Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) est un facteur de transcription hétérodimérique ubiquitaire responsable de l’activation de nombreux gènes essentiels à l’adaptation des cellules suite à une diminution de la disponibilité en oxygène. En raison de l’induction du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), une puissante molécule pro-angiogénique, HIF-1 joue un rôle particulièrement important au niveau des cellules vasculaires et dans la formation de nouveaux vaisseaux sanguins. Dernièrement, plusieurs études ont clairement démontré que la sphingosine-1-phosphate (S1P) est également un facteur pro-angiogénique majeur. Relâché dans le sérum principalement par les plaquettes activées, ce phospholipide bioactif vital lie et stimule des récepteurs spécifiques des cellules endothéliales (ECs) et musculaires lisses vasculaires (VSMCs), engendrant ainsi une variété de réponses cellulaires cruciales et essentielles dans la régulation du système vasculaire dont la prolifération, la migration et la survie. D’autres études ont clairement démontré que des stimuli non-hypoxiques peuvent aussi mener à l’activation de HIF-1 en conditions normales d’oxygénation. Puisque HIF-1 et S1P jouent un rôle central au niveau de l’angiogenèse et de la biologie des cellules vasculaires et qu’ils sont tout deux impliqués dans la pathogénèse de maladies comme l’athérosclérose et le cancer, cette thèse visait à déterminer le rôle potentiel de la S1P dans l’induction et l’activation de HIF-1 au niveau vasculaire et à identifier les mécanismes moléculaires conduisant à cette activation. Brièvement, nous montrons que le traitement des ECs et des VSMCs avec la S1P induit fortement l’expression de la protéine HIF-1αla sous-unité active de HIF-1. Le complexe nucléaire ainsi formé est actif transcriptionnellement et se lie spécifiquement à la séquence promotrice de ses gènes cibles. Nous démontrons également que la stabilisation protéique, indépendante de pVHL (protéine von Hippel-Lindau), est le mécanisme principal à l’origine de cette induction et ce, suite à l’activation spécifique du récepteur S1P2. Finalement, l’expression de gènes dépendants de HIF-1, apportée par la S1P, est fortement diminuée suite à l’utilisation d’ARN interférants ciblant la protéine HIF-1α. Nous croyons que les résultats de ces travaux, qui identifient S1P comme étant un nouvel et puissant activateur de HIF-1, auront un impact certain sur différents aspects de la biologie vasculaire. / Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) is a ubiquitous heterodimeric transcription factor responsible for the activation of many genes essential for adaptation to low oxygen conditions. Among these genes, HIF-1 strongly induces vascular endothelial growth factor (VEGF), a potent angiogenic molecule. Therefore, HIF-1 plays a crucial role in vascular cell biology and the formation of new blood vessels. Recent studies have clearly shown that sphingosine-1-phosphate (S1P) is also a key player in the angiogenic process. Released into circulation mainly upon platelet activation, this bioactive phospholipid binds to and activates specific receptors located on vascular endothelial (ECs) and smooth muscle cells (VSMCs). This leads to the stimulation of a wide range of essential vascular cell responses like proliferation, migration and survival, which are crucial in the regulation of the vascular system. Other studies have shown that non-hypoxic stimuli can also activate HIF-1 in oxygenated conditions. Since S1P and HIF-1 are both important regulators of vascular cell biology and especially angiogenesis and that they are also both implicated in the pathogenesis of different diseases like atherosclerosis and cancer, the goal of the present thesis was to determine whether S1P can modulate the vascular induction and activation of HIF-1 and to identify the molecular mechanisms underlying this activation. Briefly, we show that treatment of ECs and VSMCs leads to a strong induction of HIF-1α protein levels through the specific activation of the S1P type-2 receptor in a time and dose-dependant manner. We also demonstrate that the S1P-dependant HIF-1 nuclear complex formation, achieved through pVHL-independent (protein von Hippel-Lindau) stabilization of HIF-1α, is transcriptionally active and specifically binds to hypoxia-responsive elements. Moreover, S1P activates the expression of genes known to be closely regulated by HIF-1 and this induction could be blocked by the use of RNA interference oligonucleotides targeting HIF-1α protein. Thus, this work identifies S1P as a novel and potent non-hypoxic activator of HIF-1. We believe that understanding the role played by HIF-1 in S1P gene regulation will have a strong impact on different aspects of vascular biology.

