La Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) es una patología caracterizada por una obstrucción progresiva irreversible de las vías aéreas cuya causa principal es el humo de tabaco. Una característica distintiva de esta enfermedad es la hipersecreción mucosa; además, el estrés oxidativo está implicado en este proceso. En dicho estés oxidativo juega un papel muy importante el complejo NADPH oxidasa. En esta tesis, se planteó el caracterizar los mecanismos por los que la activación del complejo NADPH oxidasa mediada por tabaco conducían a la hipersecreción mucosa, estudiando la implicación del AMPc en dicho proceso. Los resultados muestran que el tabaco activa el complejo NADPH oxidasa, el cual genera un estrés oxidativo que conduce a la activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), y que dicha activación conduce a una sobreexpresión de mucinas en un proceso dependiente del descenso de los niveles de AMPc. Tanto el bloqueo de la actividad NADPH oxidasa con un inhibidor no específico del sistema, el difenileneidonio (DPI), con el antioxidante N- acetilcisteína (NAC), así como con el inhibidor selectivo de la fosfodiesterasa (PDE)4 piclamilast vía un aumento de los niveles de AMPc, inhiben a diferentes niveles la inducción de la expresión génica de mucinas en respuesta a la activación del complejo NADPH oxidasa por extracto de humo de tabaco. / Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is a pathological state characterised by an irreversible and progressive airway obstruction where tobacco smoke is the main cause of disease progression. Mucus hypersecretion is a distinctive feature in COPD patients; moreover oxidative stress plays a key role in the pathology. NADPH oxidase system is involved in this oxidative stress. Currently, selective inhibition of phosphodiesterase (PDE) 4 appears to be promising in COPD management, due to PDE4 are expressed in distinct cellular types involved in inflammatory and immunomodulatory responses. Intracellular cyclic AMP (cAMP) levels are augmented as a consequence of PDE4 inhibition. In the present thesis we aimed to study the characterisation of mechanisms by which NADPH oxidase system activation is induced in response to cigarette smoke extract, studying further AMPc involvement in the process. Results shown that NADPH oxidase system was induced in response to cigarrete smoke extract, which generates an oxidative stress that leads to activation of epidermal growth factor receptor (EGFR) , and mucin overexpression was produced in a reduced AMPc levels dependent process in consequence. Blocking NADPH oxidase activity using a nonspecific inhibitor of the system, diphenileneidonium (DPI), N-acetylcisteine (NAC) as antioxidant, as well as piclamilast as a PDE4 selective inhibitor (via a cAMP level increase), inhibited mucin expression induction at different levels in response to NADPH oxidase system activation dependent by cigarette smoke extract.

Una de las principales áreas de interés de la química orgánica es la búsqueda de nuevos compuestos con actividad biológica. En este sentido cabe destacar el especial interés que despiertan los compuestos nitrogenados debido a que constituyen una de las familias más numerosas entre las biomoléculas y que están implicados en múltiples procesos a nivel metabólico y estructural. Un ejemplo representativo los constituyen los compuestos de tipo etanolamina, ampliamente estudiados por sus variadas y numerosas aplicaciones. Por una parte han servido como modelo para el diseño de peptidomiméticos derivados de hidroxietilamina, que resultan interesantes como inhibidores de proteasas. Algunos de ellos presentan actividad como antiretrovirales o antiparasitarios debido a la inhibición de la proteasa del ácido aspártico, esencial en procesos como la replicación del VIH-1 o la proliferación del parásito P. Falciparum (responsable de la malaria). Otros han encontrado aplicación como inhibidores de -secretasas, enzimas hidrolíticas implicadas en el desarrollo del Alzheimer. Por otra parte, la agrupación etanolamina puede encontrarse también en el etambutol, un aminoalcohol sintético que actúa como agente bacteriostático contra la mayoría de las cepas de Mycobacterium. El mecanismo de acción todavía no está completamente definido, aunque parece que interfiere en la biosíntesis de proteínas y ácidos nucleicos, actuando como antimetabolito. Su habilidad para formar complejos también contribuye a su actividad bacteriostática, aumentando la permeabilidad de la pared celular. De hecho el diseño de sustratos capaces de comportarse de este modo representaría un paso importante en la generación de nuevos antibacterianos. Asimismo, las imidazolinas se han convertido recientemente en candidatos interesantes como ligandos en catálisis y en química médica, y juegan un papel importante en el diseño de fármacos por su actividad como antivirales, antitumorales, antihipertensivos, antiinflamatorios, analgésicos, antidepresivos y neuroprotectores. Paralelamente, es importante mencionar el reciente impulso que la química de los compuestos organofluorados ha experimentado en la industria farmacéutica, la agroquímica, o la ciencia de los materiales. debido en gran parte a las peculiares propiedades que la introducción de átomos de flúor es capaz de conferir a las moléculas orgánicas, modificando sus propiedades físicas, químicas y biológicas. Por todo lo expuesto, el primer objetivo del trabajo consiste en la preparación estereoselectiva de una nueva familia de peptidomiméticos fluorados derivados de etanolamina con potencial actividad biológica. La estrategia propuesta implica la utilización de sulfiniminas fluoradas como intermedio sintético quiral para la obtención estereoselectiva de alilaminas fluoradas, precursoras del fragmento hidroxietilamina. A continuación se realizarán los correspondientes ensayos enzimáticos in vitro para determinar la capacidad inhibitoria de estos peptidomiméticos frente a -secretasas. Complementariamente se evaluará la actividad antibacteriana de los compuestos preparados, especialmente su actividad contra especies de los géneros Mycobacterium y Nocardia, con el fin de establecer una correlación estructura-actividad. El segundo objetivo propuesto en este trabajo consiste en la preparación de una familia de imidazolinas bicíclicas, partiendo de compuestos carbonílicos y diaminas. Como etapa clave del proceso se utilizará una reacción de metátesis con cierre de anillo (RCM) dado que, según nuestro conocimiento, este tipo de reacción no ha sido utilizada en la literatura para la obtención de amidinas bicíclicas y existen pocos ejemplos