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Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-18T18:24:17Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 370583 bytes, checksum: 949df73c78eb106c4c4cee4a0d7df145 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-18T18:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 370583 bytes, checksum: 949df73c78eb106c4c4cee4a0d7df145 (MD5) Previous issue date: 2002-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A ingestão de grãos de leguminosas, como a soja e derivados, resulta no aparecimento de sintomas desagradáveis, o que limita o seu consumo. Dentre os sintomas desagradáveis, destaca-se a flatulência, que é resultante do metabolismo anaeróbico de α-1,6-galactosídeos de rafinose (RO: oligossacarídeos de rafinose) presentes nos grãos das leguminosas em geral. A remoção desses açúcares das sementes ou do extrato hidrossolúvel poderia aumentar o consumo de alimentos derivados de soja. Vários processos para redução do conteúdo de RO em derivados de soja já foram descritos; entretanto, a hidrólise enzimática dos RO, catalisada por α-galactosidases, parece ser o mais promissor. O objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência da α-galactosidase de sementes de soja em germinação para hidrolisar os RO presentes no extrato de soja. Sementes de soja (Glycine max , vr. CAC-1) foram germinadas por 60 h, a 27 °C. O extrato enzimático foi obtido pela trituração das sementes em tampão citrato/fosfato de sódio, pH 5,0. A suspensão foi filtrada e centrifugada, e o extrato enzimático resultante, utilizado para a purificação da α-galactosidase. Em uma primeira abordagem, o extrato enzimático foi fracionado em um sistema de duas fases aquosas (SDFA), formado por uma mistura de 16% (p/p) de PEG 1500, 16% (p/p) de fosfato de sódio pH 5,0 e 12% (p/p) de NaCl. A enzima presente na fase superior do SDFA foi dialisada e submetida à cromatografia de troca iônica em coluna de CM-Sepharose, pH 4,0. As frações com atividade de α-galactosidase, eluídas com um gradiente de NaCl (0-0,8M), foram reunidas, concentradas por ultrafiltração, originando a α-galactosidase semi-purificada. A α-galactosidase foi purificada 12,4 vezes e o rendimento do processo de purificação foi de 13,5%. Atividade máxima de α-galactosidase foi detectada em pH 5-6 a 50 °C. A enzima manteve-se em torno de 100% da atividade original após pré- incubação por 3 h, a 35 e 40 °C, mas somente 50% da atividade original foi mantida após pré-incubação a 45 °C. K M ap para ρNPGal, melibiose e rafinose determinados pelo método do duplo-recíproco foram de 0,30 mM, 0,63 mM e 6,16 mM, respectivamente. A enzima hidrolisou com maior intensidade rafinose, seguido de ρNPGal, estaquiose e melibiose. Galactose, rafinose, melibiose, CuSO 4 , SDS e CAC-1l 2 atuaram como inibidores da atividade da enzima parcialmente purificada. Resultados do tratamento do leite de soja com a enzima mostraram redução de 72,3% de estaquiose e 89,2% de rafinose após um período de incubação de 6h, a 40 °C. Com o objetivo de aumentar o rendimento do processo de purificação, visando futuras aplicações em ensaios biológicos, um segundo protocolo foi estabelecido. O extrato enzimático obtido, como já descrito, foi submetido à crioprecipitação, precipitação ácida, fracionamento com sulfato de amônio (20-50% de saturação) e cromatografia de filtração gélica em Sephadex G-100. A α-galactosidase foi semi purificada em quatro etapas, com índice de purificação de 21,33 vezes e recuperação de 44% da atividade enzimática. Em conclusão, observamos que a adição de α -galactosidase ao extrato de soja hidrolisou uma fração significativa dos carboidratos não digeríveis, estaquiose e rafinose, podendo diminuir a flatulência causada por esses oligossacarídeos e assim aumentar o uso desta fonte protéica vegetal na alimentação humana e animal. Além disso, essa enzima apresenta características cinéticas compatíveis com as exigências para sua utilização em processos industriais, visando a diminuição nos teores dos oligossacarídeos de rafinose. / The ingestion of legume seeds, like soy and derived products, results in unpleasant symptoms, which limits its consumption. Among the unpleasant symptoms, flatulence is the major one, which results from the anaerobic metabolism of α-1,6-galactosides of raffinose (RO: Raffinose oligosaccharides) generally presents in legume seeds. Removal of those sugars from soy seeds or soybean derived products would have a positive impact in soy food consumption. Several processes for RO content reduction in soy products