Submitted by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2012-07-23T13:34:54Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_CinéticaEnzimaAlfa-Galactosidase.pdf: 2284274 bytes, checksum: 84e0046c6ef967080654f5dc29d5c13b (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2012-07-23T13:52:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_CinéticaEnzimaAlfa-Galactosidase.pdf: 2284274 bytes, checksum: 84e0046c6ef967080654f5dc29d5c13b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-23T13:52:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_CinéticaEnzimaAlfa-Galactosidase.pdf: 2284274 bytes, checksum: 84e0046c6ef967080654f5dc29d5c13b (MD5) Previous issue date: 2011 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A Alfa-galactosidase A (α-Gal A) humana é uma enzima lisossômica que quando deficiente causa a doença de Fabry. A doença de Fabry é uma esfingolipidose cuja principal causa de morbi-mortalidade é a insuficiência renal crônica (IRC). O objetivo deste estudo foi a implantação de um protocolo laboratorial que permita o diagnóstico da doença de Fabry em plasma e leucócitos, além da análise das características cinéticas da enzima α-Gal A em plasma e busca ativa da doença em 25 indivíduos com IRC de causa desconhecida. Também foram avaliadas a reprodutibilidade e a estabilidade do método enzimático. A padronização dos ensaios foi realizada com o substrato fluorescente 4-metilumbeliferil-α-Dgalactopiranosídeo. A reprodutibilidade foi avaliada utilizando amostras de plasma aliquotadas a 4ºC, -20ºC e -70ºC, analisadas uma vez ao mês por 6 meses e a estabilidade da fluorescência por até 24 horas após o término do ensaio enzimático. A padronização permitiu a implantação de valores de referência da α-Gal A para o estado do Pará, de 4 a 28 nmoles/h/mL (plasma) e de 20 a 96 nmoles/h/mg proteína (leucócitos). A enzima α-Gal A se mostrou termolábil, visto que com apenas 1 minuto de pré-incubação das amostras a 60ºC, sua atividade decaiu 71,09%. Com relação ao tempo de incubação, a atividade enzimática apresentou uma disposição linear crescente entre 15 a 180 minutos de incubação. A α-Gal A apresentou maior atividade no pH 4,8, o Km encontrado para a α-Gal A foi de 1,007 mM e a Vmáx foi 30,9 nmoles/h/mL. A melhor temperatura de armazenamento de plasma até o ensaio enzimático é -20ºC, onde foi observada menor variação em um período máximo de 6 meses. O método enzimático utilizado é estável, mesmo após 24 horas do término do ensaio, em temperatura ambiente. Com relação aos pacientes com IRC de causa desconhecida, todos apresentaram valor de atividade da α-Gal A dentro dos parâmetros de referência e, portanto, nenhum foi diagnosticado com doença de Fabry. O entendimento da cinética da α-Gal A e do seu comportamento in vitro possibilita um melhor diagnóstico laboratorial da doença de Fabry gerando dados para futuras comparações com indivíduos afetados por mutações nesta enzima / Human alpha-galactosidase A (α-Gal A) is a lysosomal enzyme which is deficient in Fabry disease. Fabry disease is a sphingolipidosis which chronic kidney failure (CKF) is the most important cause of morbidity and mortality. The aim of this study was the establishment of a laboratorial protocol that allows the diagnosis of Fabry’s disease in plasma and leukocytes, the analysis of α-Gal A kinetic features in plasma and searching for potential Fabry patients in 25 individual with unknown CKF. Reproducibility and fluorescence stability of the enzymatic method were also evaluated. The assay standardization was realized with the fluorescent substrate 4- methylumbeliferil-α-D-galactopyranoside. Reproducibility was evaluated using plasma samples stored at a 4ºC, -20ºC and -70ºC, the assay was performed once a month until 6 months and fluorescence stability was evaluated until 24 hours after the end of the assay. The standardization allowed the establishment of value references to α-Gal A in Pará State, from 4 to 28 nmoles/h/mL (plasma) and 20 to 96 nmoles/h/mg protein (leukocytes). α-Gal A enzyme was thermolabile and 1 minute of preincubation at 60ºC was sufficient to decrease 71.09% of its entire activity. The activity of the α-Gal A enzyme increased progressively according to incubation time, between 15 and 180 minutes. Its activity was better at pH 4,8, the Km value for the α-Gal A enzyme was 1.007 mM, and maximum reaction velocity was 30.9 nmoles/h/mL. The best storage temperature for plasma samples was -20ºC that showed less variation until 6 months. The enzyme method is stable and even after 24 hours, at room temperature, the fluorescence remained the same. All CKF patients with unknown cause presented α-Gal A activity between normal values, therefore neither was diagnosed with Fabry disease. Understanding the kinetics of the α-Gal A enzyme and its in vitro behavior will contribute to improvements in the laboratory diagnosis of Fabry disease, and provide a diagnostic baseline for the analysis of individuals affected by mutations in this enzyme.