Note sur les annexes : 3 documents de format excel accompagnant le chapitre 7: Identification of MEF2A, MEF2C, and MEF2D Interactomes in Basal and Stimulated MA-10 Leydig Cells. «The complete list of identified proteins is provided in Supplementary Table S1. Proteins that passed all cutoff criteria are presented in Supplementary Table S2.» «To explore the biological roles of MEF2-interacting proteins, an enrichment analysis was next performed using the ShinyGO 0.80 platform (Ge et al., 2020). The proteins were classified by Gene Ontology (GO) terms and KEGG pathways, using the complete set of proteins identified by LC-MS/MS in our TurboID experiments as the background to reduce selection bias, as recommended by the platform developers. Detailed results are provided in Supplementary Table S3.» / Les cellules de Leydig des mammifères, situées dans l'espace interstitiel des testicules, sont la principale source de testostérone chez les mâles, une hormone nécessaire au développement et au maintien des caractéristiques sexuelles masculines et à la fertilité. Parmi les principaux facteurs de transcription régulant l'expression génique et la stéroïdogenèse dans les cellules de Leydig se trouvent les protéines MEF2 (myocyte enhancer factor 2), qui jouent un rôle important dans la fonction testiculaire, depuis le développement gonadique précoce jusqu'à l'âge adulte. Cependant, les mécanismes d'action par lesquels MEF2 exerce ses effets, notamment par ses interactions avec d'autres protéines dans les cellules de Leydig, restent en grande partie inexplorés. Cette thèse comble cette lacune en étudiant les rôles fonctionnels de MEF2 dans la régulation de l'expression génique et la fonction des cellules de Leydig, en mettant un accent particulier sur l'identification et la caractérisation de ses partenaires moléculaires. La première partie de ce travail, présentée dans le Chapitre 6, a exploré la relation entre MEF2 et la signalisation ERK5 dans les cellules de Leydig, démontrant pour la première fois qu'ERK5 est présent dans ces cellules et joue un rôle clé dans la régulation de la stéroïdogenèse. Nous avons révélé qu'ERK5 coopère avec les facteurs MEF2 dans les cellules de Leydig et, plus spécifiquement, qu'il augmente la transcription du gène *Nr4a1* par MEF2C. Cette coopération dépend de deux motifs de reconnaissance de MEF2 au sein du promoteur de *Nr4a1*. Cette étude identifie ERK5 comme un nouveau régulateur de l'activité de MEF2 dans les cellules de Leydig et fournit de nouvelles pistes potentielles sur les mécanismes régulant l'expression génique et la fonction des cellules de Leydig. La deuxième partie de la thèse, présentée dans le Chapitre 7, implique une analyse approfondie de l'interactome de MEF2 dans les cellules de Leydig dans des conditions basales et stéroïdogéniquement actives. En utilisant la méthode de marquage de proximité TurboID, nous avons identifié des réseaux d'interactions protéine-protéine distincts pour MEF2A, MEF2C et MEF2D. Cette analyse comparative des interactions de MEF2 dans deux états physiologiques différents a fourni de nouvelles perspectives sur la diversité fonctionnelle et les mécanismes régulateurs de MEF2 dans les cellules de Leydig. En résumé, les résultats présentés dans cette thèse élargissent de manière significative notre compréhension des rôles et des mécanismes des facteurs MEF2 dans la biologie des cellules de Leydig, notamment en ce qui concerne leurs réseaux d'interaction. / Leydig cells, located in the interstitial space of the mammalian testes, are the primary source of testosterone in males, a hormone required for the development and maintenance of male sex characteristics and fertility. Among the key transcription factors regulating gene expression and steroidogenesis in Leydig cells are the MEF2 (myocyte enhancer factor 2) family, which have been shown to play an important role in testis function from early gonadal development through adulthood. However, the mechanisms of action by which MEF2 exerts its effects, particularly through interactions with other proteins in Leydig cells, remain largely unexplored. This thesis addresses this gap by investigating the functional roles of MEF2 in regulating gene expression and function in Leydig cells, with a particular focus on identifying and characterizing its molecular partners. The