Epithelial barriers are central to the development of metazoans by compartmentalizing the body in distinct chemical milieus essential for the function of many organs. One such barrier is the blood-brain barrier, which isolates the nervous system from the body fluid to maintain its ionic homeostasis and ensure nerve pulse transmission. In Drosophila, the blood-brain barrier is formed late in embryogenesis by a thin epithelium of subperineurial glia that ensheath the nervous system. Similar to other epithelia, subperineurial glia seal the paracellular space by forming large multiprotein complexes at the lateral membrane, the septate junctions (SJs), which impede free diffusion and mediate barrier function. To identify novel genes required for blood-brain barrier formation, we followed a genome-wide in vivo RNAi approach. We initially screened almost the whole genome for genes required in glia for adult viability and impressively identified 3679 potential candidates. Subsequently, we tested these candidates for requirement in subperineurial glia for adult survival and identified 383 genes. At a last step, we directly asked if blood-brain barrier formation is compromised in the knock-down of the genes by performing the embryonic dye penetration assay in a selection of candidates and identified five genes that play a role during barrier development. Three of these genes, macroglobulin complement-related (mcr) and the previously uncharacterized pasiflora1 and pasiflora2 are further characterized in the context of this thesis. Here we show that all three proteins are novel components of the Drosophila SJ. Pasiflora1 and Pasiflora2 belong to a previously uncharacterized family of tetra-spanning membrane proteins, while Mcr was reported to be a secreted protein in S2 cells required for phagocytosis and clearance of specific pathogens. Through detailed phenotypic analysis we demonstrate that the mutants show leaky blood-brain and tracheal barriers, overelongated tracheal tubes and mislocalization of SJ proteins, phenotypes that are characteristic of SJ mutants. Consistent with the observed phenotypes, the genes are co-expressed in SJ-forming embryonic epithelia and glia and are required cell-autonomously to exert their function. In columnar epithelia, the proteins localize at the apicolateral membrane compartment, where they colocalize with other SJ proteins, and similar to known SJ components, their restricted localization depends on other complex members. Using fluorescence recovery after photobleaching experiments, we demonstrate for Pasiflora proteins that they are core SJ components, as they are required for complex formation and themselves show restricted mobility within the membrane of wild-type epithelial cells, but fast diffusion in cells with disrupted SJs. Taken together, our results show that Pasiflora1 and Pasiflora2 are novel integral SJ components and implicate a new family of tetraspan proteins in the development of cell junctions. In addition, we find a new unexpected role for Mcr as a transmembrane SJ protein, which raises questions about a potential intriguing link between epithelial barrier function, phagocytosis and innate immunity and has potential implications for the function of occluding junctions.

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Um den Wirkmechanismus verschiedener Krebstherapeutika aufzuklären bzw. besser zu verstehen wurden in der vorliegenden Arbeit deren Wirkungen auf Zelllinien untersucht. Hierfür wurde die Wirkung verschiedener kommerziell erhältlicher und einiger Roche-eigener Kinaseinhibitoren auf Leukämiezelllinien untereinander und mit der Wirkung von FLT3-siRNAs verglichen. Die Auswirkungen von Behandlungen mit anti-CD20- und anti-BCR-Antikörper wurden an Lymphomzelllinien analysiert. Für die FLT3-Inhibition konnte gezeigt werden, dass die Vorhersagen zur Spezifität aus der Display-Technologie in vier von fünf Fällen tendenziell richtig waren. In einem mehrstufigen Verfahren wurden verschiedene Eigenschaften der Inhibitoren getestet: Hemmung der Phosphorylierung von rekombinanter FLT3-Kinase, Hemmung der zellulären Phosphorylierung der Wildtyp-FLT3-Kinase, Hemmung der Phosphorylierung von FLT3 mit der ITD-Mutation. So konnte für die Substanzen VX-680, CHIR-265 und RKI-1 eine FLT3-Hemmung als primärer Wirkmechanismus in einer Zelllinie mit FLT3-ITD ausgeschlossen werden. Für die kommerziell erhältlichen Inhibitoren Sorafenib, CFI-2 und CFI-3 sowie die neue Substanz RKI-3 konnte bestätigt bzw. gezeigt werden, dass sie FLT3 / FLT3-ITD in biochemischen und zellulären Testsystemen spezifisch hemmen können. Die Expressionsprofilierung erwies sich für die Klärung dieser Fragestellung nur als bedingt geeignet, da die Expressionsmuster der Behandlungen mit verschiedenen Inhibitoren untereinander trotz unterschiedlicher Wirkungsweisen funktionell stark übereinstimmten. In diesen Profilen zeichnete sich bereits nach vierstündiger Behandlung ein Zellzyklusarrest ab, und im weiteren Verlauf wurden sie von Expressionsänderungen aus dem Umfeld der Apoptose dominiert. Die Inhibitoren konnten jedoch hinsichtlich der FLT3-Hemmung relativ zu einander aufgrund der Übereinstimmung mit dem Muster der Behandlung mit FLT3-siRNAs eingeordnet werden. Aus den bei beiden Behandlungsarten übereinstimmend deregulierten Genen wurden zeitabhängige FLT3-Inhibitionssignaturen abgeleitet.Die Untersuchungen zum Wirkmechanismus von Typ I anti-CD20-Antikörpern zeigten, dass der Signalweg downstream von CD20 in den getesteten Zelllinien zumindest teilweise mit dem der BCR-Aktivierung identisch ist. Obgleich die Übereinstimmung der BCR-Aktivierungsmuster der verschiedenen Zelllinien verhältnismäßig gering war, konnte gezeigt werden, dass die Transkriptionsmuster der Behandlungen mit anti-CD20- bzw. anti-BCR-Antikörpern untereinander in großen Teilen übereinstimmten. Zwei der besonders schnell und stark induzierten Gene waren CCL3 und CCL4. Die Kinase SYK ist als Signalüberträger downstream des BCR bekannt. Die Induktion der Cytokine CCL3 und CCL4 konnte durch SYK-Hemmung mittels spezifischer Inhibitoren und das siRNA-vermittelte Stilllegen von SYK deutlich vermindert werden. Somit deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass SYK auch im Signalweg von CD20 eine wichtige Rolle spielt. Durch die Behandlung von NHL-Zelllinien mit anti-CD20-Antikörpern wie Rituximab oder LT20 wird demzufolge eine zelluläre Antwort ausgelöst, die einer BCR-Aktivierung ähnelt.

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