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:30:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01 - capa_abstract.pdf: 21561 bytes, checksum: 6b48a9a4c021bab8bbd84b5d506aecaa (MD5) Previous issue date: 2008-02-25 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Insecticides can affect the activity of enzymes of the digestive and energy metabolism of insects. Those enzymes can contribute indirectly in the detoxification process making available energy for maintenance of their defense apparatus against insecticide. The effect of the insecticide can have reflex in the metabolic rate and patterns behavior of the insects. In this study, insects of a population susceptible of the maize weevil, Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae), and two resistant populations to insecticides pyrethroid, with different demographic actings, were exposed to the cipermethrin to evaluate possible alterations in the enzymatic activity, in the metabolic rate and in the pattern behavior of this insects. Concentration-mortality bioassay were accomplished to verify the resistance level of the populations to the cipermethrin. The lethal concentration that it causes 10% of mortality of the insects susceptible (CL10), it was used in the treatment of the three populations for accomplishment of the assay. The enzymatic activity was certain for three enzymes of the energy metabolism (lypase, amylase and trehalase) and four enzymes of the digestive metabolism (cellulase, cysteine-proteinase and serine- proteinase (amydolitic and esterolytic). It was also certain the consumption of O2 and the pattern behavior of the exposed insects to the insecticide. The resistant populations had larger amylase activity, lypase and trehalase, reinforcing the hypothesis of the involvement of those enzymes with the mitigation of the costs physiologic associates to the resistance to insecticides in those populations. However, the treatment with insecticide reduced the specific activity of most of the studied enzymes. On the other hand, the consumption of O2 was similar among the populations and among exposed groups and no exposed to the cypermethrin. The insects of the resistant populations walked larger distances and they had larger medium walking speed, what can be reflex of the largest energy readiness in them. The reduction in the observed enzymatic activity can be resulted of the interference of the insecticide in the synthesis and neuropeptides liberation that affect the activity of the enzymes. Finally, the reduction of the activity of those enzymes might have affected the synthesis and liberation of a group of detoxification enzymes and the additional production of energy to mitigate the physiologic stress provoked by the insecticide. / Inseticidas podem afetar a atividade de enzimas do metabolismo digestivo e energético de insetos. Essas enzimas podem contribuir indiretamente no processo de destoxificação disponibilizando energia para manutenção do mecanismo destoxificativo. O efeito do inseticida pode ter reflexo na taxa metabólica e em padrões comportamentais dos insetos. Neste estudo, insetos de uma população susceptível do caruncho do milho, Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae), e duas populações resistentes a inseticidas piretróides, com desempenhos demográficos diferentes, foram expostas à cipermetrina para avaliar possíveis alterações na atividade enzimática, na taxa metabólica e no padrão comportamental de caminhamento dos insetos. Foram realizados bioensaios de concentração-mortalidade para verificar o nível de resistência das populações à cipermetrina. A concentração letal que causa 10% de mortalidade dos insetos susceptíveis (CL10), foi utilizada no tratamento das três populações para realização dos ensaios. A atividade enzimática foi determinada para três enzimas do metabolismo energético (lipase, amilase e trealase) e quatro enzimas do metabolismo digestivo (celulase, cisteíno-protease e serino- protease amidásica e esterásica). Foi também determinado o consumo de O2 e o padrão comportamental dos insetos expostos ao inseticida. As populações resistentes tiveram maior atividade de amilase, lipase e trealase, reforçando a hipótese do envolvimento dessas enzimas com a mitigação dos custos fisiológicos associados à resistência a inseticidas nessas populações. Entretanto, o tratamento com inseticida reduziu a atividade específica da maioria das enzimas estudadas. Por outro lado, o consumo de O2 foi semelhante entre as populações e entre grupos expostos e não expostos à cipermetrina. Os insetos das populações resistentes caminharam maiores distâncias e tiveram maior velocidade média de caminhamento, o que pode ser reflexo da maior disponibilidade energética neles. A redução na atividade enzimática observada pode ser resultado da interferência do inseticida na síntese e liberação de neuropeptídeos que afetam a atividade das enzimas. Por fim, a redução da atividade dessas enzimas pode ter afetado a síntese e liberação de enzimas destoxificativas e a produção adicional de energia para mitigar o estresse fisiológico provocado pelo inseticida.