Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Insulin is a hormone that plays a central role in the regulation of human metabolism, and as a drug, is used in the treatment of diabetes mellitus. Hyperglycemia characterizes this condition due to a range of reasons from impaired insulin production by pancreatic beta cells to abnormalities resulting in resistance to insulin action. Depending on time and mechanism of action, the main types of insulin analogs are basal and prandial. Basal insulin analogs are slow-acting insulins that maintain a continuous basal level of insulin in the bloodstream. Prandial insulin analogs are fast-acting and their therapeutic goal is to avoid immediate and late post-prandial hyperglycemia. Most analogs face the problem of chemical degradation and amyloid-like fibril formation (fibrillation) in delivery devices. Thus, many modifications have been made to insulin in the effort to make it more stable and faster-acting. This thesis aims to study the effects of modifications that could be used to design an insulin analog with improved chemical and physical properties, while maintaining biological activity. We studied six amino-acid substitutions to native human insulin in different combinations: desB1 , AB2 , EB3, EA8 , EA14, and EB29. Analogs of the protein were chemically synthesized. Then, fibrillation and circular dichroism assays were performed using purified proteins. The results suggested that EB3 and EA14 are stabilizing modifications that prevent fibril formation, whereas EA8 and EA14 increase the structural stability of an analog. Our findings also suggested that certain modifications in isolation may not impact overall stability, but when combined with others, may show detectable effects, which is why EA8 and EA14 became the focus of further experiments. Cell-based activity assays indicated that all the analogs had similar biological activities. Future work will assess chemical degradation, solubility, amide proton exchange (as monitored by NMR), and mitogenicity.

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L'adénosine est un nucléoside ubiquitaire issu de la déphosphorylation de l'ATP qui est libéré par les cellules endothéliales et les myocytes lors de l'hypoxie, de l'ischémie ou du stress oxydatif. Elle exerce un contrôle puissant sur les systèmes nerveux, immunitaire et cardiovasculaire par l'intermédiaire de quatre récepteurs membranaires : A1R, A2AR, A2BR et A3R. La compréhension de l'implication du système adénosinergique dans le système cardiovasculaire implique la possibilité technique d'un dosage de l'adénosine endogène et la quantification de l'expression de ses récepteurs. L'adénosine ayant globalement une action hypotensive (via les récepteurs A2AR) et chronotrope négative (via les récepteurs A1R), nous nous sommes intéressés à son implication chez les patients présentant des syncopes neurocardiogéniques, la bradycardie et l'hypotension étant 2 signes cardinaux dans ce syndrome. Les manifestations cliniques de cette affection peuvent être reproduites par le test d'inclinaison (HUT) et/ou le test à l'ATP. Dans un premier temps nous avons réalisé des dosages d'adénosine plasmatiques chez ces patients au moment d'un test d'inclinaison. Les concentrations en adénosine étaient élevées chez les patients présentant un test positif. Par la suite, nous avons comparé les concentrations en adénosine plasmatiques et l'expression des récepteurs A2A en fonction du résultat du test d'inclinaison et du test à l'ATP. / Adenosine is a ubiquitous nucleoside that comes from the dephosphorylation of ATP and which is released during hypoxia or oxidative stress, by endothelial cells and myocytes. Adenosine interacts on its cell surface receptors, namely A1R, A2AR, A2BR and A3R, to exert physiological effects on target tissues. Our knowledge about the adenosinergic system was improved because of our ability to measure adenosine plasma levels and to quantify its receptors expression. Because adenosine, via A1 or A2A receptor activation leads to bradycardia and hypotension, we first tried to understand the implication of the adenosinergic system in patients with neurocardiogenic syncope (NMS for neutrally mediated syncope). Indeed, this syndrome is characterized by relative or absolute bradycardia associated with a drop in blood pressure and a loss of consciousness. The symptomatology can be reproduced by the tilt test (HUT) or by the intravenous administration of ATP (ATP test). First, we measured adenosine plasma levels in patients with NMS just before and during HUT. We found that adenosine plasma levels were higher in patients with a positive HUT. Then, we compared adenosine plasma levels and the expression of A2A receptors in patients with NMS depending on the result of HUT and ATP-test. We found that elevated adenosine plasma levels and A2A receptors overexpression were associated with positive HUT. On the opposite, low adenosine plasma levels and normal expression of A2A receptor were associated with positive ATP test.