de preparación de estos esqueletos. / One of the main goals of Organic Chemistry is the search of new compounds with interesting biological activity. Nitrogenated compounds embrace most of the biomolecules and are very attractive due to their important role in many metabolic and structural processes. Introduction of fluorine atoms in organic compounds often lead to products with an improved pharmacokinetic and pharmacodynamic profile. Considering this statements, the main objective of this work is the synthesis of new fluorinated nitrogen-containing molecules with a potential biological application and the evaluation of their in vitro activity. In Chapter 1, a new methodology for the synthesis of α-fluorinated allylic amines through alquilation of imines with 2-trimethylsilylethyl sulfones, as vinyl anion equivalentes, followed by β-elimination, has been developed. This methodology has been applied to the asymmetric version, using chiral 2-trimethylsilylethyl substituted sulfoxides. In this case, a tandem addition-β-elimination process provided the corresponding allylic amines, altought with low enantioselectivity. The tandem addition-β-elimination process has been extended to the synthesis of racemic fluorinated quaternary aminoacid derivatives with an allylic amine moiety. The first achievement of Chapter 2 has been the utilization of chiral sulfinimines as starting materials for the preparation of chiral fluorinated allylic amines holding a 1,1-difluoro-1-phenyl substituent, with good yields and diastereoselectivity. Functional modification of the aforementioned chiral allylic amines has led to a series of difluorophenylmethylated analogues of β-secretase inhibitors with a central 1,3-diamino-4,4-difluoro-4-phenyl-2-butanol core, that have been submitted to biological evaluation. A family of fluorinated and non-fluorinated ethanolamines have been evaluated as antimicrobial agents, showing a noteworthy selective inhibitory activity of the growth of Mycobacterium and Nocardia species. In the third Chapter, the preparation of fluorinated and non-fluorinated 2-imidazolines bearing an olefinic chain has been achieved by reaction of ethyl esters derived from 2,2-difluoro-4-phenyl-3-butenoic acid, 2,2-difluoro-4-pentenoic acid and 4-pentenoic acid with comercially available diamines in the presence of trimethylaluminium as catalyst. Subsequent N-allylation in Barbier conditions led to dienic systems suitable for cyclisation. Dienic imidazolines afforded, after ring-closing metathesis reaction, the corresponding bi(tri)cyclic amidines. The fluorinated and non-fluorinated products with 3,5,8,9-tetrahydro-2H-imidazo[1,2-a]azepine backbone were isolated with high yield while the synthesis of the imidazo[1,2-a]pyridine-pattern was not as favourable.

In the last decade have appeared in the Spanish market new products based on mixtures of fruit juices and milk as well as beverages mixtures of fruit and/or vegetables, which have a good acceptance by consumers and with a high nutritional value largely due to its high content in bioactive compounds as well as antioxidant capacity. Traditionally, liquid food such as fruit and/or vegetables juices, as well as milk, have been preserved by thermal treatment such as pasteurization and sterilization. However these processes can cause loss of compounds responsible for the organoleptic and nutritional quality of food. Currently there is a growing demand by the consumer for minimally processed food and which in turn are safe from the microbiological point of view, a fact that is driving the development of new conservation methods. Nonthermal processes such as high hydrostatic pressure, pulsed electric fields and ultrasound, which can be used with this goal without affecting the quality of food. Although the effectiveness of these treatments is known for safe food, is now when is possible to produce the greater technological advances for it to marketing. In the present doctoral thesis, the main objective is to establish the conditions of nonthermal processing to obtain beverages with a high content in bioactive compounds as well as antioxidant capacity. In addition it is important to compare the effects of these treatments on the organoleptic and nutritional characteristics, with those occurring after the implementation of a traditional heat treatment. Subsequently, also it was studied the degree of permeability of the cell membranes of blueberries using the extent of the impedance, to optimize the parameters of processing and use thermal and nonthermal processing in the extraction of bioactive compounds with antioxidant capacity. / En la última década han aparecido en el mercado español nuevos productos basados en mezclas de zumos de frutas y leche así como bebidas mezclas de vegetales, que presentan una buena aceptación por parte del consumidor y con un gran valor nutricional, debido en gran parte a su alto contenido en compuestos bioactivos así como capacidad antioxidante. Tradicionalmente los alimentos líquidos como zumos de fruta y/o vegetales, así como la leche, han sido conservados mediante técnicas por calor como la esterilización. Sin embargo estos procesos pueden provocar una pérdida de compuestos responsables de la calidad organoléptica y nutricional de los alimentos. Actualmente existe una demanda creciente por parte del consumidor de alimentos mínimamente procesados y que a la vez sean seguros desde el punto de vista microbiológico, hecho que está impulsando el desarrollo de nuevos métodos de conservación. Procesos no térmicos como las altas presiones hidrostáticas, pulsos eléctricos de alta intensidad y ultrasonidos, pueden utilizarse con este objetivo sin que se vea afectada la calidad de los alimentos. Aunque la eficacia de estos tratamientos se conoce para obtener alimentos seguros, es ahora cuando se están produciendo los mayores avances tecnológicos para hacer posible su comercialización. En la presente tesis doctoral, el objetivo principal es establecer las condiciones de procesado no térmico para obtener bebidas con un alto contenido en compuestos bioactivos así como capacidad antioxidante. Además se comparan los efectos de estos tratamientos sobre las características nutricionales y organolépticas con los que se producen tras la aplicación de un tratamiento térmico tradicional. Posteriormente, se estudia el grado de permeabilidad de las membranas celulares de arándanos utilizando la medida de la impedancia, para optimizar los parámetros del procesamiento y poder utilizar los tratamientos térmicos y no térmicos en la extracción de compuestos bioactivos con capacidad antioxidante.