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:30:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1012402 bytes, checksum: e93e297eb37b3a24f8504893d77af531 (MD5) Previous issue date: 2007-07-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Protease inhibitors can reduce the digestive efficiency, to delay the development and to diminish the insect proteolytic activity resulting in increase of mortality through deficiency of free amino acids for maintenance of vital functions. The subject of this work were to evaluate if A. gemmatalis larvae feeding in artificial diets containing increasing concentrations of synthetic trypsin inhibitor bisbenzamidine affects negatively the insect performance, reduce the alimentary consumption, the digestibility, the assimilation efficiency of the food ingested and digested, the insect proteolytic activity and protein digestibility. To test these hypotheses were realized bioassays with individualized caterpillars and supplied daily with diets containing 0; 0,00095; 0,0019; 0,0038; 0,0076; 0,0152; 0,0304; 0,0608; 0,0912; 0,125 e 0,25% (w/w) of berenil during the entire larval phase. The digestion indices, the duration of larval phase and life cycle, the accumulated survival and the average of time survival, the pupae and adults weight, the body and wings of the adults moths were determined. Additionally, were evaluated the protein digestibility and the enzymatic activity of midgut extracts of A. gemmatalis exposed to berenil in diet, in the same concentrations above. All parameters assessed of life history were negatively affected with the increase of inhibitors in diet. Were verified an increase in the larval phase and life cycle duration, reduction in the pupae weight and body and wings length. There was reduction in the incorporated biomass and the relative growth rate. Otherwise, there were increases in ingestion, approximated digestion, and relative diet consumption rate and in the ingestion and excretion balance. The diet individual consumption increased until the 0.0076% of berenil, diminished with the increase of inhibitor concentration. The protein digestibility was directly proportional to berenil concentration while the proteolytic, amidolytic and esterolytic activities diminished with the increasing of inhibitor concentration. Therefore, albeit the berenil mixed in increasing concentrations in diet affects negatively in all life history parameters of insect, the caterpillars improve the diet intake. However, even so the total digestibility and the protein digestibility increase in higher inhibitor concentrations, the insect show lower enzymatic activity and, consequently, reduction in the efficiency in assimilation of ingested and digested food, indicating that the insect did not show adaptative mechanisms to prevent the inhibition of tripsina-like enzymes existents in your digestive tract. Thus, the berenil is a promising strategy to new studies with the subject of to synthesis mimicry peptides to apply in the field to control A. gemmatalis caterpillars in the soybean crops. / Inibidores de proteases podem reduzir a eficiência digestiva, retardar o desenvolvimento e diminuir a atividade proteolítica do inseto, resultando em aumento da mortalidade pela deficiência de aminoácidos livres para a manutenção das funções vitais. Este trabalho teve por objetivos avaliar se concentrações crescentes do inibidor sintético de serino- proteases, berenil, presente na dieta de A. gemmatalis afeta negativamente a performance do inseto, reduz o consumo alimentar, a digestibilidade e a eficiência na assimilação do alimento ingerido e digerido, reduz a atividade proteolítica e tríptica do inseto e reduz sua digestibilidade protéica. Para testar essa hipótese foram realizados bioensaios com lagartas individualizadas e alimentadas diariamente em dietas contendo 0; 0,00095; 0,0019; 0,0038; 0,0076; 0,0152; 0,0304; 0,0608; 0,0912; 0,125 e 0,25% (p/p) de berenil durante toda a fase larval. Foram determinados os índices digestórios, a duração do ciclo de vida e da fase larval, a sobrevivência acumulada e o tempo médio de vida, o peso das pupas e dos adultos, o tamanho corporal e das asas das mariposas adultas. Adicionalmente, foram avaliadas a digestibilidade protéica e a atividade enzimática de extratos