Les mutations du gène SCN5A, codant la sous-unité ? du canal Na+ cardiaque Nav1.5, sont responsables d'arythmies cardiaques héréditaires. La pénétrance incomplète observée dans ces maladies suggère l'existence d'autres facteurs modulant le phénotype associé à ces mutations. Dans ce travail de thèse, nous avons caractérisé deux mutations identifiées dans SCN5A. Le mutant R104W, identifié chez un patient atteint du syndrome de Brugada, est retenu dans le réticulum endoplasmique (RE), dégradé par le protéasome et abolit le courant Na+. Co-exprimé avec le canal sauvage, R104W conduit à la rétention de celui-ci dans le RE, résultant en un effet dominant négatif sur les canaux sauvages. Nous avons démontré que ce nouveau mécanisme mettait en jeu une interaction entre les sous-unités ? de Nav1.5. La mutation R1860Gfs*12 a été identifiée dans une famille présentant des arythmies auriculaires. Dans un système d'expression hétérologue, ce mutant induit à la fois une perte et un gain de fonction de Nav1.5. La modélisation informatique nous a permis de montrer que la perte de fonction était plus prononcée dans les cellules auriculaires que ventriculaires. De plus, nous avons montré que la présence de polymorphismes en amont du gène PITX2 dans cette famille pouvait expliquer la variabilité des phénotypes observés. En conclusion, l'interaction entre les sous-unités ? de Nav1.5, les propriétés électriques différentes entre oreillette et ventricule et la présence de polymorphismes chez les patients porteurs de mutations SCN5A sont des facteurs importants dans l'interprétation des effets fonctionnels de ces mutations, contribuant à la variabilité phénotypique des canalopathies Na+. / Mutations in the SCN5A gene, which encodes the α-subunit of the cardiac sodium channel Nav1.5, are implicated in different inherited cardiac arrhythmias. The incomplete penetrance observed in these diseases suggests the existence of other factors modulating the phenotype of these mutations. In this thesis work, we characterized two mutations identified in SCN5A. The R104W mutant identified in a patient with Brugada syndrome is retained in the endoplasmic reticulum (ER), degraded by the proteasome and abolishes the sodium current. Co-expressed with wild type (WT) channels, R104W leads to WT channels ER retention, causing a dominant-negative effect. We demonstrated that interaction between Nav1.5 α-subunits is responsible for the retention and the dominant-negative effect. The R1860Gfs*12 mutation was identified in a family with atrial arrhythmias. In a heterologous system, this mutant induces both loss- and gain-of-function effects on Nav1.5. Computer-model simulation showed that the loss-of-function was more pronounced in atrial than in ventricular cells. In addition, we showed that the presence of polymorphisms upstream of the PITX2 gene could explain the observed phenotypic variability in this family. In conclusion, the interaction between the α-subunits of Nav1.5, the different electrical properties between atria and ventricles and the presence of polymorphisms in patients with SCN5A mutations, are important factors in the interpretation of the functional effects of these mutations, which could explain the phenotypic variability of sodium channelopathies.

Reproduction de : Thèse d' exercice : Médecine générale : Nancy 1 : 2002. / Thèse : 2002NAN11100. Titre provenant de l'écran-titre.

Responsable d’un quart des accidents vasculaires cérébraux, la fibrillation auriculaire (FA) est l’arythmie cardiaque la plus répandue. La thérapie d’ablation par cathéter (CA) est de plus en plus utilisée pour traiter la FA, mais ses effets sur le substrat cardiaque ne sont pas suffisamment compris, d’où un taux de réussite très variable. L’électrocardiogramme (ECG) à 12 voies représente un outil non invasif peu coûteux pour caractériser la FA à partir de l’activité électrique du cœur. Cependant, les prédicteurs classiques de l’issue de la CA présentent plusieurs inconvénients, notamment leur calcul manuel sur une seule voie de l’ECG. Cette thèse exploite explicitement le caractère multi-capteur de l’ECG au moyen de techniques de décomposition multivariées, démontrant qu’elles peuvent améliorer la puissance prédictive de certaines propriétés de l’ECG dans le cadre de la CA. L’amplitude des ondes fibrillatoires est corrélée avec le résultat de la CA, et traitée par une méthode multi-capteur basée sur l’analyse en composantes principales (PCA). Des variantes comme la PCA pondérée (WPCA) et la factorisation en matrices non négatives (NMF) peuvent aussi quantifier la variabilité spatio-temporelle de la FA sur l’ECG. La théorie de l’information permet également d’estimer le niveau de corrélation entre les voies de l’ECG, mis en relation avec le résultat de la CA grâce à des approches multi-capteurs. Enfin, une dernière ligne de recherche concerne la réponse ventriculaire manifestée sur la variabilité cardiaque. L’approche paramétrique de processus ponctuel est capable de souligner certaines propriétés de cette variabilité, améliorant ainsi la caractérisation de la FA. / Atrial fibrillation (AF) is the most common sustained arrhythmia encountered in clinical practice, and one of the main causes of stroke. Yet its thorough characterization and treatment remain an open issue. Despite the increasing popularity of the radiofrequency catheter ablation (CA) therapy, very little is known about its impact on heart substrate, leading to rather uncertain success rates. This calls for advanced signal processing tools for quantitatively assessing CA outcome. The surface 12-lead electrocardiogram (ECG), a noninvasive and cost-effective cardiac activity recording modality, provides valuable information about AF. However, some issues affect most of the standard CA outcome predictors, e.g., manual computation and limited single-lead perspective. This thesis aims at explicitly exploiting the ECG’s multilead character through multivariate decomposition tools, so as to enhance the role of some ECG features as CA outcome predictors. Fibrillatory wave amplitude is correlated with CA success in a multilead framework through principal component analysis (PCA). Multivariate approaches also enhance AF spatiotemporal variability measured on the ECG (e.g., weighted PCA, nonnegative matrix factorization), evidencing that the less repetitive the AF pattern, the less likely CA success. Information theory also quantifies interlead similarity between AF patterns, and is linked with CA outcome in a multilead framework. Another perspective focuses on the ventricular response as reflected on heart rate variability (HRV). Point process modeling can highlight certain HRV properties typical of AF in a parametric probabilistic context, helping AF pattern recognition.