La leche materna es el alimento idóneo para satisfacer las necesidades del lactante, durante las primeras etapas de la vida. No obstante, en algunas situaciones se recurre a la alimentación con preparados infantiles, cuya composición en macronutrientes y oligoelementos esenciales (vitaminas y minerales) tiende a ser semejante a la de la leche humana. El ácido siálico y los gangliósidos son componentes bioactivos, presentes en leche que desempeñan un papel fundamental en distintos procesos de reconocimiento celular. Actualmente, con el fin de mejorar la composición de los preparados infantiles, se realizan investigaciones sobre componentes bioactivos esenciales, como ácido siálico y gangliósidos, cuyas cantidades y perfiles difieren entre la leche humana y los preparados infantiles. El objetivo general de esta tesis es conocer la composición en ácido siálico y gangliósidos de preparados infantiles comercializados y compararla con los presentes en leche humana, así como conocer la influencia de la utilización de concentrados proteicos de suero lácteo ricos en estos componentes en preparados infantiles. Para alcanzar este objetivo se ponen a punto y validan dos métodos de determinación de ácido siálico, uno que permite la cuantificación diferenciada de sus formas más abundantes (N-acetil y N-glicolil) por HPLC-fluorescencia y otro que permite la determinación de ácido siálico total por espectrofotmetría de absorción molecular. Atendiendo a los resultados obtenidos, los métodos validados se consideran idóneos para ser aplicados a preparados infantiles y leche humana. Los métodos validados se aplican a la determinación del ácido siálico y gangliósidos en preparados comerciales (para lactantes y de continuación), sueros lácteos a base de -lactoalbúmina y membranas de glóbulos grasos de la leche ricos en ácido siálico y gangliósidos (utilizados en la elaboración de preparados experimentales que contienen estos ingredientes) y leche humana. Los resultados indican que el suero a base de membranas de glóbulos grasos de la leche presenta un mayor contenido de ácido siálico y gangliósidos que el de -lactoalbúmina, con lo que los preparados elaborados con este ingrediente son los que presentan un mayor contenido de ambos componentes bioactivos, si bien sus contenidos son inferiores a los encontrados en la leche humana, y sus perfiles individuales difieren, excepto el perfil de gangliósidos del preparado de continuación experimental. A partir de los contenidos obtenidos de ácido siálico y gangliósidos, en los preparados para lactantes, se calculan sus ingestas diarias; estas no alcanzan las ingestas aportadas por la leche humana durante las primeras semanas de vida (20-30 mg/kg/día vs. 210 mg/kg/día). Se evalúa la bioaccesibilidad de ácido siálico y gangliósidos en la fracción soluble de preparados infantiles y leche humana obtenida tras una digestión gastrointestinal simulada en dos etapas (gástrica e intestinal). La etapa gástrica es la principal responsable de la reducción de la bioaccesibilidad de ambos compuestos, comprobándose que no es debido a una insolubilización de los mismos. En leche humana se obtiene la mayor bioaccesibilidad para el ácido siálico, seguida del preparado para lactantes y de continuación; mientras que en el caso de los gangliósidos el orden, de mayor a menor bioaccesibilidad, corresponde a preparado de continuación, leche humana y preparados para lactantes. Con el fin de iniciar estudios de biodisponibilidad se caracteriza el contenido y perfil de ácido siálico y gangliósidos en la línea celular Caco-2, células diferenciadas y no diferenciadas, evaluándose la citotoxicidad de los principales gangliósidos (GM3 y GD3) a las concentraciones halladas en las fracciones solubles de las muestras analizadas, mediante ensayos de viabilidad celular (azul tripán) e integridad mitocondrial (MTT), no observándose ningún efecto tóxico. / Breast milk is the most suitable food in order to satisfy the needs of the unweaned baby at the earliest stage of its life. However, in some situations infant formulas are used instead. Nowadays, with the aim of improving the composition of infant formulas, research is performed on essential bioactive components, such as sialic acid and gangliosides, whose amounts and profiles differ from human milk and infant formulas, and plays a a fundamental role in different processes of cellular recognition. The main objective of this thesis is to identify the composition of sialic acid and gangliosides in manufactured infant formulas and to compare it with the ones found in human milk, and to discern the influence of the use of whey protein concentrates, rich in components found in infant formulas. Validated methods are applied to the determination of sialic acid and gangliosides in manufacturated preparations (starter and follow-on formulas), whey made of -lactalbumin and milk fat globule membranes rich in sialic acid and gangliosides (utilized in the production of experimental preparations containing these ingredients), and human milk. The results point out that the whey made of milk fat globule membranes presents a higher sialic acid and gangliosides content than the one consisting of -lactalbumin. Therefore, the preparations made with this ingredient are the ones that present a higher content of both bioactive components. However, their contents are lower than the ones found in human milk and their individual profiles differ. Evaluation of the bioaccessibility of sialic acid and gangliosides in the soluble fraction of child food and human milk is performed, both obtained after a two stage simulated gastrointestinal digestion (gastric and intestinal). The gastric stage is the main stage responsible for the reduction of the bioaccessibility of both compounds, showing that it is not due to an insolubilisation of them. In sialic acid the highest bioaccessibility is obtained for human milk, followed by starter formulas and follow-on ones. On the other hand, in the case of gangliosides, the order, from the higher to the lower bioaccessibility, corresponds to the follow-on formulas, human milk and finally, starter formulas

El objetivo perseguido en la presente Tesis Doctoral ha sido ahondar en el mecanismo a través de cual, el etanol, tras su administración aguda, es capaz de activar el sistema dopaminérgico mesolímbico. Se ha pretendido pues ayudar a la caracterización de sus efectos excitatorios agudos sobre las neuronas dopaminérgicas de la proyección mesolímbica (elementos celulares, que desempeñan, sin duda, un papel clave en el inicio y desarrollo del transtorno adictivo). La hipótesis básica que se ha pretendido comprobar con los diferentes experimentos realizados en el presente trabajo es que el etanol debe sus efectos excitatorios agudos no a él mismo sino a sus metabolitos (acetaldehído y/o sus derivados tetrahidroisoquinolínicos, THIQs) localmente formados en la propia área tegmental ventral (VTA). Hemos decidido comenzar nuestros experimentos determinando si existe, en el propio sistema mesocorticolímbico, la maquinaria metabólica necesaria para biotransformar el etanol, y por tanto, para que se generen in situ estos metabolitos. Hemos centrado nuestra atención (por las razones que se detallarán en los capítulos respectivos) en el citocromo P4502E1 (CYP2E1), sistema enzimático capaz de metabolizar el etanol en el cerebro (de hecho, es el segundo sistema enzimático en importancia, después de la catalasa, que participa a nivel cerebral en el metabolismo del etanol) y para el que no se había descrito, en el momento de diseñar las experiencias, su distribución detallada entre diferentes áreas del sistema mesocorticolímbico, ni su evidente susceptibilidad a la autoinducción en áreas clave este sistema. 