first part of this work, presented in Chapter 6, explores the relationship between MEF2 and ERK5 signaling in Leydig cells, and demonstrates for the first time that ERK5 is present in these cells and plays a key role in the regulation of steroidogenesis. We revealed that ERK5 cooperates with MEF2 factors in Leydig cells and more specifically, enhances MEF2C-driven transcription of the *Nr4a1* gene. This cooperation is dependent on two specific MEF2 binding elements within the *Nr4a1* promoter. This study identifies ERK5 as a new regulator of MEF2 activity in Leydig cells and provides potential new insights into mechanisms that regulate Leydig cell gene expression and function The second part of the thesis, presented in Chapter 7, involves a comprehensive analysis of the MEF2 interactome in Leydig cells under basal and steroidogenically stimulated conditions. Using TurboID-based proximity labeling, we identified distinct protein-protein interaction networks for MEF2A, MEF2C, and MEF2D. This comparative analysis of MEF2 interactions across the two different physiological states has provided novel insights into the functional diversity and regulatory mechanisms of MEF2 in Leydig cells. In summary, the findings presented in this thesis significantly expand our understanding of the roles and mechanisms of MEF2 factors in Leydig cell function, and particularly with regard to their interaction networks.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Leptosphaeria maculans ‘brassicae’ (Lmb) est un ascomycète de la classe des Dothideomycètes faisant partie d’un complexe d’espèces présentant différents niveaux d’adaptation au colza. Lmb est responsable d’une des maladies les plus dommageables sur colza : la nécrose du collet. Lmb présente un cycle de vie complexe au cours duquel il alterne différents modes de vie, traduisant l’existence de mécanismes de régulation fine de l’expression des gènes lui permettant de s’adapter rapidement à de nouvelles conditions. Le séquençage de son génome a révélé une structure originale, avec l’alternance de deux types de régions : les isochores GC et les isochores AT. Alors que les isochores GC sont riches en gènes, les isochores AT sont pauvres en gènes et présentent des caractéristiques de l’hétérochromatine (régions génomiques riches en éléments transposables et présentant un faible taux de recombinaison). Bien que pauvres en gènes, les isochores AT représentent une « niche écologique » pour les gènes codant des effecteurs puisque 20 % des gènes des isochores AT codent des effecteurs putatifs contre seulement 4 % des gènes localisés en isochores GC. Les gènes codant des effecteurs situés en isochores AT présentent un comportement transcriptionnel différent de ceux localisés en isochores GC : une faible expression pendant la croissance mycélienne et une forte induction d’expression pendant l’infection primaire du colza. Sur la base de ces observations, l’objectif de ma thèse était de caractériser le déterminisme de la co-expression des effecteurs situés dans les isochores AT et en particulier d’évaluer si la régulation de l’expression de ces gènes se fait par un contrôle épigénétique lié à leur localisation particulière et/ou par l’intervention de régulateurs communs. Afin de déterminer le rôle de la structure des isochores AT, l’analyse fonctionnelle de protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine (i.e. HP1, DIM-5 et DMM-1) a été réalisée et leur implication dans la régulation de l’ensemble des gènes prédits dans le génome de L. maculans a été évaluée. Cette étude a permis de démontrer l’implication de la structure hétérochromatinienne des isochores AT dans la répression de l’expression pendant la croissance mycélienne des gènes situés dans cet environnement génomique, en particulier les gènes codant des effecteurs. Parmi les gènes sous contrôle épigénétique, nous avons pu observer qu’en plus des gènes localisés en isochores AT, des zones en isochores GC étaient aussi affectées et pouvaient constituer des « hot-spots » de contrôle épigénétique. Afin d’identifier des régulateurs candidats pouvant être impliqués dans le contrôle de l’expression des effecteurs pendant l’infection, le répertoire des gènes codant des facteurs de transcription (FTs) chez Lmb a été établi et l’analyse de la conservation de ce répertoire parmi les autres