do intestino médio de A. gemmatalis submetidas ao berenil na dieta, nas concentrações determinadas acima. Todos os parâmetros avaliados da história de vida do inseto foram afetados negativamente com o aumento da concentração do inibidor na dieta. Foi verificado aumento na duração da fase larval e do ciclo de vida, diminuição no peso das pupas, adultos, tamanho dos adultos e comprimento das asas. Houve redução na biomassa incorporada e na taxa relativa de crescimento. Por outro lado, houve aumento na ingestão, digestibilidade aproximada, na taxa de consumo relativa da dieta e no balanço entre ingestão e excreção das fezes. O consumo individual total da dieta aumentou até a concentração de 0,0076% do inibidor na dieta, decrescendo com o aumento da concentração de inibidor. A digestibilidade protéica foi diretamente proporcional à concentração de berenil enquanto as atividades proteolítica, amidásica e esterásica diminuíram com o aumento da concentração do inibidor. Desse modo, embora a presença de berenil em concentrações crescentes na dieta interfira negativamente em todos os parâmetros da história de vida do inseto, as lagartas respondem aumentando a ingestão da dieta. Contudo, mesmo que a digestibilidade total e a digestibilidade protéica aumentem em concentrações maiores de inibidor, o inseto apresenta menor atividade enzimática e, conseqüentemente, baixa eficiência na assimilação do alimento ingerido e digerido, indicando que o inseto não demonstra mecanismos adaptativos para impedir a inibição das enzimas tripsina-like presentes em seu sistema digestivo. Nesse sentido, o berenil surge como estratégia promissora para novos estudos visando a síntese de peptídeos miméticos para aplicação no campo como forma de controle de A. gemmatalis nos cultivos de soja.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2012-10-02T19:02:49Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseAtividadeEnzimatica.pdf: 873052 bytes, checksum: ccd758791accb08df1aa5359c4f2d8a1 (MD5) / Rejected by Edisangela Bastos(edisangela@ufpa.br), reason: Sem autorização on 2012-10-05T17:30:44Z (GMT) / Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-01-24T18:11:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseAtividadeEnzimatica.pdf: 873052 bytes, checksum: ccd758791accb08df1aa5359c4f2d8a1 (MD5) / Rejected by Edisangela Bastos(edisangela@ufpa.br), reason: on 2013-01-24T19:21:46Z (GMT) / Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-01-29T19:07:37Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseAtividadeEnzimatica.pdf: 873052 bytes, checksum: ccd758791accb08df1aa5359c4f2d8a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-02-04T17:47:47Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseAtividadeEnzimatica.pdf: 873052 bytes, checksum: ccd758791accb08df1aa5359c4f2d8a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-04T17:47:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseAtividadeEnzimatica.pdf: 873052 bytes, checksum: ccd758791accb08df1aa5359c4f2d8a1 (MD5) Previous issue date: 2010 / A quitotriosidase foi a primeira quitinase humana descrita e sua função fisiológica ainda não está totalmente esclarecida. Entretanto, diversos estudos têm demonstrado sua participação como componente na resposta imune humana. Uma duplicação de 24pb no éxon 10 do gene chit1 promove uma mudança na matriz de leitura do RNAm com deleção de 87 nucleotídeos. Esta alteração produzirá uma proteína sem atividade catalítica. Esta condição é chamada de deficiência de quitotriosidase e apresenta uma frequência aproximada de 6% de homozigose para a duplicação em diferentes grupos étnicos. A malária é uma parasitose endêmica da região amazônica causada por protozoários do gênero Plasmodium cujos sintomas incluem febre, dor de cabeça e vômitos, o que induz a uma resposta imunológica característica com o objetivo de combater essa patologia. Os objetivos deste trabalho foram avaliar o comportamento da enzima quitotriosidase em pacientes acometidos por malária no estado do Pará e determinar a frequência da duplicação de 24pb no gene da quitotriosidase em uma amostra representativa. Foi realizada dosagem de quitotriosidase em 100 indivíduos sadios e 47 pacientes com malária para a análise. A análise molecular da duplicação de 24 pb foi realizada em 100 voluntários através de protocolo que incluiu as técnicas de extração de DNA, PCR e depois visualização em gel de agarose 2,5% para verificação dos fragmentos normais (homozigoto normal: 195pb) e com a duplicação de 24pb (homozigoto mutante: 219pb; heterozigoto: 219pb e 195pb). Este trabalho descreveu pela primeira vez na literatura científica a elevação dos níveis plasmáticos de quitotriosidase em pacientes acometidos por malária vivax em comparação com um grupo de indivíduos sadios. Não houve associação entre a