2 Tras verificar la presencia de CYP2E1 en los diferentes territorios implicados en la proyección dopaminérgica mesocorticolímbica y, en especial, en VTA (lo que indudablemente abre la posibilidad para la producción local de acetaldehido y/o THIQs), se planificaron y desarrollaron una serie de experimentos en los que analizó una de las consecuencias comportamentales más conspícuas y características de la activación de las neuronas dopaminérgicas mesolímbicas: la activación motora. A través del análisis del comportamiento motor de los animales se ha analizado: (i) si el etanol y/o su metabolito fundamental, el acetaldehído, son capaces de activar esta proyección y (ii) el papel que los receptores opioides desempeñan en esta activación. Además utilizando estrategias que limitan la producción del acetaldehído o secuestran al metabolito tras su formación se ha intentado deslindar “quién es quién” en los efectos excitatorios agudos del etanol sobre el sistema mesolímbico. Los experimentos se han completado con el inicio del estudio de las consecuencias de la administración repetida de etanol sobre el comportamiento motor de los animales. Es decir, se ha abordado el estudio del desarrollo de sensibilización o de tolerancia a los efectos activadores del etanol. Estos experimentos han arrojado, como veremos, algunas pistas sobre los efectos agudos del etanol sobre las neuronas dopaminérgicas del VTA, pero también han abierto nuevos interrogantes sobre el mecanismo de acción agudo del etanol en esta región del cerebro. / This Doctoral Thesis has been focused on understanding the mechanism through ethanol, after its acute administration, is able to activate the dopaminergic mesolimbic system. To this aim we have focused on the characterization of its excitatory effects on dopaminergic neurons of the mesolimbic projection (cellular elements which play a key role in the initiation and development of addictive disorder). Our hypothesis proposes, by means of different experiments in this paper, that excitatory ethanol effects may be due to its metabolites (acetaldehyde and/ or its derivates tetrahydroisoquinolines, THIQs) formed locally in ventral tegmental area (VTA). To this study, we plan our initial experiments to determine whether the enzymatic machinery, necessary to metabolize ethanol, was present in the mesocorticolimbic system, in order to generate these metabolites in situ. We have focused attention on cytochrome P4502E1 (CYP2E1) (for the reasons detailed in the respective chapters), which is an enzymatic system capable of metabolizing ethanol in brain (in fact, this is the second largest system, after catalase, to metabolize ethanol in brain), and therefore, it has been described neither its detailed distribution between different areas of mesocorticolimbic system, nor its apparent susceptibility to induction in certain key areas of this system. Thus, our experiments demonstrated the presence of CYP2E1 in the different areas involved in the dopaminergic mesocorticolimbic projection, and specially, in VTA (this aspect open the possibility to the local production of acetaldehyde and/ or THIQs). So, a series of experiments were planned and developed to analyze one of the most conspicuous behavioural consequences of dopaminergic mesolimbic neurons: motor activation. Through the motor 2 behavior analysis of the animals, we looked into: (i) ethanol and/ or its main metabolite, acetaldehyde, are able to activate this projection and (ii) the role of opioid receptors in this activation. Moreover, strategies limiting the production of acetaldehyde have been used in order to demarcate “who’s who” in the excitatory acute effects of ethanol on mesolimbic system. The experiments have been completed with the study of the ethanol behavioural consequences after its repeated administration on locomotor activity. It has been studied the development of sensitization or tolerance to the excitatory effects of ethanol. These results have shed some tracks about ethanol acute effects on VTA dopaminergic neurons, but also, they have set up new questions about the acute action mechanism of ethanol in this brain region.

Los plaguicidas actualmente utilizados en agricultura (CUPs) pueden encontrarse en la atmósfera como consecuencia de su uso intensivo en zonas agrícolas sobre todo durante el periodo de aplicación. Más de 300 sustancias activas están actualmente aprobadas por la UE y pueden ser aplicadas en distintos cultivos según la Directiva 91/414/CEE. La cantidad total de plaguicidas utilizados en la (EU-27) durante el 2008 fue de unas 310.011 toneladas de sustancia activa, con Francia (25.3%), España (12.9%) e Italia (13.3%) como los tres países con mayor consumo. La emisión de los plaguicidas durante la aplicación, la volatilización desde el suelo y las plantas después de su aplicación y la erosión del suelo con partículas cargadas con plaguicidas son los procesos fundamentales por los que los plaguicidas pueden llegar a la atmósfera. Una vez en el aire ambiente los plaguicidas pueden someterse a mecanismos de transporte, degradación y deposición. El objetivo fundamental de esta tesis es desarrollar métodos analíticos para analizar estos CUPs en la fase particulada del aire y proporcionar información sobre concentraciones de estos plaguicidas en dos regiones europeas (Région Centre y Comunidad Valenciana), en Francia y España. Esta tesis se compone de un estudio de revisión y cuatro capítulos experimentales. El estudio de revisión se fundamenta en una revisión bibliográfica sobre métodos de muestreo y análisis, y sobre concentraciones detectadas en la literatura de plaguicidas en el aire ambiente. En el primer capítulo se desarrolló un método analítico para determinar nueve CUPs en PM 2.5. Los CUPs fueron extraídos utilizando PLE y se analizaron por LC-MS/MS. Las condiciones del PLE y de la fuente de ionización ESI se optimizaron utilizando el diseño estadístico de experimentos. En el segundo capítulo, se desarrolló un método analítico para analizar treinta CUPs en PM 2.5. Los CUPs fueron extraídos por MAE y se analizaron mediante LC-MS/MS. Las condiciones del MAE también se optimizaron utilizando un diseño estadístico de experimentos. En el tercer capítulo, una metodología analítica para determinar cuarenta CUPs en PM 10 se desarrolló por CG-MS/MS. Se introdujo en este capítulo una purificación por GPC. Las metodologías analíticas desarrolladas en los capítulos 1, 2 y 3 se aplicaron para el análisis de muestras en la fase particulada del aire en la atmósfera de la Comunidad Valenciana durante los años 2007-2010 para evaluar la presencia de los plaguicidas en el aire ambiente. La Comunidad Valenciana es una región con muchos cultivos de cítricos y con una importante actividad agrícola. El muestreo se realizó en distintas estaciones rurales, urbanas y remotas. El capítulo 4 trata de un estudio sobre presencia de los CUPs en la Región Centre de Francia durante los años 2006-2008. La Región Centre es una de las regiones más grandes de Francia con una intensa producción agrícola, especialmente de cultivos intensivos como el trigo o el maíz. En este capítulo estudios sobre la distribución espacial y temporal de los plaguicidas, así como la influencia de las condiciones