espèces du complexe d’espèces Leptosphaeria a permis d’identifier les FTs spécifiques, ou spécifiquement sur-exprimés pendant l’infection du colza, chez Lmb. Des candidats ont été sélectionnés pour réaliser leur analyse fonctionnelle : des gènes codant des FTs sur-exprimés pendant l’infection (9 FTs) ainsi que les orthologues de FTs qui avaient été décrits chez d’autres espèces comme régulateurs majeurs de la pathogénie (StuA, Sge1 et Fox1). L’analyse fonctionnelle de FTs candidats a permis d’établir que StuA, comme chez d’autres champignons phytopathogènes, joue un rôle important dans la mise en place de l’infection et l’expression des effecteurs chez L. maculans. Le « silencing » d’un FT de type AT-Hook, famille de FTs se fixant préférentiellement au niveau de séquences riches en AT, a un fort effet sur la pathogénie du champignon et entraîne une diminution d’expression de 2 effecteurs. Cette thèse a permis d’apporter de nouveaux éléments concernant la régulation des gènes codant des effecteurs chez un champignon phytopathogène impliquant, pour la première fois, un mécanisme épigénétique. / Leptosphaeria maculans is an ascomycete belonging to the Dothideomycete class and is part of a species complex showing different level of adaptation toward oilseed rape. Within this species complex, Lmb is responsible for the most damaging disease of this crop: “stem canker”. Lmb presents a complex life cycle during which it alternates between different life styles and nutritional strategies underlying the involvement of precise regulatory networks for gene expression to rapidly adapt to new conditions. The sequencing of the Lmb genome has revealed an unusual structure, alternating two types of regions, GC- and AT-isochores. While GC-isochores are gene-rich, AT-isochores are gene-poor and have several characteristics of heterochromatin (they are rich in transposable elements and present a lower rate of recombination compared to GC-isochores). Although gene-poor, AT-isochores are “ecological niches” for effector genes as 20% of the genes in these regions encode for putative effectors against only 4% of the genes in GC-isochores. Effector-encoding genes located in AT-isochores present a different transcriptional behavior compared to those located in GC-isochores: a very low expression in axenic culture and a drastic increase in expression during primary leaf infection. On these bases, the aim of my thesis was to characterize the determinism of the concerted effector gene expression. Are AT-isochores targets of reversible epigenetic modifications that affect the regulation of effector genes? and/or are one or several common regulators involved in the control of the concerted expression of effector genes? To assess the role of the structure of AT-isochores, functional analysis of three key players involved in chromatin remodeling (i.e. HP1, DIM-5 and DMM-1) was performed and their role in global gene expression was assessed. This study validated that heterochromatic structure of AT-isochores represses expression of genes located in such a genomic environment, notably effector genes. Among genes under an epigenetic control, we also identified genes located in GC-isochores that were similarly influenced and may represent “hot spots” for epigenetic control. To identify putative regulators of effector gene expression, we established the complete repertoire of transcription factors (TFs) of Lmb and by analyzing the conservation of this repertoire among species of the Leptosphaeria species complex, we identified TFs specific of Lmb, or specifically induced during infection. Functional analysis of 12 TFs was set up: nine TF-encoding genes induced during infection and three orthologs of TFs described as required for pathogenesis in other phytopathogenic fungi (StuA, Sge1, Fox1). This functional analysis showed that StuA, as in other phytopathogenic fungi, plays a major role in infection and expression of effector genes in Lmb. The silencing of an AT-Hook type TF, family of TFs that specifically interact with AT-rich sequences, was associated with a reduction of the expression of two effector genes during infection and with pathogenicity defects. This study brought new insights into the regulation of effector genes in a phytopathogenic fungus involving, for the first time, an epigenetic mechanism.