were described, however, enzymatic hydrolyze of RO by α-galactosidase seems to be the most promising. The objectives of this work were to text α -galactosidase the efficiency from germinated soy seeds to hydrolyze RO present in soybean milk. Soy seeds (Glycine max , cv CAC-1) were allowed to germinate for 60 h, at 27 °C. The enzymatic extract was obtained by seed trituration in a citrate /sodium phosphate, pH 5.0. Then the suspension was filtered, centrifuged and the resulting enzymatic crude extract used for α-galactosidase purification. First, the enzymatic extract was fractionated in a Aqueous Two-Phase System (ATPS) consisted of a 16 % (w/w) polyethyleneglycol (PEG 1500) solution, 16% (w/w) of sodium phosphate pH 5.0 and 12% (w/w) of NaCl. The enzyme present in the upper phase of the ATPS was dialyzed and loaded onto a CM-Sepharose Fast Flow ionic exchange column, pH 4.0. The fractions with activity of α- galactosidase, were eluted with a gradient of NaCl (0-0.8M), they were pooled together, concentrated by ultra filtration, producing α-galactosidase partially purified. α-Galactosidase was partially purified in two stages. Purification index was 12.4 times with enzymatic activity recovery of 13.5%. Maximum α- galactosidase activity was detected in pH range of 5-6 and 50 °C. The enzyme maintained near 100% of original activity after pre-incubation for 3h at 35 and 40 °C, but only 50% of original activity after pre-incubation at 45 °C. K M app values for hydrolyze of ρNPGal, melibiose and rafinose was of 0.30, 0.63 and 6.16 mM, respectively. The enzyme was able to hydrolyze better rafinose, followed by ρNPGal, stachyose and melibiose. Galactose, raffinose, melibiose, CuSO 4 , SDS and CAC-1l 2 inhibited the enzyme activity. Soybean milk treated with α-galactosidase showed reduction of 72.3 and 89.2% in the stachyose and raffinose contents, respectively, after incubation for 6h at 40oC. In order to increasing the purification process efficiency, seeking future application in biological assays, a second protocol was established. Enzymatic extract was submitted to cryoprecipitation, acid precipitation and fractionation with ammonium sulphate (20-50% of saturation) and filtrated by gel chromatography. The extract was loaded onto Sephadex G-100 column. α-Galactosidase was partially purified in four stages. Purification index was 21.33 times with enzymatic activity recovery of 44%. In conclusion, we observed that the addition of α-galactosidase to soybean extract hydrolyzed a significant fraction of the carbohydrates non digestible, rafinose oligosaccharides, that can reduce the flatulence caused by those oligosaccharides and also can increase the use of this protein vegetable source in the human and animal feeding. Besides, that enzyme presents compatible kinetic characteristics for use in industrial processes, with the objective to reduce rafinose oligosaccharides content. / Dissertação importada do Alexandria

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Submitted by Antonio Geraldo Couto Barreto (ppgms@ufba.br) on 2013-11-04T14:01:42Z No. of bitstreams: 1 PDF Final.pdf: 7736859 bytes, checksum: d029585d5add34bb5b7f5929fdd32069 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso (pbarroso@ufba.br) on 2013-11-04T17:16:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF Final.pdf: 7736859 bytes, checksum: d029585d5add34bb5b7f5929fdd32069 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-04T17:16:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF Final.pdf: 7736859 bytes, checksum: d029585d5add34bb5b7f5929fdd32069 (MD5) / INTRODUÇÃO: A doença de Fabry (DF) é um erro inato do metabolismo dos glicoesfingolípidos devido à deficiência da atividade da enzima α-galactosidase A; é ligada ao cromossomo X e pacientes do sexo masculino geralmente apresentam sintomas clássicos. Não há mutações comuns para este gene; mais de 600 mutações já foram descritas no Human Gene Mutation Database. OBJETIVO: O objetivo deste estudo é relatar todas as mutações e alterações polimórficas observadas nos membros de cinco famílias com a doença de Fabry do estado da Bahia-Brasil. MATERIAL E MÉTODOS: Um total de 48 pacientes com suspeita de DF foi encaminhado para avaliação no Serviço de Genética Médica do Hospital Universitário Professor Edgard Santos durante o período de janeiro de 2009 a dezembro de 2011. Os 14 pacientes (06 homens/08 mulheres) com diagnóstico de Doença de Fabry envolvidos neste trabalho são acompanhados no Ambulatório de Erros Inatos do Metabolismo do Hospital Professor Edgard Santos - Universidade