meteorológicas como la humedad y la dirección del viento fueron evaluadas y estudiadas para comprender el comportamiento de los plaguicidas en el aire. Como consecuencia de los pocos trabajos publicados en la literatura sobre plaguicidas en el aire ambiente, además de desarrollar nuevas metodologías analíticas y estudiar la presencia de los plaguicidas en la atmósfera para aportar un mejor conocimiento de estos contaminantes en el ámbito científico, los trabajos realizados y los resultados obtenidos pueden ser una aportación útil, junto con posteriores estudios, para futuras reglamentaciones de la UE sobre plaguicidas en aire, pues actualmente existe un vacío legal en este aspecto. / Currently used pesticides (CUPs) appear in the atmosphere as a consequence of its massive use in agricultural areas during application periods. More than 300 active substances are nowadays authorised by the European Union for their application on different crops according to the Directive 91/414 of CEE. The total use of plant protection products in the European Union (EU-27) during 2008 was about 310 011 tons of active ingredients, with France (25.3%), Spain (12.9%) and Italy (13.3%) as the three main consumer countries. The emissions of pesticides during application, volatilization from soil and plants after application and wind erosion of soil particles containing sorbed pesticides are the key processes driving to their presence in ambient air. Once in the air pesticides can suffer different mechanisms such as transportation, degradation and deposition. The research aim of this thesis was to develop different analytical methods for the determination of currently used pesticides in airborne particulate matter and to provide information about the levels of these pesticides in two European regions (France and Spain). This thesis is composed of one review study and four experimental chapters. The scope of the review study is focused on current collection and analytical methods for determination of CUPs in ambient air. Additional considerations about the occurrence of pesticides in ambient air are included. In the first chapter an analytical method was developed in order to determine nine CUPs in PM 2.5. Pesticides were extracted by PLE and analyzed by LC-MS/MS. PLE conditions as well as parameters in the ESI source ionization were optimized using a statistical design of experiments. In the second chapter an analytical method for analysing 30 CUPs in PM 2.5 was developed. Pesticides were extracted by MAE and analyzed by LC-MS/MS. MAE conditions were also optimized using a statistical design of experiments. In the third chapter an analytical methodology in order to analyze 40 CUPs in PM 10 by CG-MS/MS triple Q was developed. A GPC clean-up was introduced in this study. The analytical methods developed in chapters 1, 2 and 3 were applied to analyze real samples in Valencia region (Spain) during 2007-2010 in order to evaluate the presence of pesticides in ambient air. Valencia region has an intensive agricultural production mainly of citrus fruits. Samples were collected in different sampling sites focused on rural, urban and remote stations. Chapter 4 describes a study about the presence of CUPs in Centre region (France). Centre region is one of the country´s largest regions with many agricultural activities focused mainly in arable crops. Some spatial and temporal studies were carried out. The influence of the meteorological conditions, such as humidity and wind direction were also evaluated. Rural and urban stations were sampled from 2006 to 2008 in Centre region. The analytical methods developed and the concentration levels of CUPs provided by this thesis could be very useful in order to establish a monitoring and surveillance network of pesticides in ambient air around different countries of the European Union.

Los problemas derivados del uso del anhídrido sulfuroso en vinificación, junto a la tendencia actual a reducir el empleo de aditivos en la industria alimentaria, justifican la búsqueda de nuevos compuestos activos y estrategias de control que lo sustituyan o minimicen su empleo, de una manera eficaz y segura para los consumidores. Dos alternativas prometedoras para el control de las contaminaciones microbianas de los vinos son el empleo de péptidos antimicrobianos y la utilización de preparados enzimáticos capaces de degradar la pared celular fúngica. Durante el desarrollo de este trabajo hemos evaluado la actividad antimicrobiana de distintos péptidos y/o un preparado enzimático comercial rico en actividad β-glucanasa frente a las principales especies de levaduras y bacterias lácticas alterantes de vino. La caracterización de su actividad antimicrobiana in vitro reveló perfiles de actividad diferentes, dependiendo de la especie evaluada, e incluso a nivel de cepa, en el caso de la especie Dekkera bruxellensis. Además, a pesar de poseer diferente modo de acción el perfil de actividad de varios de los péptidos fue muy similar al correspondiente al preparado de β-glucanasas frente a varias levaduras alterantes, hecho que sugiere que la estructura y composición de la pared celular modula la acción de estos agentes antimicrobianos. Su aplicación en vino o mosto de uva reveló un significativo descenso en su eficacia antimicrobiana en estas matrices alimentarias. En las condiciones ensayadas el único péptido activo en vino fue el derivado de lactoferrina bovina LfcinB17-31, frente a las especies D. bruxellensis y Zygosaccharomyces bisporus, hecho que sugiere su potencial aplicación en bodega para el control de las contaminaciones producidas por estas especies de levadura, tanto en vino embotellado como durante la fermentación alcohólica, dada su especificidad de acción antimicrobiana. Así mismo, su demostrada actividad antibacteriana durante el proceso fermentativo lo convierte también en una alternativa para el control de bacterias lácticas alterantes durante la vinificación. Teniendo en cuenta que el único péptido activo en vino, LfcinB17-31, es un derivado de la lactoferrina bovina, el empleo de hidrolizados de esta proteína se plantea como alternativa más económica y natural a la utilización de péptidos sintéticos. Por su parte, el preparado de β-glucanasas fue activo en vino frente a D. bruxellensis y también en el caso de Z. bailii y S. cerevisiae, especies sobre las que la alternativa de los péptidos sintéticos no había resultado eficaz para su control. Su demostrada eficacia, junto al hecho de que este tipo de preparados enzimáticos ya se utiliza en vinos con otros fines, los convierte en buenos candidatos para el control de levaduras alterantes en vinificación, en este caso con un exhaustivo control de la dosis para no alterar el correcto desarrollo de la fermentación alcohólica. / Sulphur dioxide (SO2) is a chemical preservative used to control the growth of unwanted microorganisms and prevent undesired oxidation during winemaking. However, due to increasing health concerns, consumer preference, and a tighter legislation regarding preservatives, there is a worldwide trend to reduce wine SO2 levels. In this context there is an increasing indication of the potential application of antimicrobial peptides and cell wall degrading-enzymes as food preservatives. In this study, the antimicrobial effects of lactoferricin B-related peptides and of a lactoferrin hydrolysate (LFH) against wine spoilage yeasts and lactic acid bacteria (LAB) have been evaluated. A commercial β-glucanase preparation, which is