 stage. Treatments with more pathogen T. harzianum showed the highest expression of the genes of interest, demonstrating greater efficiency when the two fungi act together. / O fungo Trichoderma spp., é um microrganismo naturalmente encontrado no solo, que apresenta uma importante função ecológica, pois participa da decomposição e mineralização dos resíduos vegetais, contribuindo com a disponibilização de nutrientes para as plantas. Ele é considerado, também, um biofungicida natural, que reduz em até 100% as chances de qualquer fungo atingir a cultura. O Trichoderma é um fungo de crescimento rápido, daí a grande vantagem de utilização como agente de biocontrole em larga escala, produz uma variedade de metabólitos antifúngicos, incluindo antibióticos e enzimas que degradam a parede celular de certos patógenos, está relacionado a promoção de crescimento em plantas e a indução de resistência. O fungo Sclerotinia sclerotiorum é o agente etiológico da doença conhecia como mofo branco em diferentes culturas, como podridão mole, mofo branco, tombamento pré-emergente e pós-emergente de plantas. Estima-se que cerca de 300 espécies vegetais são suscetíveis a S. sclerotiorum, a exemplo do feijoeiro (Phaseolus vulgaris) e da soja (Glycine max), ambas de grande importância econômica. Sendo assim, este trabalho teve por objetivo avaliar aspectos fisiológicos, bioquímicos e moleculares em feijoeiro comum com o uso do indutor Trichoderma harzianum contra Sclerotinia sclerotiorum. Três isolados de T. harzianum e um isolado S. sclerotiorum foram selecionados para inoculação em plantas de feijão. Nas plantas inoculadas com os isolados de T. harzianum 475/02 foi possível observar maiores valores relacionados aos aspectos fisiológicos, já as plantas inoculadas com o T. harzianum 479/01 apresentaram as maiores atividades enzimáticas no estágio R5. Os tratamentos com patógeno mais o T. harzianum, apresentaram as maiores expressões dos genes de β1,3 glucanase, quitinase, peroxidade e lipoxigenase, demonstrando uma maior eficiência na produção quando os dois fungos atuam juntos.