parasitemia e os níveis plasmáticos de quitotriosidase nos pacientes com Malária. A análise molecular apresentou uma frequência de 72% de indivíduos homozigotos normais, 24% de indivíduos heterozigotos e 4% de homozigotos mutantes para duplicação de 24 pb. As frequências alélicas ficaram em torno de 84% para o alelo selvagem e 16% para o alelo mutante. Não foi encontrada correlação entre o genótipo e o fenótipo bioquímico (representado pelos níveis de quitotriosidase) no grupo controle. / Chitotriosidase was the first described chitinase and its physiologic role is not entirely clear, although many studies have been showed its participation as a component of human immune response. A 24pb duplication on exon 10 of chit1 gene results on RNAm frameshift, leading to a 87 nucleotides deletion. This alteration generates a protein with no catalytic activity at all. This condition is called chitotriosidase deficiency and presents a frequency close to 6% of homozygosis duplication in different ethnical groups. Malaria is an amazon endemic parasitosis caused by protozoaries of genus Plasmodium and causes symptoms as fever, headache and vomit, which leads to a characteristic immune response. The objective of this study was to evaluate the chitotriosidase enzyme behavior in patients suffering of malaria in Pará state and to determine the frequency of 24pb duplication on chitotriosidase gene in a representative sample. Chitotriosidase measurement was made in 100 healthy individual and in 47 malarial patients. The molecular analysis of the 24pb duplication was realized in 100 volunteers trough a protocol which included DNA extraction techniques, PCR and 2,5% agarose gel visualization to verify normal fragments (normal homozygote: 195pb) and the 24pb duplication (mutant homozygote: 219pb; heterozygote: 219pb e 195pb). This study described at first time on scientific literature the chitotriosidase plasmatic levels increasing in patients suffering of malaria vivax compared to healthy individual. No association was observed between parasitemia and plasmatic chitotriosidase levels in malarial patients. Molecular analysis showed a frequency of 72% normal homozygotes, 24% heterozygotes and 4% mutant homozygotes to 24pb duplication. Allelic frequencies were around 84% to wild allele and 16% to mutant allele. No correlation was found between genotype and biochemical phenotype (represented by chitotriosidase levels) on control group.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2014-10-08T18:44:27Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Renata Silva Brandão - 2012.pdf: 881645 bytes, checksum: 6eb66647a421b6919caad44ecf9145fd (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-10-09T11:25:38Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Renata Silva Brandão - 2012.pdf: 881645 bytes, checksum: 6eb66647a421b6919caad44ecf9145fd (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-09T11:25:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Renata Silva Brandão - 2012.pdf: 881645 bytes, checksum: 6eb66647a421b6919caad44ecf9145fd (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2012-09-10 / The fungus Trichoderma spp., is a microorganism naturally found in soil, which presents an important ecological function, as part of the decomposition and mineralization of plant residues, contributing to the availability of nutrients to plants. It is considered also a natural biofungicide, which reduces up to 100% the chances of achieving any fungus culture. The fungus Trichoderma is a fast growing, hence the advantage of use as a biocontrol agent in large scale, produces a variety of antifungal metabolites, including antibiotics and enzymes that degrade the cell wall of certain pathogens, is related to growth promotion in plants and the induction of resistance. The fungus Sclerotinia sclerotiorum is the etiological agent of the disease known as white mold in different cultures, such as soft rot, white mold, tipping pre-emergent and post-emergent plants. It is estimated that about 300 plant species are susceptible to S. sclerotiorum, such as the common bean (Phaseolus vulgaris) and soybean (Glycine max), both of great economic importance. Thus, this work needs to evaluate physiological, biochemical and molecular in common bean using the inductor Trichoderma harzianum against Sclerotinia sclerotiorum. Three isolates of T. harzianum and one isolate S. sclerotiorum were selected for inoculation in bean plants. In plants inoculated with isolates of T. harzianum 475/02 was possible to observe higher values related to the physiological aspects, as the plants inoculated with T. harzianum 479/01 had the highest enzyme activities in the R5 stage. Treatments with more pathogen T. harzianum showed the highest expression of the genes of interest, demonstrating