currently used in winemaking to improve the clarification and processing of must and wine, has been also assayed for antimicrobial activity. In vitro experiments in broth showed that different peptides had distinct activity profiles depending on the microorganism, and in the case of Dekkera bruxellensis the efficacy was found to be straindependent. Despite their different mode of action, the activity profile of the peptides against yeasts was very similar to that of the β-glucanase preparation, suggesting that the structure and cell wall composition modulates the action of both antimicrobials. The efficacy of peptides is reduced when used in must or wine. In wine, only the bovine lactoferrinderived peptide LfcinB17-31 showed activity against D. bruxellensis and Zygosaccharomyces bisporus, suggesting its potential application for spoilage control. Moreover, we have demonstrated that the antibacterial activity of LfcinB17-31 and its antimicrobial specificity could contribute to the selective control of certain spoilage LAB during the fermentation process, without affecting the activity of Saccharomyces cerevisiae. Results obtained also suggest the potential use of LFH for spoilage control as a more natural and cheaper alternative than the use of synthetic peptides. Finally, this study has revealed the potential of the β-glucanase preparation to inhibit the growth of wine spoilage yeasts, since it was active against D. bruxellensis, Zygosaccharomyces bailii and S. cerevisiae in wine. Remarkably the synthetic peptides tested were not effective against the latter two species. Thus, we have found an additional application for β-glucanase preparations already used in winemaking

En las últimas décadas la restauración colectiva universitaria ha adquirido gran importancia. Es importante garantizar la calidad y variedad de los menús desde un aspecto nutricional como microbiológico o toxicológico. El control del nivel de compuestos polares en aceites y grasas usados es una medida de prevención frente a tóxicos de origen químico. El estudio de la prevalencia de Anisakis simplex en muestras de pescado es una medida para garantizar la seguridad alimentaria. Los servicios de restauración deben cumplir determinadas normas de higiene para la elaboración, distribución y comercio de comidas preparadas con la finalidad de mantener una calidad microbiológica adecuada. El riesgo producido por la presencia de microorganismos en los alimentos no viene representado únicamente por las bacterias presentes sino, también por las toxinas bacterianas. Entre ellas merecen especial atención las de E. coli y S. aureus. E. coli es una bacteria frecuentemente asociada con toxiinfecciones e intoxicaciones alimentarias. En condiciones normales, constituye una parte esencial de la flora bacteriana humana, sin embargo, existen cepas capaces de provocar alteraciones graves en forma de enteritis. Este grupo de cepas se denomina E. coli enterotoxigénico (ETEC) y se transmiten a través de los alimentos o el agua contaminada por heces animales o humanas. La toxina termo-lábil (HLT) es su principal factor de virulencia. S. aureus es la bacteria enterotoxigénica más corriente de los alimentos. Las cepas toxigénicas de S. aureus pueden producir más de una enterotoxina aunque la enterotoxina del tipo A es la que con más frecuencia aparece en los brotes de intoxicación alimentaria, seguida de los tipos B y D. Merece especial atención la toxina 1 del síndrome del shock tóxico (TSST-1). El desarrollo de técnicas rápidas y selectivas para la identificación y cuantificación de toxinas bacterianas contribuirá a garantizar la seguridad alimentaria. / The catering service at university has become very important in all developed countries in recent decades. Consumers are increasingly demanding healthy and safe food, with better nutritional properties. Meals served must ensure the nutritional quality and limit the exposure to different contaminants that can be found in food. It is therefore important to ensure the quality and variety of menus offered daily, from a nutritional viewpoint as microbiological or toxicological. University students have a special interest because many of them assume, for the first time, responsibility for their meal. Dietary habits established by university students when they are away from home, can have a significant effect on their health, determining or modifying the risk of nutrition-related diseases. In addition to the nutritional hazards it is desirable to identify, assess and prevent hazards from physical, chemical or biological origin that can affect food safety, in order to implement appropriate measures to reduce or eliminate hazards to acceptable health standards. University restaurants are catering services, where transformation of food is done to serve customers. The food served must have adequate sanitary and organoleptic quality, it is also important to safeguard the safety, as these foods may be responsible for food poisoning. Monitoring of polar compounds (legislated in Spain) in oils and fats used is a preventive measure against toxic chemical hazards. These are compounds formed in used oils as a result of changes in fats and oils during frying processes. The presence of external substances with biological origin in foods can also be cause of foodborne disease (FBD). Products consumed in university establishments can be vectors of several biological contaminants, mainly parasites and bacteria. It is therefore important to have systematic monitoring of the microbiological quality of the food served. A large number of marine and freshwater fish can serve as a source of medically important parasitic zoonoses. The most important of the fish-borne helminthes are anisakid nematodes (particularly Anisakis simplex). On the other hand, restaurants must meet certain hygiene standards for production, distribution and trade of ready meals in order to assess the quality and microbiological safety of food. The toxicological hazard caused by the presence of microorganisms in food is not represented only by bacteria present in food; but also bacterial toxins in foods eaten are important. Among them deserve particular attention for E. coli and S. aureus toxins. E. coli is a bacteria often associated with outbreaks and food poisoning. Under normal conditions, constitutes an essential part of human bacterial flora, however, there are strains capable of causing serious diseases as enteritis. This group of strains is called enterotoxigenic E. coli (ETEC) and is transmitted through food or contaminated water by animal or human feces. ETEC labile toxin (LT) is the major virulence factor of ETEC. S. aureus is the most common toxigenic bacteria in food. It is responsible for most annual cases of food poisoning caused by ingestion of foods where enterotoxins have been preformed. Toxigenic strains of S. aureus can produce more than one enterotoxin although enterotoxin type A is the most frequently found in outbreaks, followed by types B and D. S. aureus produce also toxic shock syndrome toxin 1 (TSST-1), previously classified as enterotoxin F, which has not been extensively studied in restaurants. The development of rapid and effective techniques for enterotoxin isolation and identification represent a great advantage for the evaluation of its toxicity and to quantify the amount of toxin produced by strains isolated from food. This will contribute to food security and thereby safeguard consumers´ health in university restaurants.