Les composés phénoliques de la baie, et plus particulièrement les flavonoïdes (flavonols, tanins condensés, anthocyanes), constituent un des paramètres clés contrôlant la qualité organoleptique du raisin et du vin. Ils représentent également une source de molécules antioxydantes d’intérêt grandissant pour les industries pharmacologiques, agro-alimentaires et cosmétiques. De nombreux travaux réalisés sur les plantes modèles ont démontré que la régulation de la voie de biosynthèse des flavonoïdes est essentiellement gouvernée par des facteurs de transcription de type MYB, bHLH et des protéines de type WD40. Chez la Vigne (Vitis vinifera L.), plusieurs facteurs de transcription de type MYB régulant la voie des anthocyanes et/ou des tanins condensés ont déjà été identifiés. Cependant, aucun facteur de transcription de type bHLH ou WD40 n’a encore été caractérisé. Différentes approches ont été mises en œuvre pour identifier de nouveaux régulateurs de la voie des flavonoïdes chez la Vigne. Dans un premier temps, le facteur de transcription VvMYB5b a été utilisé comme appât dans une approche de double hybride non ciblé chez la Levure (Saccharomyces cerevisiae). Dans un deuxième temps, le promoteur d’un gène codant une enzyme centrale de la voie de biosynthèse des flavonoïdes, VvDFR, a été choisi afin de développer une approche de simple hybride non ciblé chez la Levure. Enfin, une approche ciblée vers des « gènes candidats » a permis l’identification des facteurs de transcription de type bHLH VvMYC1 et VvMYCA1. Le profil d’expression de VvMYCA1 correspond à celui de l’accumulation des tanins condensés dans la pellicule, et celui de VvMYC1 corrèle avec le profil de synthèse des flavonols, des anthocyanes et des tanins condensés dans la baie de raisin, ainsi que dans les inflorescences. De plus, VvMYC1 peut interagir avec différents partenaires MYB de Vigne régulant la synthèse des anthocyanes et/ou des tanins condensés, à la fois dans la Levure mais également in planta, où l’interaction VvMYC1/VvMYBs affecte l’expression de gènes structuraux tels que l’UFGT et l’ANR. Cette interaction induit une synthèse d’anthocyanes, aussi bien en système homologue qu’en système hétérologue (Tabac et Arabidopsis). Enfin, des essais complémentaires impliquant le promoteur de VvMYC1 ont permis de démontrer que VvMYC1, en interagissant avec VvMYBPA1, peut moduler sa propre expression in vivo. / Phenolic compounds, and more specifically flavonoids (flavonols, condensed tannins and anthocyanins), are key components of the grapevine and wine quality. Because of their antioxidant activities, these compounds are of interest in pharmacological and cosmetic industries, as well as being beneficial to the human diet. Previous work on model plants showed that the flavonoid pathway was mainly regulated by the MYB and bHLH transcription factors, and WD40 proteins. In the grapevine (Vitis vinifera L.), only MYB regulators have been identified until now, and no bHLH or WD40 have been characterised. In this work, several approaches were used to identify new transcription factors involved in grapevine flavonoid biosynthesis. Firstly, the VvMYB5b protein was used as a bait in a large scale two hybrid experiment in yeast (Saccharomyces cerevisiae). Secondly, the promoter of the VvDFR gene, coding a central enzyme of the flavonoid pathway, was chosen to conduct a large scale one hybrid experiment, also in yeast. Finally, a “gene candidate” approach allowed identification of the bHLH transcription factors VvMYC1 and VvMYCA1. VvMYCA1 expression profile in berry skin and seeds correlates with condensed tannins synthesis, whereas VvMYC1 transcript accumulation in these tissues and the grapevine inflorescence correlates with condensed tannins, anthocyanins and flavonols accumulation. In yeast, VvMYC1 could physically interact with different MYB partners regulating the anthocyanin or the condensed tannins biosynthesis. This interaction was confirmed by transient promoter assays in grape cell suspensions, where co-expression of VvMYC1 with specific MYB partners activated the UFGT and ANR promoters. Likewise, this interaction induced anthocyanin accumulation in grape cells, as well as in tobacco leaves and Arabidopsis. Eventually, additional transient promoter assays revealed that VvMYC1 is involved, with VvMYBPA1, in feedback regulation of its own expression.

Proefschrift--Universiteit Leiden, 2003. / Bibliogr. en fin de chap.

Thèse de doctorat : Génétique humaine : Paris 12 : 2005. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. : 210 réf.

Thèse de doctorat : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie : Strasbourg 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 188-205.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 194-221. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 154-182. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.