Federal da Bahia. Eles pertencem a cinco famílias (I, II, III, IV e V) não relacionadas. O gene GLA foi analisado através da amplificação por PCR (reação em cadeia da polimerase) e sequenciamento de ambas as cadeias de DNA de toda a região codificadora e de regiões nas junções entre éxons e íntrons. Para todos os pacientes do sexo masculino e alguns do sexo feminino foi realizada a medida da atividade da enzima α-galactosidase em gota de sangue seca através da espectrometria de massa em tandem. RESULTADOS: Quatro diferentes mutações causadoras de DF foram encontradas e todas elas já foram relatadas previamente. Duas das cinco famílias compartilham a mesma mutação (p.A156D). Nas famílias I e V (ambas com mutação p.A156D) foi encontrado o mesmo polimorfismo (c.1000-22C> T), mas uma outra diferente variação foi encontrada apenas na Família I. DISCUSSÃO: Apesar do pequeno número de pacientes envolvidos neste estudo, este trabalho é o mais completo em análise de polimorfismos do gene GLA, incluindo todos os pacientes diagnosticados com a doença de Fabry do estado da Bahia-Brasil. A análise de alterações polimórficas sugere que duas das cinco famílias têm uma mesma origem ancestral. Mais estudos para avaliar esta hipótese estão ocorrendo neste momento, através da análise de haplótipos.

A doença de Fabry (DF) é uma doença lisossômica com herança ligada ao cromossomo X, causada pela deficiência na enzima alfa-galactosidase A (GLA), gerando acúmulo progressivo de globotriaosilceramida no interior dos lisossomos. O diagnóstico bioquímico de DF é baseado na medida da atividade enzimática da GLA e pode ser difícil em alguns casos, devido à diversidade de fenótipos encontrados e à diferença existente entre indivíduos masculinos (hemizigotos) e femininos (heterozigotos). Tendo em vista a necessidade de aprimoramento das técnicas utilizadas para este diagnóstico, o objetivo deste estudo foi estabelecer e comparar as propriedades bioquímicas e cinéticas da GLA em amostras de sangue impregnado em papel filtro (SPF), plasma e leucócitos de pacientes com DF e indivíduos saudáveis, bem como avaliar o uso de Nacetilgalactosamina (GalNAc) como inibidor da alfa-galactosidase B em ensaios realizados para os mesmos fins. A atividade da GLA foi caracterizada e comparada em termos de: pH ótimo, Km, Vmáx e termoestabilidade. Foram realizados ensaios para medida da atividade da GLA utilizando diferentes concentrações de GalNAc em amostras de SPF, plasma e leucócitos de controles e pacientes com DF. Foi observada diferença entre a Vmáx da GLA de pacientes com DF e controles saudáveis utilizando amostras de SPF, plasma e leucócitos. Em leucócitos, a préincubação a 50 °C por 1 hora foi efetiva para diferenciar pacientes com DF de controles. Foi observada diferença entre a atividade da alfa-galactosidase na ausência e presença de GalNAc, em todas as concentrações testadas do inibidor, utilizando amostras de SPF de mulheres com DF e amostras de plasma de homens com DF. Em plasma, atividade residual de mulheres e homens saudáveis diferiu em ensaios utilizando 50 mM de GalNAc, e a atividade residual de homens com DF foi menor que a atividade de homens saudáveis, para todas as concentrações testadas do inibidor. Em leucócitos, não foi observada diferença na atividade em diferentes concentrações de GalNAc, nem entre os grupos estudados. Os resultados da comparação das propriedades bioquímicas e cinéticas da GLA podem ser usados como ferramenta auxiliar para o diagnóstico da DF, especialmente em casos de pacientes cuja atividade da GLA se encontra dentro dos limites considerados normais. A utilização de GalNAc pode diminuir os resultados falsonegativos, principalmente quando utilizado amostras de SPF e plasma. Em leucócitos, o uso do inibidor parece não ser necessário. / Fabry disease (FD) is a lysosomal disorder with X-linked inheritance, caused by a deficiency in the enzyme alpha-galactosidase A (GLA), resulting in progressive accumulation of globotriaosylceramide within lysosomes. The biochemical diagnosis of FD is based on the measurement of GLA enzymatic activity and can be difficult in some cases due to the diversity of phenotypes and the difference between male (hemizygous) and female (heterozygous) subjects. Given the need for improvements in the diagnosis techniques, the aim of this study was to establish and compare the GLA biochemical and kinetic properties using dried blood spots (DBS), plasma and leukocytes samples of FD patients and healthy individuals, as well as evaluating the use of N-acetylgalactosamine (GalNAc) as an inhibitor of