greater efficiency when the two fungi act together. / O fungo Trichoderma spp., é um microrganismo naturalmente encontrado no solo, que apresenta uma importante função ecológica, pois participa da decomposição e mineralização dos resíduos vegetais, contribuindo com a disponibilização de nutrientes para as plantas. Ele é considerado, também, um biofungicida natural, que reduz em até 100% as chances de qualquer fungo atingir a cultura. O Trichoderma é um fungo de crescimento rápido, daí a grande vantagem de utilização como agente de biocontrole em larga escala, produz uma variedade de metabólitos antifúngicos, incluindo antibióticos e enzimas que degradam a parede celular de certos patógenos, está relacionado a promoção de crescimento em plantas e a indução de resistência. O fungo Sclerotinia sclerotiorum é o agente etiológico da doença conhecia como mofo branco em diferentes culturas, como podridão mole, mofo branco, tombamento pré-emergente e pós-emergente de plantas. Estima-se que cerca de 300 espécies vegetais são suscetíveis a S. sclerotiorum, a exemplo do feijoeiro (Phaseolus vulgaris) e da soja (Glycine max), ambas de grande importância econômica. Sendo assim, este trabalho teve por objetivo avaliar aspectos fisiológicos, bioquímicos e moleculares em feijoeiro comum com o uso do indutor Trichoderma harzianum contra Sclerotinia sclerotiorum. Três isolados de T. harzianum e um isolado S. sclerotiorum foram selecionados para inoculação em plantas de feijão. Nas plantas inoculadas com os isolados de T. harzianum 475/02 foi possível observar maiores valores relacionados aos aspectos fisiológicos, já as plantas inoculadas com o T. harzianum 479/01 apresentaram as maiores atividades enzimáticas no estágio R5. Os tratamentos com patógeno mais o T. harzianum, apresentaram as maiores expressões dos genes de β1,3 glucanase, quitinase, peroxidade e lipoxigenase, demonstrando uma maior eficiência na produção quando os dois fungos atuam juntos.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao de mestrado completa Amanda A Souza.pdf: 994299 bytes, checksum: 8cf098dd70299abaf08a216436f38888 (MD5) Previous issue date: 2011-06-29 / Trichoderma harzianum is a saprophytic fungus, known for its potential as a biological control agent of different phytopathogens that causes losses in crops. Its action is based on different mechanisms like volatile and non-volatile antibiotics production, competition for nutrient and space, production of hydrolytic enzymes and mycoparasitism. This fungus also plays an important role in the release of carbon, nitrogen and phosphorus from insoluble macromolecules to the medium, favoring the growth of plants. Phosphorus is a limiting nutrient for plant growth, however, over 80% of the phosphorus applied to the soil, it becomes unavailable, due to its adsorption, precipitation or conversion to organic form. One way to obtain phosphate compounds in soil is through the action of enzymes called phosphatases, which catalyze the hydrolysis of phosphate esters producing soluble phosphorus. High levels of acid phosphatase (ACP) were produced by Trichoderma harzianum ALL42. This study evaluated the ability of T. harzianumALL42produce acid phosphatases(ACPs) in minimal medium modified by varying the concentration of glucose and phosphate (KH2PO4). The results showed that the concentration of glucose and phosphate in the culture medium regulated the production of ACPs T. harzianum ALL42. Thisfungusproducedanacid phosphatase(ACPII) inculture mediumcontainingglucose0.5% and0.04% phosphate. Theenzymewaspartiallypurifiedby hydrophobic interaction chromatography on Phenyl Sepharose. A typical procedure provided 2,0 fold purification with 32.65 % yield. It was optimally active in the pH range 5,2 and at 50°C. The enzyme was heat-stable, retaining approximately 60% of its activity after heating for 60 min at 60°C. Kinetic parameters calculated for the hydrolysis of p-nitrophenyl phosphate by acid phosphatase were Km= 0,054 M and Vmax= 2,058 units.min-1. The enzyme was strongly inhibited by KH2PO4, FeCl3 and sodium tungstate. The enzyme is inhibited by KH2PO4 and sodium tungstate through mixed inhibition. The acid phosphatase hydrolyzed a number of phosphate esters ATP, ADP, AMP, D-glucose-1-phosphate, D-fructose-6-phosphate, includingphytic acid, showinganactivityofphytase. / Trichoderma harzianum é um fungo saprofítico, conhecido pelo seu grande potencial como agente de controle biológico de diferentes fitopatógenos. Sua ação é baseada em diferentes mecanismos como a produção de antibióticos voláteis e não-voláteis, competição por espaço e nutrientes, produção de enzimas hidrolíticas e o micoparasitismo. Esse fungo também desempenha um importante papel na liberação de carbono, nitrogênio e fósforo, a partir de macromoléculas insolúveis, para