Doctor en Farmacología / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas, hasta diciembre de 2018 / El cáncer es la 2° causa de muerte en Chile. El desarrollo del cáncer se ha propuesto que es consecuencia de la pérdida de función de los genes supresores de tumores beneficiando la acción de los oncogenes (genes que promueven el crecimiento de tumores). La activación del Factor inducible por hipoxia 1α (HIF1α) en un ambiente reducido en oxígeno (hipoxia) o por óxido nítrico (NO), permiten la proliferación y adaptación metabólica de las células tumorales. Por otro lado, Caveolina-1 es una proteína de andamiaje, que ha sido descrita como un supresor de tumores y promotor de metástasis. Resultados de nuestro laboratorio han demostrado que E-Cadherina y Caveolina-1 actúan cooperativamente en supresión de tumores in vivo. Sin embargo, Caveolina-1 suprime el crecimiento de tumores incluso en células carentes de E-Cadherina, de un modo menos eficiente. La isoforma endotelial de la sintasa de óxido nítrico (NOS3), es uno de los blancos inhibidos por Caveolina-1 más ampliamente descritos en la literatura, que recientemente ha sido implicado en mantenimiento tumoral. Cómo la inhibición de NOS mediada por Caveolina-1 afecta la activación de HIF1α contribuyendo a la función supresora de tumores de Caveolina-1 en ausencia de E-Cadherina, aún no ha sido evaluado. En este trabajo, evaluamos la posibilidad que la inhibición de NOS por Caveolina-1 pueda reducir la transcripción dependiente de HIF1α y contribuir así a la función supresora de tumores de Caveolina-1. Líneas celulares transfectadas con un plasmidio que codifica para Caveolina-1 [HT29(US), B16F10 y HEK293T] o células en que la expresión endógena de Caveolina-1 fue disminuida utilizando un shRNA [MDA-MB231], fueron tratadas en hipoxia (1% O2, 4-24 h). La actividad transcripcional de HIF, la expresión de genes blanco de HIF1α, la distribución subcelular de HIF1α, Caveolina-1 y NOS3, fueron evaluados mediante ensayos de gen reportero, RT-PCR/qPCR, Western Blot y microscopía confocal, respectivamente. Además, se realizaron ensayos de formación de tumores en ratones inmunosuprimidos SCID-Beige y en ratones inmunocompetentes C57BL/6. Los principales hallazgos de este trabajo fueron, que Caveolina-1 reduce la actividad transcripcional de HIF1α y la expresión de VEGF en hipoxia en las líneas celulares analizadas. Además, la reducción del crecimiento tumoral de células de melanoma murino B16F10(Cav-1) fue coincidente con la reducción de la expresión del mRNA de vegf in vivo. El tratamiento de las células con el dador de NO (DETA/NO) o el inhibidor de arginasa BEC, previnieron la inhibición de la actividad transcripcional de HIF1α mediada por Caveolina-1. Además, la inhibición de NOS con L-NAME o con el inhibidor selectivo de NOS3, L-NIO, reducen el incremento en la actividad transcripcional de HIF en hipoxia. In vivo, la sobreexpresión de HIF1α en células HT29(US)(Cav-1) revierte la supresión de tumores mediada por Caveolina-1 en ratones SCID-Beige. Finalmente, el tratamiento sistémico de ratones C57BL/6 con L-NAME, reduce el volumen tumoral a niveles comparables con los observados en los tumores formados por células B16F10(Cav-1). En resumen, nuestros resultados sugieren que la inhibición de NOS3 mediada por Caveolina-1 reduce la actividad transcripcional de HIF1α y la expresión de sus genes blanco, in vitro e in vivo, contribuyendo a la función supresora de tumores de Caveolina-1 en ausencia de E-Cadherina / Cancer, the 2nd most important cause of death in Chile, is thought to develop due to loss of tumor suppressor and gain of oncogene function. Activation of Hypoxia-inducible factor 1α (HIF1α) in the low oxygen environment (hypoxia) present in tumors or by nitric oxide (NO), favors cancer cell proliferation and metabolic adaptation. Caveolin-1 is a scaffolding protein that reportedly functions both as a tumor suppressor and promoter of metastasis. Results from this laboratory have shown that E-cadherin and Caveolin-1 cooperate in tumor suppression in vivo. However, Caveolin-1 expression suppresses tumor growth even in cancer cells lacking E-cadherin, albeit less efficiently. The endothelial isoform of nitric oxide synthase (NOS3), one of the best-established targets for inhibition by Caveolin-1, has recently been implicated in maintence of tumor growth. Whether, Caveolin-1-mediated NOS inhibition may impact on HIF1α activation and account for tumor suppression by Caveolin-1 in the absence of