alpha-galactosidase B in assays for the same purposes. The GLA activity was characterized and compared in terms of pH optimum, Km, Vmax and thermostability. Assays for measuring GLA activity using different concentrations of GalNAc in DBS, plasma and leukocytes samples of FD patients and controls were performed. A difference was observed between the Vmax of FD patients and controls using DBS, plasma and leukocyte samples. In leukocytes, pre-incubation at 50 °C for 60 min was effective to differentiate FD patients from healthy controls. It was observed a difference between alphagalactosidase activity in the absence and presence of GalNAc at all concentrations of inhibitor tested, using DBS samples of women with FD and plasma samples of men with DF. In plasma, the residual activity of male and female healthy subjects differed in assays using 50 mM GalNAc, and the residual activity of men with FD was lower than the activity of healthy men, for all concentrations of the inhibitor. In leukocytes, no difference in GLA activity was observed neither at different concentrations of GalNAc nor between groups. The results comparing the biochemical and kinetic properties of GLA can be used as an auxiliary method to the FD diagnosis, especially in cases of patients whose GLA activity is within normal range. The use of GalNAc can decrease the false-negative results, especially when DBS and plasma samples are used. In leukocytes, the use of the inhibitor seems not to be necessary.

A doença de Fabry (DF) é uma doença lisossômica com herança ligada ao cromossomo X, causada pela deficiência na enzima alfa-galactosidase A (GLA), gerando acúmulo progressivo de globotriaosilceramida no interior dos lisossomos. O diagnóstico bioquímico de DF é baseado na medida da atividade enzimática da GLA e pode ser difícil em alguns casos, devido à diversidade de fenótipos encontrados e à diferença existente entre indivíduos masculinos (hemizigotos) e femininos (heterozigotos). Tendo em vista a necessidade de aprimoramento das técnicas utilizadas para este diagnóstico, o objetivo deste estudo foi estabelecer e comparar as propriedades bioquímicas e cinéticas da GLA em amostras de sangue impregnado em papel filtro (SPF), plasma e leucócitos de pacientes com DF e indivíduos saudáveis, bem como avaliar o uso de Nacetilgalactosamina (GalNAc) como inibidor da alfa-galactosidase B em ensaios realizados para os mesmos fins. A atividade da GLA foi caracterizada e comparada em termos de: pH ótimo, Km, Vmáx e termoestabilidade. Foram realizados ensaios para medida da atividade da GLA utilizando diferentes concentrações de GalNAc em amostras de SPF, plasma e leucócitos de controles e pacientes com DF. Foi observada diferença entre a Vmáx da GLA de pacientes com DF e controles saudáveis utilizando amostras de SPF, plasma e leucócitos. Em leucócitos, a préincubação a 50 °C por 1 hora foi efetiva para diferenciar pacientes com DF de controles. Foi observada diferença entre a atividade da alfa-galactosidase na ausência e presença de GalNAc, em todas as concentrações testadas do inibidor, utilizando amostras de SPF de mulheres com DF e amostras de plasma de homens com DF. Em plasma, atividade residual de mulheres e homens saudáveis diferiu em ensaios utilizando 50 mM de GalNAc, e a atividade residual de homens com DF foi menor que a atividade de homens saudáveis, para todas as concentrações testadas do inibidor. Em leucócitos, não foi observada diferença na atividade em diferentes concentrações de GalNAc, nem entre os grupos estudados. Os resultados da comparação das propriedades bioquímicas e cinéticas da GLA podem ser usados como ferramenta auxiliar para o diagnóstico da DF, especialmente em casos de pacientes cuja atividade da GLA se encontra dentro dos limites considerados normais. A utilização de GalNAc pode diminuir os resultados falsonegativos, principalmente quando utilizado amostras de SPF e plasma. Em leucócitos, o uso do inibidor parece não ser necessário. / Fabry disease (FD) is a lysosomal disorder with X-linked inheritance, caused by a deficiency in the enzyme alpha-galactosidase A (GLA), resulting in progressive accumulation of globotriaosylceramide within lysosomes. The biochemical diagnosis of FD is based on the measurement of GLA enzymatic activity and can be difficult in some cases due to the diversity of phenotypes and the difference between male (hemizygous) and female (heterozygous) subjects. Given the need for improvements in the diagnosis techniques, the aim of this study was to establish and compare the GLA biochemical and kinetic properties