o meio, favorecendo o crescimento de plantas. O fósforo é um nutriente limitante para o crescimento da planta, entretanto, mais de 80% do fósforo aplicado diretamente no solo, torna-se indisponível, devido a sua adsorção, precipitação ou conversão para forma orgânica. Uma forma de se obter compostos fosfatados no solo é através da ação de enzimas denominadas fosfatases, que catalisam a hidrólise de ésteres fosfatados produzindo fósforo solúvel. Altos níveis de fosfatase ácida foram produzidos por Trichoderma harzianum ALL42. Neste trabalho avaliou-se a capacidade de T. harzianum ALL42 produzir fosfatases ácidas (ACPs) em meio mínimo modificado, variando a concentração de glicose e fosfato (KH2PO4). Os resultados obtidos demonstraram que, a concentração de glicose e fosfato no meio de cultura regulou a produção de ACPs por T. harzianum ALL42. Esse fungoproduziu uma fosfatase ácida (ACPII) em meio de cultura contendo glicose 0,5% e fosfato 0,04%. A enzima foi parcialmente purificada através da cromatografia de interação hidrofóbica Phenyl-Sepharose. O processo de purificação obteve um fator de purificação de 2,0 e rendimento de 32,65%. A atividade ótima encontrada foi na faixa de pH 5,2 e a 50 ºC. A enzima foi termoestável, mantendo aproximadamente 60% de sua atividade após incubação por 60 min a 60 ºC. Os parâmetros cinéticos calculados pela hidrólise de ƿ-nitrofenilfosfato pela fosfatase ácida foram de Km = 0,054 µmol e Vmáx = 2,028U.min-1. A enzima foi fortemente inibida por KH2PO4,FeCl3 e tungstato de sódio. A enzima foi inibida por KH2PO4 e tungstato de sódio por inibição mista. A fosfatase ácida hidrolisou todos os ésteres fosfatados testados (ATP, ADP, AMP, D-glicose-1-fosfato, D-frutose-6-fosfato, fenil fosfato de sódio), inclusive ácido fítico, demonstrando uma atividade de fitase.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pedro henrique(parte_2)_Recorrigida.pdf: 952650 bytes, checksum: 7afd49b434f553dda644f41af93f0152 (MD5) Previous issue date: 2009-06-29 / In Brazil, the snake Crotalus durissus collilineatus is much studied, particularly its component crotoxina. The crotoxina is the most toxic component of venom from the species cascavéis amicanas Crotalus durissus. It is composed of two different subunits, the crotapotina (acid component) and a phospholipase A2 (basic component). The enzyme phospholipase A2 is the most studied of these poisons, being largely responsible for its toxicity. Its main effects are neurotoxicity, myotoxicity, cytotoxicity, platelet aggregation, anti-coagulant and bactericide. This study aims to purify and characterize a new phospholipase A2 isolated from Crotalus durissus collilineatus, and uses it as a model for studies of compounds with potential antinflamatório. Samples (5mg) of crude venom of Crotalus durissus collilineatus were applied on a C18 column coupled to a system semipreparativa HPLC. 20 peaks were obtained for proteins / peptides, and the increased activity of fofolipase (PLA) was detected in fraction 14. This fraction was subjected to a new phase chromatography on C18 analytical column, resulting in the isolation of a new PLA. By electrophoresis, SDS-PAGE the enzyme showed high degree of purity, with molecular mass around 13 kDa. The PLA2 activity showed optimal at pH of 8.2 and at temperatures between 35-40 º C and remains stable up to temperatures of 60 º C. According to our experiments isolated PLA was inhibited Ca2 +, and activity was not changed by Cu2 +. Manaca extract, ellagic acid and quercetin strongly inhibited the PLA, showing that this enzyme has potential for the selection of compounds with potential antiinflammatory. / No Brasil, a serpente Crotalus durissus collilineatus é muito estudada, devido a sua importância médica, já que é uma das responsáveis pelo envenenamento crotálico. A crotoxina é o componente mais tóxico do veneno das cascavéis sulamericanas da espécie Crotalus durissus. É composta por duas diferentes subunidades, a crotapotina (componente ácido) e uma fosfolipase A2 (componente básico). As fosfolipases A2 é a enzima mais estudada destes venenos, sendo a maior responsável por sua toxicidade. Dentre seus principais efeitos estão os efeitos neurotóxico, miotóxico, citotóxico, agregação plaquetária, anti-coagulante e bactericída. Este estudo tem como objetivo caracterizar uma nova fosfolipase A2 isolada de Crotalus durissus collilineatus, e utilizá-la como modelo para estudos de compostos com potencial antinflamatório. Amostras do veneno bruto de Crotalus durissus collilineatus foram aplicados em uma coluna C18 semipreparativa acoplada a um sistema HPLC. Foram obtidas 20 picos de proteínas/peptídios, sendo que a maior atividade de fofolipase (PLA) foi detectada na fração 14. Esta fração foi submetida a uma nova etapa cromatográfica, em coluna C18 analítica, resultando no isolamento de uma nova PLA. Através de eletroforese, SDS-PAGE a enzima apresentou alto grau de pureza, com massa molecular em torno de 13 kDa. A PLA2 apresentou atividade ótima em pH de 8,2 e temperatura entre 35-40 ºC, e se mantendo estável em temperaturas de até 60 ºC. De acordo com nossos experimentos a PLA isolada foi inibida Ca2+, e a atividade não foi alterada por Cu2+. Extrato de manacá, ácido elágico e quercetina inibiram fortemente a PLA, mostrando que esta enzima tem potencial para a seleção de compostos com potencial antiinflamatório.