E-cadherin has not been yet assessed. Here, we evaluated the possibility that NOS inhibition by Caveolin-1 may reduce HIF1α - dependent transcription and thereby contribute to the tumor suppressor function of Caveolin-1. Cell lines transfected with a Caveolin-1-encoding plasmid [HT29(US), B16F10 and HEK293T] or cells where endogenous Caveolin-1 protein levels [MDA-MB231] were reduced using shRNA-technology, were exposed to hypoxia (1% O2, 4-24 h). In these cells, HIF transcriptional activity, HIF1α target-gene expression, HIF1α, Caveolin-1 and NOS3 protein levels and subcellular localization were evaluated by gene reporter assays, RT-PCR/qPCR, Western Blot and confocal microscopy, respectively. Tumor forming capacity was evaluated in immunodeficient SCID-Beige and immunocompetent C57BL/6 mouse strains. The main findings of this study are that Caveolin-1 reduced HIF1α transcriptional activity and VEGF expression in hypoxia in vitro in all cell lines. Also, reduced tumor growth of B16F10(Cav-1) melanoma cells in C57BL/6 mice correlated with reduced vegf gene expression in vivo. Treatment of cells with the NO donor (DETA/NO) o arginase inhibition with BEC, prevented Caveolin-1-mediated inhibition of HIF1α transcriptional activity. Furthermore, NOS inhibition with L-NAME or selective NOS3 inhibition with L-NIO, reduced hypoxia-enhanced HIF transcriptional activity. In vivo HIF1α overexpression in HT29(US)(Cav-1) cells reversed tumor suppression due to Caveolin-1 in SCID-Beige mice. Finally, systemic treatment of C57BL/6 mice with L-NAME, reduced tumor volumes to levels comparable to those observed for tumors formed by B16F10(Cav-1) cells. In summary, our observations suggest that Caveolin-1-mediated inhibition of NOS3 activity reduces HIF1α transcriptional activity and target gene expression, both in vitro and in vivo, and that this ability contributes to tumor suppression by Caveolin-1 in the absence of E-cadherin / CONICYT, FONDECYT, FONDAP, MECESUP

Presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctora en Farmacología / Helicobacter pylori (H. pylori) es una patógeno gástrico humano asociado al desarrollo de cáncer gástrico. En células epiteliales gástricas, la infección con H. pylori promueve la activación de diversas vías de señalización asociadas tanto a la progresión como al arresto del ciclo celular. Por otro lado, H. pylori ha demostrado inducir los niveles del Factor Inducible por Hipoxia-1α (HIF-1α), un factor transcripcional relacionado con la expresión de genes necesarios para la progresión tumoral. Fuera de sus funciones canónicas, se ha descrito que, en el contexto de la hipoxia, HIF-1α es capaz de promover arresto del ciclo celular en la fase G1 como parte de una acción no transcripcional. No obstante esto, HIF- 1α puede ser inducido por la activación de la vía PI3K/Akt/mTOR, vía de señalización relacionada con progresión del ciclo celular que ha sido asociada también a la acción de H. pylori. Aunque se ha descrito que la infección con H. pylori promueve la inducción de HIF-1α, actualmente no hay antecedentes precisos acerca de la vía de señalización precedente a este fenómeno, así como tampoco de su efecto sobre el destino de las células epiteliales gástricas. En este trabajo se buscó determinar si HIF-1α representa una transición desde señales que promueven un progreso del ciclo celular hacia un arresto del ciclo celular en la infección con H. pylori. En consecuencia, se propuso estudiar si H. pylori, al activar la vía PI3K/Akt/mTOR, podría llevar a un aumento de los niveles de HIF-1α y éste, a su vez, llevar a una respuesta de arresto del ciclo celular. Para estudiar esto, se utilizó un modelo in vitro basado en células humanas derivadas de cáncer gástrico MKN45 y AGS y la cepa de H. pylori 26695. Los resultados indican que H. pylori induce un aumento transitorio de HIF-1α con localización principalmente nuclear. Al inhibir farmacológicamente la vía PI3K/Akt/mTOR, se obtuvo que la inhibición de PI3K con LY294002 y de mTOR con Rapamicina fueron capaces de prevenir la inducción de HIF-1α por H. pylori. Al silenciar HIF-1α se obtuvo una reducción del arresto del ciclo celular en G0/G1 promovido por la bacteria. Consecuente con esto, los niveles de la proteína ciclina D1, importante para lograr la transición G1/S del ciclo celular, fueron diminuidos por la infección con H. pylori, sin embargo, esta diminución fue menos severa en las células que se silenció HIF-1α. En cuanto a su actividad transcripcional, se observó que al