La fibrillation atriale est la plus fréquente des arythmies cardiaques et sa physiopathologie reste mal comprise. Il n’existe pas actuellement de modèle animal dans lequel cette arythmie survienne de manière spontanée. Comme l’âge et l’hypertension artérielle sont deux facteurs de risque majeurs dela fibrillation atriale chez l’Homme, nous avons recherché si le rat spontanément hypertendu (SHR)vieillissant (11-13 mois d’âge) développe cette pathologie. Des enregistrements télémétriques de 24 h de l’électrocardiogramme (ECG) ont été réalisés dans 4 groupes de rats vigils. Ils ont révélé chez le rat SHR vieillissant la présence de nombreux épisodes de tachyarythmie atriale non soutenus, épisodes qui ne sont pas observés chez le rat SHR jeune ni chez lerat normotendu Wistar Kyoto jeune ou vieillissant. Les résultats rapportés ci-dessus ont été obtenus grâce à l’analyse visuelle de l’intégralité de chaque enregistrement ECG, ce qui représente une durée d’analyse incompatible avec des expérimentations de routine. Nous avons donc choisi de développer une méthode automatique de reconnaissance des arythmies atriales chez le rat vigil. Cette méthode utilise exclusivement les intervalles RR car les ondes P ne peuvent pas toujours être identifiées avec fiabilité dans les enregistrements télémétriques de l’ECG. Elle repère les motifs caractéristiques de tachyarythmie grâce à une structure d’automate, et présente une bonne performance sur les enregistrements télémétriques déjà réalisés. Le nouveau modèle animal, conjointement à la nouvelle méthode automatique d’analyse de l’ECG, devrait permettre de réaliser les analyses phénotypiques de qualité indispensables aux hypothèses physiopathologiques moléculaires actuellement avancées dans la fibrillation atriale. / Atrial fibrillation is the most common cardiac arrhythmia and its pathophysiology is still poorly understood. To date, there is no animal model in which the arrhythmia occurs spontaneously. As ageand hypertension are major risk factors of atrial fibrillation in humans, we examined whether the aging (11-13 months of age) spontaneously hypertensive rat (SHR) develops this pathology. Telemetric recordings of electrocardiogram (ECG) were obtained in four groups of conscious rats. They revealed the presence in the aging SHR of many non-sustained atrial tachyarrhythmic episodes that were observed neither in the young SHR nor in the young or aging normotensive Wistar Kyotorat. These results were obtained by visual examination of the whole ECG recordings, which is extremely time consuming and thus, not compatible with routine experiments. Therefore, we chose to develop an automated method to detect atrial arrhythmias in the conscious rat. This method only uses RR intervalsbecause P waves cannot always be accurately identified in telemetric recordings. It recognizes characteristicpatterns of tachyarrhythmia by using an automaton structure, and shows a good performance when applied to previously collected telemetric data. The new animal model, together with the new, automated method of ECG analysis, are expected to be extremely useful for producing high quality phenotypic data, which are necessary to test present molecular hypotheses of atrial fibrillation pathophysiology.

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La fibrillation auriculaire représente la forme la plus commune d'arythmie cardiaque. Il a été démontré que les acides gras oméga 3 possèdent un effet protecteur au niveau des arythmies ventriculaires. Toutefois, très peu d'études, et pour la plupart très récentes, se sont attardées aux effets de ces acides gras sur les arythmies supraventriculaires. Un premier projet a donc porté sur l'étude des effets des acides gras oméga 3 quant à l'induction de la fibrillation auriculaire chez le chien, en plus d'analyser les niveaux d'expression de protéines formant les jonctions gap. Le diabète constitue un facteur prédisposant pour la fibrillation auriculaire. Dans un second projet, certains paramètres cliniques et des prélèvements d'oreillettes humaines ont été étudiés afin de vérifier si des différences électrophysiologiques étaient présentes entre des patients diabétiques de type 2 et des patients non diabétiques. Les potentiels d'action et les niveaux d'expression de certaines protéines ont été analysés.

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