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:30:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 841800 bytes, checksum: 783321f8508db8b49dbbe62fa1a549c8 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The spider mite Tetranychus evansi interferes in the lipoxygenases pathway of plant defenses respond where are produced jasmonic acid that activates expressing genes of proteinase inhibitors which affect the capability of digest proteins in herbivores. The not PI induction ability of T. evansi promotes his performance and reproduction but other species too like the spider mite T. urticae. Until now, there has not been study how digestive enzyme activity of these and other herbivores could be affected by T. evansi interference in tomato defense respond neither which digestive enzymes are present in this particular plant- herbivore relation what became in our research objective. Tomato plants were infested with T. evansi, T. urticae or moth larvae Tuta absoluta, while some plants were infested with a combination of T.evansi with each one of the other species simultaneously. When T. evansi was in the same plant with T. urticae the defense respond by lipoxygenases pathway were induced and the proteinase inhibitors were equal that plants attacked by only T.urticae, and plants attacked by T. evansi and T. absoluta simultaneously. T. evansi oviposition rate were only affected in plants previously attacked by T. urticae. In plants previously attacked by the combination of herbivores or just T. absoluta the oviposition rate doesn t differs of rates in clean plants, despite of high PI concentration. This suggests that T. evansi performance is affected by PI but for T. urticae plant injuries and traces and T. evansi has to overcome more factors involved in food competition. Digestive enzymes profile suggest a higher serine than cysteine proteinase activity been mainly tripsyn-like proteinases. In spider mites, tripsyn-like proteinases increase when PI were higher, possible to overcome PI toxic effects plus a higher aminoacids demand in T. evansi when competes with T. urticae for food resources. The quimotripsyn-like proteinases seems to be sensible to PI and decrease with high tripsyn-like ativity. / O ácaro Tetranychus evansi interfere na resposta de defesa pela via das lipoxigenases do tomateiro, na qual ocorre a produção de ácido jasmônico que ativa os genes que expressam inibidores de proteases os quais afetam a capacidade dos herbívoros para digerir proteínas. Ao não induzir inibidores de proteases, T. evansi favorece o seu desenvolvimento e reprodução, mas também de outros herbívoros como T. urticae. Ate agora não tem sido demostrado quais enzimas digestivas e como a suas atividades em este e outros herbívoros podem ser afetados por essa interferência na reposta de defensa do tomateiro, o que consistiu em nosso objetivo de trabalho. Plantas de tomate foram infestadas com ácaros das espécies T. evansi, T. urticae e com a lagarta Tuta absoluta, outras foram infestadas com uma combinação de T. evansi com as outras duas espécies. Quando T. evansi esteve na mesma planta com T. urticae a reposta de defesa pela via das lipoxigenases foi induzida e a concentração de inibidores de proteases igual que a indução gerada por T. urticae, o mesmo quando T. evansi esteve junto com T. absoluta na planta. A oviposição de T. evansi foi afetada em plantas que foram infestadas unicamente com T. urticae, mas em plantas atacadas pela combinação de herbívoros ou unicamente por T. absoluta a oviposição não diferiu com aquela em plantas limpas, apesar das altas concentrações de IP. Isto sugere que a oviposição de T. evansi não é afetada só pelos IP, mas possivelmente pelos danos e rastros deixados por T. urticae nas folhas. O perfil das enzimas digestivas indica uma maior atividade de serino proteases que de cisteíno proteases, sendo as Tripsinas-like as de maior atividade. Nos ácaros as tripsinas incrementam com a concentração de IP, possivelmente pela necessidade de superar o efeito deletério destes e no caso de T. evansi de digerir mais aminoácidos quando compete com T. urticae. As quimotripsinas-like parecem ser mais sensíveis aos IP e diminuir com o incremento da atividade das tripsinas.