silenciar HIF-1α se previno el aumento del mRNA de GLUT-1 promovido por H. pylori sólo a tiempos tempranos de infección, pero éstos no fueron afectados a tiempos mayores. Por lo demás, el análisis bioinformático mostró que la infección con H. pylori no incrementó significativamente la expresión de genes blancos clásicos de HIF-1α en la mucosa antral. Finalmente, al analizar la acción de los componentes solubles o de la pared de H. pylori sobre la inducción de HIF-1α, se obtuvo que ninguno de ellos fue capaz de promover este efecto, sólo el contacto directo entre el patógeno vivo y el hospedero fue necesario para promover un aumento de los niveles de la proteína. En resumen, los resultados sugieren que H. pylori promueve un aumento de HIF-1α a través de la activación de PI3K y mTOR, y que esta inducción permite el arresto de células gástricas en la fase G0/G1 del ciclo celular. Además, HIF-1α tendría una participación menor en la expresión de su gen blanco GLUT-1. Finalmente, los datos sugieren que el factor de virulencia posiblemente implicado en este fenómeno requiere de la interacción directa entre H. pylori y la célula gástrica para ejercer su función / Helicobacter pylori (H. pylori) is a human gastric pathogen whose presence is linked to gastric carcinogenesis. In gastric epithelial cells, H. pylori infection promotes activation of several signaling pathways associated with both cell cycle progression and cell cycle arrest. On another hand, H. pylori has been linked to the induction of Hipoxia Inducible Factor -1α (HIF-1α), a transcription factor involved in the expression of several genes required for tumor progression. In addition to its canonical functions, in the context of hypoxia, HIF- 1α has been shown to promote cell cycle arrest in G1 phase as a nontranscriptional mode of action. HIF-1α induction in normoxia by activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway has been described, and signaling via this pathway related to cell cycle progression also has been linked to H. pylori infection. However, although H. pylori reportedly promotes HIF-1α induction, currently little data is available concerning the signaling pathway(s) by which H. pylori promotes HIF-1α induction, as well as the consequences of such induction for cell fate. In this study, we sought to determine whether HIF-1α mediates the transition from cell cycle progression to cell cycle arrest observed following H. pylori infection. Thus, we evaluated whether activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway increases HIF-1α levels and whether this leads to cell cycle arrest. To do so, these studies employed as in vitro models the human gastric cancer cell lines MKN45 and AGS as well as the H. pylori 26695 strain. The results indicate that H. pylori induces transient HIF-1α increases and enhances nuclear localization of the transcription factor. Pharmacological inhibiton of the PI3K/Akt/mTOR pathway revealed that the PI3K inhibitor LY294002 and the mTOR inhibitor Rapamycin precluded H. pylori-enhanced HIF-1α induction. HIF-1α silencing prevented H. pylori-induced cell cycle arrest in G0/G1 phase. Consequently, cyclin D1, an important protein for G1-S phase transition, decreased following H. pylori infection, and this decrease was less dramatic in HIF-1α knockdown gastric cells. With respect to HIF-1α transcriptional activity, we observed that HIF-1α silencing precluded increases in GLUT-1 mRNA promoted by H. pylori at early stages of infection only. Furthermore, bioinformatic analysis revealed that H. pylori infection was not associated with an increase in the expression of classical HIF-1α target genes in antral mucosa. Finally, analysis of the contribution of soluble components or components from the bacterial wall to HIF-1α induction, revealed that none of them individually were sufficient to promote the effect. Rather, the direct interaction between live bacteria and gastric cells was neccessary for H. pylori to increase HIF-1α protein levels. In summary, the results obtained in this thesis suggest that H. pylori increases of HIF-1α protein levels in normoxia through PI3K and mTOR activation, and that this induction promotes cell cycle arrest in the G0/G1 phase. Furthermore, HIF-1α appears to participate to some extent in modulating the expression of the target gene GLUT-1. Finally, the putative virulence factor involved in these events requires the direct interaction between bacteria and the host cell to exert its effect / Conicyt; Fondecyt; Fondap