El gen PGA26 del hongo dimórfico Candida albicans, también conocido como orf19.2475, CA2885 e IPF 7204, codifica una proteína GPI de pared celular putativa, cuya función hasta la fecha no ha sido establecida. Estudios previos, realizados por nuestro grupo de investigación, sobre la regeneración de la pared elular por protoplastos de C. albicans pusieron de manifiesto que el gen PGA26 está sobre-expresado a los 60 min de la regeneración de la pared celular en protoplastos. Este hallazgo podría indicar un papel importante de Pga26 en la arquitectura y/o biosíntesis de la pared celular, por ello se realizaron estudios más detallados sobre la posible funcionalidad de esta proteína. El gen PGA26 presenta dos alelos idénticos en el genoma de C. albicans y no es esencial pues la interrupción del mismo no causa letalidad; además su ausencia no afecta de manera significativa a la velocidad de crecimiento. Mediante un análisis in sílico, Pga26 posee todas las características propias de una proteína de pared celular: presencia de péptido señal en la región N-terminal, un sitio teórico de anclaje glicofosfatidilinositol (GPI) en la región C-terminal, un elevado porcentaje de serina y treonina, y presencia sitios teóricos de N-glicosilación (N-X- S/T). La carencia de proteína Pga26 funcional se manifestó en una serie de efectos, tales como una mayor sensibilidad a agentes que interfieren en la biogénesis de la pared celular, como el calcoflúor white, rojo Congo, SDS y también a la digestión con zimoliasa (complejo enzimático con actividad β-1,3-glucanasa). Estos resultados sugieren un papel importante de Pga26 en la arquitectura y/o composición de la pared celular. La respuesta de la célula a la ausencia de Pga26 se manifestó en la presencia de tres veces más de β-1,6-glucano en la pared celular del mutante homocigótico, habiendo por tanto una alteración en la relación entre los distintos polímeros que constituyen la pared celular (glucano, quitina, manoproteínas) y por ende una alteración en la composición de la pared celular. El mutante homocigótico presenta diferencias muy notables en la sensibilidad y resistencia a algunas drogas, siendo más resistente a tunicamicina y caspofungina y más sensible a ketoconazol, anfotericina B, fluconazol y posaconazol que la cepa parental. Tanto el mutante heterocigótico como el homocigótico en el gen PGA26 muestran una mayor resistencia al estrés ambiental (térmico 55 ºC y osmótico al CaCl2), siendo ligeramente más sensibles al estrés oxidativo (H2O2) en comparación con la cepa parental. Llama la atención el hecho de que la ausencia de Pga26 se manifieste, también, en una mayor velocidad en la emisión de tubos germinativos así como su capacidad para emitirlos incluso en condiciones en las que la cepa parental es incapaz de miceliar, por lo que Pga26 podría actuar como represor del proceso. El porcentaje de formación de biopelículas está aumentado en los mutantes heterocigótico (PGA26/pga26) y homocigótico (pga26/pga26), en comparación con la cepa parental. Es importante señalar la influencia de Pga26 en la virulencia de C. albicans en modelos murinos; el mutante nulo pga26/pga26 presenta una menor virulencia que la cepa parental, quedando el mutante heterocigótico en una situación intermedia, lo que indicaría un efecto dosis dependiente. Según el análisis del perfil transcripcional, la ausencia de Pga26 no altera significativamente la expresión de otros genes, bajo las condiciones estudiadas. / Pga26 is a putative GPI-anchored protein, also known as orf19.2475, CA2885 and IPF 7204, of unknown function. Previous studies performed by our group found that PGA26 is induced in protoplast during cell wall regeneration, for this reason we decided select it for a deeper study. The deduced amino acid sequence showed that Pga26 contains an N-terminal hydrophobic signal; it is rich in serine (10.7%) and threonine (17.6%) amino acids, has a putative N-glycosylation signal and a potential GPI (glycosylphosphatidylinositol) attachment signal. To investigate the possible role of PGA26, construction of null mutant by targeted gene disruption and analysis of the resulting phenotype was carried out. Homozygous mutant pga26/pga26 had an increased sensitivity to calcofluor white, Congo red, SDS and zymolyase, when compared with the parental strain, indicating changes in the cell wall. The analysis of the cell wall polymers composition showed that the null mutant has a bigger amount of β- 1,6 glucan than the parental strain. These results suggest that the lack of PGA26 leads to a defective cell wall. It is interesting to point out that the kinetic of the germ tube formation and the biofilm formation was increased in pga26/pga26 strain. We analyzed the behaviour of the mutants to different stress conditions. The pga26 null mutant strain was more resistant to osmotic stress (CaCl2) and heat shock (55ºC) than the parental one. The effect of different drugs, such as Tunicamycin, Amphotericin B and Ketoconazole, were also analyzed. The homozygous mutant was more resistant to Tunicamycin and Caspofungin but more sensitive to Amphotericin B, Ketoconazole, Fluconazole and Posaconazole than the parental strain. The null mutant showed a reduced virulence, in a murine model than the parental strain, evidencing that the presence of Pga26 is important to the virulence of C. albicans. Transcriptional profiling studies of pga26/pga26 revealed that the absence of Pga26 almost does not alter the expression of other genes, under the studied conditions.