using dried blood spots (DBS), plasma and leukocytes samples of FD patients and healthy individuals, as well as evaluating the use of N-acetylgalactosamine (GalNAc) as an inhibitor of alpha-galactosidase B in assays for the same purposes. The GLA activity was characterized and compared in terms of pH optimum, Km, Vmax and thermostability. Assays for measuring GLA activity using different concentrations of GalNAc in DBS, plasma and leukocytes samples of FD patients and controls were performed. A difference was observed between the Vmax of FD patients and controls using DBS, plasma and leukocyte samples. In leukocytes, pre-incubation at 50 °C for 60 min was effective to differentiate FD patients from healthy controls. It was observed a difference between alphagalactosidase activity in the absence and presence of GalNAc at all concentrations of inhibitor tested, using DBS samples of women with FD and plasma samples of men with DF. In plasma, the residual activity of male and female healthy subjects differed in assays using 50 mM GalNAc, and the residual activity of men with FD was lower than the activity of healthy men, for all concentrations of the inhibitor. In leukocytes, no difference in GLA activity was observed neither at different concentrations of GalNAc nor between groups. The results comparing the biochemical and kinetic properties of GLA can be used as an auxiliary method to the FD diagnosis, especially in cases of patients whose GLA activity is within normal range. The use of GalNAc can decrease the false-negative results, especially when DBS and plasma samples are used. In leukocytes, the use of the inhibitor seems not to be necessary.

A doença de Fabry (DF) é uma doença lisossômica com herança ligada ao cromossomo X, causada pela deficiência na enzima alfa-galactosidase A (GLA), gerando acúmulo progressivo de globotriaosilceramida no interior dos lisossomos. O diagnóstico bioquímico de DF é baseado na medida da atividade enzimática da GLA e pode ser difícil em alguns casos, devido à diversidade de fenótipos encontrados e à diferença existente entre indivíduos masculinos (hemizigotos) e femininos (heterozigotos). Tendo em vista a necessidade de aprimoramento das técnicas utilizadas para este diagnóstico, o objetivo deste estudo foi estabelecer e comparar as propriedades bioquímicas e cinéticas da GLA em amostras de sangue impregnado em papel filtro (SPF), plasma e leucócitos de pacientes com DF e indivíduos saudáveis, bem como avaliar o uso de Nacetilgalactosamina (GalNAc) como inibidor da alfa-galactosidase B em ensaios realizados para os mesmos fins. A atividade da GLA foi caracterizada e comparada em termos de: pH ótimo, Km, Vmáx e termoestabilidade. Foram realizados ensaios para medida da atividade da GLA utilizando diferentes concentrações de GalNAc em amostras de SPF, plasma e leucócitos de controles e pacientes com DF. Foi observada diferença entre a Vmáx da GLA de pacientes com DF e controles saudáveis utilizando amostras de SPF, plasma e leucócitos. Em leucócitos, a préincubação a 50 °C por 1 hora foi efetiva para diferenciar pacientes com DF de controles. Foi observada diferença entre a atividade da alfa-galactosidase na ausência e presença de GalNAc, em todas as concentrações testadas do inibidor, utilizando amostras de SPF de mulheres com DF e amostras de plasma de homens com DF. Em plasma, atividade residual de mulheres e homens saudáveis diferiu em ensaios utilizando 50 mM de GalNAc, e a atividade residual de homens com DF foi menor que a atividade de homens saudáveis, para todas as concentrações testadas do inibidor. Em leucócitos, não foi observada diferença na atividade em diferentes concentrações de GalNAc, nem entre os grupos estudados. Os resultados da comparação das propriedades bioquímicas e cinéticas da GLA podem ser usados como ferramenta auxiliar para o diagnóstico da DF, especialmente em casos de pacientes cuja atividade da GLA se encontra dentro dos limites considerados normais. A utilização de GalNAc pode diminuir os resultados falsonegativos, principalmente quando utilizado amostras de SPF e plasma. Em leucócitos, o uso do inibidor parece não ser necessário. / Fabry disease (FD) is a lysosomal disorder with X-linked inheritance, caused by a deficiency in the enzyme alpha-galactosidase A (GLA), resulting in progressive accumulation of globotriaosylceramide within lysosomes. The biochemical diagnosis of FD is based on the measurement of GLA enzymatic activity and can be difficult in some cases due to the diversity of phenotypes and the difference between male (hemizygous) and