La contaminación de los alimentos por sustancias químicas es un problema de salud pública de gran preocupación a escala mundial. El motivo puede ser consecuencia de la contaminación ambiental que puede alcanzar a las cadenas alimentarias a través del aire, del agua y del suelo. Contribuye también el uso intencionado de diversos productos químicos, tales como pesticidas, fármacos o sustancias administradas a los animales, y de otros productos agroquímicos (abonos, etc). Algunos aditivos utilizados en alimentos así como la fabricación y el procesamiento de los mismos también pueden aportar contaminantes.Por tanto son muchos los contaminantes orgánicos que pueden estar presentes en alimentos, como micotoxinas, plaguicidas, y otros compuestos asociados a la contaminación ambiental o bien sustancias que por el procesado, conservación y/o envasado pueden encontrarse en los alimentos. Para vigilar la seguridad alimentaria, diversas agencias medioambientales y de calidad se encargan de que la legislación se cumpla de forma rigurosa, mediante la aplicación de métodos analíticos adecuados para la detección de contaminantes en alimentos de forma rápida y eficaz, utilizando metodologías multirresiduo y realizando muestreos y controles sobre los alimentos en fase de comercialización.A lo largo del último siglo, los avances logrados en las condiciones sanitarias de las producciones vegetales y animales junto con el establecimiento de los sistemas veterinarios de higiene e inspección de los alimentos, han conducido a una situación de garantías sanitarias excelentes. A pesar de ello, el interés de la población por la "seguridad alimentaria" se ha convertido en una exigencia por parte de los ciudadanos en tanto que son consumidores responsables. El análisis de contaminantes orgánicos en alimentos engloba muchas disciplinas incluidas la química, bioquímica y la microbiología. Están presentes a unas concentraciones extremadamente bajas, en mezclas complejas de compuestos de los alimentos naturales. Sin embargo, cualquier técnica que se utilice en el análisis de alimentos debe alcanzar o ser capaz de separar los compuestos de la matriz y la identificación de los contaminantes a niveles traza.En esta tesis, el objetivo principal fue la determinación de residuos de diferentes contaminantes orgánicos (plaguicidas y medicamentos veterinarios) por diferentes técnicas cromatográficas a fin de obtener resultados que permitan poner de manifiesto el grado de seguridad alimentaria.Para ello, se abordan diversos objetivos parciales: 1.-Extracción de residuos de plaguicidas y medicamentos veterinarios por procedimientos clásicos de extracción en fase sólida, y otros más innovadores, como extracción sobre barras magnéticas y extracción presurizada con disolventes. 2.- Análisis de plaguicidas por cromatografía líquida-espectrometría de masas previa utilización de los métodos de extracción en fase sólida y extracción sobre barras magnéticas. 3.-Comparación de las técnicas de preconcentración en línea, para el análisis de plaguicidas a fin de alcanzar unos límites de detección adecuados para su determinación en frutas y verduras por electroforesis capilar. 4.-Estudiar el empleo de la espectrometría de masas como técnica de determinación acoplada a la electroforesis capilar en sus variantes electroforesis capilar-simple cuadrupolo y electroforesis capilar-trampa de iones para llevar a cabo la detección de residuos de plaguicidas y medicamentos veterinarios. 5.-Aplicación de los procedimientos de análisis seleccionados a diversos alimentos de origen vegetal como, uva, fresa, tomate, lechuga, melocotones, y nectarinas, y alimentos de origen animal como pescado y carne de pollo y cerdo.Se concluyó que la determinación simultánea y cuantitativa en muestras de alimentos procedentes de la Comunidad Valenciana, mediante la utilización de extracción en fase sólida, extracción sobre barras magnéticas o extracción presurizada con disolventes y electroforesis capilar con detector de filas de diodos o espectrometría de masas, pone de manifiesto la utilidad de la electroforesis capilar en la determinación de residuos de plaguicidas en matrices complejas hortofrutícolas como uva, lechuga, tomate, fresa, melocotón y nectarinas y residuos de medicamentos veterinarios en alimentos de origen animal como pescado y carne de pollo y cerdo.La presencia de residuos de contaminantes orgánicos en alimentos, aunque en un pequeño porcentaje de muestras y generalmente a bajas concentraciones, hace necesario el desarrollo y la optimización de métodos para que su correcta determinación permita una adecuada seguridad alimentaria. / Food contamination by chemical substances is a Public Health problem, all over the world. The cause could be as a consequence of environmental contamination that food chains could rise through air, water and soil as it occurs in the case of metals, PCBs, dioxins, etc. Contribute also the deliberate (intentionate) use of several chemical products, as pesticides, drugs or different substances administrated to animals and other agrochemical products. Few additives used in food as manufacturing and processing that can also contribute to add contaminants.In order to control food safety, several environmental and quality agencies take care of the compliance of legislation, through the application of adequate analytical methods to determinate in quick and efficient of contaminants in food by using multirresidue methodologies and carrying out sampling and food controls in food in commercializing phase.To analyze organic contaminants in food is a hard task which implies different and many disciplines as chemistry, biochemistry and microbiology. It is not a easy task, and many contaminants could be enumerated. They are presented at very low concentrations, complex matrices and among compounds of natural food. However, to analyze samples with complex matrices and with analytes at very low concentrations makes necessary to apply separation techniques in analytical procedures with the double objective of improve selectivity and sensibility. In this context, different separation analytical techniques, being of special relevance chromatographic techniques has been developed, because of the importance in actual analytical chemistry.The objective of this thesis is the determination of residues of two organic contaminants, pesticides and veterinary drugs, by using different chromatographic techniques to evaluate the degree of food safety.For this, partial objectives have to be approached: 1.-Pesticide and veterinary drugs residues extraction by using classical extraction procedures, as solid phase extraction and other more innovatives, as stir bar sorptive extraction and pressurized solvent extraction. 2.-Pesticide analysis by liquid cromatography-mass spectrometry previous the use of the extraction methods like solid phase extraction and stir bar sorptive extraction. 3.-Comparison of on-line preconcentration techniques, for the pesticide analysis in order to reach adequated limits of detection for its determination in fruits and vegetables by capillary electrophoresis. 4.-Study the use of mass spectrometry as a determination technique coupled to capillary electrophoresis using different mass analyzers, capillary electrophoresis-single quadrupole and capillary electrophoresis-ion trap to carry out these techniques in pesticide and veterinary drugs residue detection. 5.-Apply the selected analytical procedures to different vegetable products as grapes, strawberry, tomato, lettuce, peaches and nectarines, as well as to animal food such as fish, chicken and pork.It was concluded that the quantitative and simultaneous determination in food samples from Valencian Community, through solid phase extraction, sitr-bar sorptive extraction or pressurized liquid extraction and by capillary electrophoresis with diode array or mass spectrometry detection, make known the utility of capillary electrophoresis for pesticide residues determination in complex fruit and vegetable matrices as grape, lettuce, tomato, strawberry, peach and nectarines and veterinary drug residues in animal origin food as fish and chicken and pork meat.The presence of organic contaminants residues in food, although in few samples percentage and often at a low concentrations, makes necessary to develop and optimize methods in order to ensure that its correct determination allows an appropriate food safety.