female (heterozygous) subjects. Given the need for improvements in the diagnosis techniques, the aim of this study was to establish and compare the GLA biochemical and kinetic properties using dried blood spots (DBS), plasma and leukocytes samples of FD patients and healthy individuals, as well as evaluating the use of N-acetylgalactosamine (GalNAc) as an inhibitor of alpha-galactosidase B in assays for the same purposes. The GLA activity was characterized and compared in terms of pH optimum, Km, Vmax and thermostability. Assays for measuring GLA activity using different concentrations of GalNAc in DBS, plasma and leukocytes samples of FD patients and controls were performed. A difference was observed between the Vmax of FD patients and controls using DBS, plasma and leukocyte samples. In leukocytes, pre-incubation at 50 °C for 60 min was effective to differentiate FD patients from healthy controls. It was observed a difference between alphagalactosidase activity in the absence and presence of GalNAc at all concentrations of inhibitor tested, using DBS samples of women with FD and plasma samples of men with DF. In plasma, the residual activity of male and female healthy subjects differed in assays using 50 mM GalNAc, and the residual activity of men with FD was lower than the activity of healthy men, for all concentrations of the inhibitor. In leukocytes, no difference in GLA activity was observed neither at different concentrations of GalNAc nor between groups. The results comparing the biochemical and kinetic properties of GLA can be used as an auxiliary method to the FD diagnosis, especially in cases of patients whose GLA activity is within normal range. The use of GalNAc can decrease the false-negative results, especially when DBS and plasma samples are used. In leukocytes, the use of the inhibitor seems not to be necessary.

Submitted by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2012-07-23T13:34:54Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_CinéticaEnzimaAlfa-Galactosidase.pdf: 2284274 bytes, checksum: 84e0046c6ef967080654f5dc29d5c13b (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2012-07-23T13:52:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_CinéticaEnzimaAlfa-Galactosidase.pdf: 2284274 bytes, checksum: 84e0046c6ef967080654f5dc29d5c13b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-23T13:52:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_CinéticaEnzimaAlfa-Galactosidase.pdf: 2284274 bytes, checksum: 84e0046c6ef967080654f5dc29d5c13b (MD5) Previous issue date: 2011 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A Alfa-galactosidase A (α-Gal A) humana é uma enzima lisossômica que quando deficiente causa a doença de Fabry. A doença de Fabry é uma esfingolipidose cuja principal causa de morbi-mortalidade é a insuficiência renal crônica (IRC). O objetivo deste estudo foi a implantação de um protocolo laboratorial que permita o diagnóstico da doença de Fabry em plasma e leucócitos, além da análise das características cinéticas da enzima α-Gal A em plasma e busca ativa da doença em 25 indivíduos com IRC de causa desconhecida. Também foram avaliadas a reprodutibilidade e a estabilidade do método enzimático. A padronização dos ensaios foi realizada com o substrato fluorescente 4-metilumbeliferil-α-Dgalactopiranosídeo. A reprodutibilidade foi avaliada utilizando amostras de plasma aliquotadas a 4ºC, -20ºC e -70ºC, analisadas uma vez ao mês por 6 meses e a estabilidade da fluorescência por até 24 horas após o término do ensaio enzimático. A padronização permitiu a implantação de valores de referência da α-Gal A para o estado do Pará, de 4 a 28 nmoles/h/mL (plasma) e de 20 a 96 nmoles/h/mg proteína (leucócitos). A enzima α-Gal A se mostrou termolábil, visto que com apenas 1 minuto de pré-incubação das amostras a 60ºC, sua atividade decaiu 71,09%. Com relação ao tempo de incubação, a atividade enzimática apresentou uma disposição linear crescente entre 15 a 180 minutos de incubação. A α-Gal A apresentou maior atividade no pH 4,8, o Km encontrado para a α-Gal A foi de 1,007 mM e a Vmáx foi 30,9 nmoles/h/mL. A melhor temperatura de armazenamento de plasma até o ensaio enzimático é -20ºC, onde foi observada menor variação em um período máximo de 6 meses. O método enzimático utilizado é estável, mesmo após 24 horas do término do ensaio, em temperatura ambiente. Com relação aos pacientes com IRC de causa desconhecida, todos apresentaram valor de atividade da α-Gal A dentro dos parâmetros de referência e, portanto, nenhum foi diagnosticado com doença de Fabry. O entendimento da cinética da α-Gal A e do seu comportamento in vitro possibilita um melhor diagnóstico laboratorial da doença de Fabry gerando dados para futuras comparações com indivíduos afetados por mutações nesta enzima / Human alpha-galactosidase A (α-Gal A) is a lysosomal enzyme which is deficient in Fabry disease. Fabry disease is a sphingolipidosis which chronic kidney failure (CKF) is the most important cause of morbidity and mortality. The aim of this study was the establishment of a laboratorial protocol that allows the diagnosis of Fabry’s disease in plasma and leukocytes, the analysis of α-Gal A kinetic features in plasma and searching for potential Fabry patients in 25 individual with unknown CKF. Reproducibility and fluorescence stability of the enzymatic method were also evaluated. The assay standardization was realized with the fluorescent substrate 4- methylumbeliferil-α-D-galactopyranoside. Reproducibility was evaluated using plasma samples stored at a 4ºC, -20ºC and -70ºC, the assay was performed once a month until 6 months and fluorescence stability was evaluated until 24 hours after the end of the assay. The standardization allowed the establishment of value references to α-Gal A in Pará State, from 4 to 28 nmoles/h/mL (plasma) and 20 to 96 nmoles/h/mg protein (leukocytes). α-Gal A enzyme was thermolabile and 1 minute of preincubation at 60ºC was sufficient to decrease 71.09% of its entire activity. The activity of the α-Gal A enzyme increased progressively according to incubation time, between 15 and 180 minutes. Its activity was better at pH 4,8, the Km value for the α-Gal A enzyme was 1.007 mM, and maximum reaction velocity was 30.9 nmoles/h/mL. The best storage temperature for plasma samples was -20ºC that showed less variation until 6 months. The enzyme method is stable and even after 24 hours, at room temperature, the fluorescence remained the same. All CKF patients with unknown cause presented α-Gal A activity between normal values, therefore neither was diagnosed with Fabry disease. Understanding the kinetics of the α-Gal A enzyme and its in vitro behavior will contribute to improvements in the laboratory diagnosis of Fabry disease, and provide a diagnostic baseline for the analysis of individuals affected by mutations in this enzyme.

Orientador: Marcos Silveira Buckeridge / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T20:11:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_ClovisOliveira_D.pdf: 20554186 bytes, checksum: aa882a38d30a8d939c085c5dfd50f5db (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: No presente trabalho são efetuadas comparações entre a composição dos polissacarídeos de parede celular de grãos verdes de café colhidos de variedades diferentes de Coffea arabica e C. canephoraem que os frutos foram colhidosem umestágio específico de maturação (somente frutos avermelhados) com grãos verdes de cafés denominados conilon e arábica que são diretamente utilizados como matéria prima para a produção de café solúvel. Observou-se que no caso dos grãos colhidos em um estágio específico, as diferenças entre os conteúdos de pectinas e hemicelulosessão mínimas, enquanto para os grãos utilizados na indústria há maior rendimento de polissacarídeos (hemiceluloses) como um todo e há também uma diferença entre conilon e arábica. Umavez que se sabe que esta composição varia ao longo do processo de desenvolvimento do fruto, especula-se que o modo de colheita, que para no café colhido no campo inclui certa parcela de grãos verdes juntamente com frutos maduros, possa influenciar na composição final dos polissacarídeos nas sementes de café / Abstract: In the present work, comparisons. among the composition of cell wall polysaccharides of green coffee seeds were made with material collected from varieties of Coffea arabica and Coffea canephora in which fruits were harvested at the same developmental stage (red fruits) with green coffee beans from two varieties (arabica and conilon) used as raw material for production of soluble coffee. We observed that for seeds collected from red fruits, the differences found between pectins and hemicelluloses were minimal, whereas for the seeds used as raw material for industry conilon and arabica differed. As it is knownthat cell wall composition varies in the seeds during fruit development, it is speculated hat the harvesting mode, which in the field includes green beans along with the red mature fruits, might influence the final composition of the polysaccharides in coffee seeds / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural