Submitted by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-07-06T13:30:50Z No. of bitstreams: 1 cp140202.pdf: 801715 bytes, checksum: 77b9797c6e724ebc02ec928d4905cfac (MD5) / Approved for entry into archive by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-07-06T13:31:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cp140202.pdf: 801715 bytes, checksum: 77b9797c6e724ebc02ec928d4905cfac (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-06T13:31:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cp140202.pdf: 801715 bytes, checksum: 77b9797c6e724ebc02ec928d4905cfac (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / INTRODUÇÃO: A deficiência e a exacerbação do sistema Fas/FasL está associada ao aparecimento de diversas doenças hematológicas ou não. Na HPN, existem evidências de que o sistema Fas/FasL possa atuar na seleção e proliferação do clone mutante através do aumento da apoptose das células normais. Nosso objetivo foi determinar a expressão dos marcadores de apoptose Fas e FasL em neutrófilos e monócitos de pacientes com HPN e tentar estabelecer relação entre estes marcadores de apoptose e os subtipos clínicos da doença. MATERIAL E MÉTODOS: Foram estudados 16 pacientes em acompanhamento nos Serviços de Hematologia da Universidade de São Paulo (USP) e da Escola Paulista de Medicina (UNIFESP). Os pacientes foram divididos clinicamente em HPN clássica (HPN: 9 indivíduos) e HPN associada a quadro de falência medular (HPN/FM: 7 indivíduos). Foi avaliada a expressão de Fas (CD95) e de FasL em neutrófilos (CD59) e monócitos (CD14) de portadores de HPN, através de citometria de fluxo (FACScalibur, programa Cell Quest - BDB). Nos indivíduos HPN, as populações de neutrófilos foram divididas segundo sua positividade para o antígeno CD59 (59+/PC ou 59-/PC), e nos monócitos para o CD14 (14+/PC ou 14-/PC). Também foi analisada a expressão de Fas/FasL em neutrófilos (59+/GC) e monócitos (14+/GC) de 10 indivíduos normais (grupo controle). RESULTADOS: Quando analisado o grupo total de pacientes, não foi vista diferença estatística na expressão do Fas quando comparados granulócitos (59+/PC, 59-/PC, 59+/GC) e monócitos (14+/PC, 14-/PC, 14+/GC). A expressão de FasL nos granulócitos 59-/PC foi significantemente menor do que nos 59+/PC (p=0,008). Não foi observada diferença estatística na expressão de FasL em monócitos. Quando analisados os subtipos clínicos, pacientes com HPN/FM apresentaram menor expressão de Fas nos granulócitos 59-/PC (p=0,041) e nos monócitos 14-/PC (p=0,014) do que os indivíduos com HPN. A expressão de FasL não mostrou alterações em granulócitos e monócitos entre os grupos HPN e HPN/FM. Nos indivíduos com HPN/FM, entretanto, as células 59-/PC apresentaram expressão de FasL significantemente diminuídas em relação às 59+/PC (p=0,031). DISCUSSÃO E CONCLUSÕES: Relatos anteriores sugerem que ocorra maior expressão de Fas em células-tronco CD59+ em comparação às células-tronco CD59-. Neste estudo, pacientes com falência medular associada apresentaram menor expressão de Fas em neutrófilos 59-/PC e monócitos 14-/PC do que os pacientes com HPN clássica, sugerindo que nestes pacientes as células 59+/PC e 14+/PC estariam mais sujeitas à apoptose, concordando com a hipótese de vantagem da sobrevida do clone HPN. A expressão de FasL foi maior em neutrófilos 59+/PC em comparação com 59-/PC, fato que se confirmou especialmente no grupo com falência medular associada. Este dado poderia sugerir um excesso de FasL na medula óssea levando à apoptose das células-tronco, o que explicaria a alterações medulares características da HPN. Apesar da importância do FasL na apoptose, este é o primeiro estudo a analisar a expressão de FasL em fagócitos de pacientes com HPN. / INTRODUCTION: The Fas/FasL system dysfunction has been associated with hematological and non hematological diseases. In PNH, there are evidences that this system could select and maintain the proliferation of the mutational clone through the promotion of normal cells apoptosis. The aim of this study was to analyze the expression of Fas and FasL in neuthophils and monocytes from PNH patients. We tried also to detect a possible relation between these expressions and clinical subtypes of this disease. METHODS: We analyzed 16 patients followed in 2 institutions: Sao Paulo State University (USP) and Federal University of Sao Paulo (UNIFESP). The patients were clinically classified as classic PNH (PNH/CL: 9 patients) and PNH in the setting of another bone marrow failure syndrome (PNH/BF: 7 patients). The expression of Fas (CD95) e Fas ligant (FasL) in neutrophils (CD59) and monocytes (CD14) was analyzed by flow citometry (FACScalibur, Cell Quest software - BDB). In PNH individuals, the neutrophils were divided according CD59 positivity (59+/Pt or 59- /Pt), and in monocytes according CD14 positivity (14+/Pt or 14-/Pt). There was analyzed the Fas/FasL expression in neutrophils (59+/CG) and monocytes (14+/CG) in 10 normal individuals (control group). RESULTS: When we analyzed all patients, no statistical difference was found in Fas expression among the neutrophils 59+/Pt, 59-/Pt and 59+/CG. The same result was observed among monocytes 14+/Pt, 14-/Pt and 14+/CG. FasL expression on 59-/Pt neutrophils was significantly less than on 59+/Pt (p=0.008). FasL expression on monocytes showed no statistical difference. When we analyzed the data according with clinical subtypes, PNH/BF patients had less Fas expression on 59-/Pt neutrophils (p=0.041) and on 14-/Pt monocytes (p=0.014) than PNH/CL. FasL expression did not showed difference on neutrophils and monocytes between PNH/CL and PNH/BF patients. The group of PNH/BF individuals, however, had 59-/Pt with less FasL expression than 59+/Pt cells (p=0.031). DISCUSSION: Previous studies had been show higher expression of Fas in CD59+/stem cells than CD59-/stem cells. In this study, PNH/BF patients had less Fas expression on 59-/Pt and on 14-/Pt cells than PNH/CL patients. This data suggest that 59+/Pt and 14+/PT cells could be more susceptible to apoptosis, with is in agreement with the PNH clone survival advantage hypothesis. FasL expression was higher on 59+/Pt than on 59-/Pt, especially in the PNH/BF group. We could speculate, with this data, that FasL in excess could act in bone marrow, initiating the stem cells apoptosis process, what explain the characteristics bone marrow alterations found in PNH. Although of the importance of FasL in apoptosis, this is the first study to analyze its expression on PNH. / FAPESP: 04/12342-4 / FAPESP: 04/16019-3

Modelos murinos de infecção revelaram que as células T CD8+ (LTCs) são essenciais no controle de Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas. No entanto, durante a doença, os LTCs são notavelmente alterados e sub-ótimos, estabelecendo a fase crônica. Nos últimos anos, vários trabalhos sob a Doença de Chagas visam melhorar o desempenho dos LTCs. Apesar que os mecanismos citotóxicos, como perforina/granzima e interações Fas/FasL, pelos LTCs são bem caraterizados, a regulação de ambos não são completamente entendidos. Porém, nós investigamos se alguns parâmetros podem estar envolvidos na regulação in vivo das respostas efetoras dos LTCs pela vacina terapêutica de Trypanosoma cruzi baseado em Adenovírus humano tipo 5. Nós encontramos que a carga viral e o tempo após imunização têm um impacto na comutação do fenótipo citotóxico dos LTCs. Nossa descoberta evidencia os papeis não redundantes da perforina e FasL e a importância destes parâmetros na citotoxicidade FasL-independente, eventos envolvidos na busca uma efetiva vacina contra a Doença de Chagas. / Models of infection revealed that CD8+ T cells (CTLs) are essential for control of Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease. However, during disease, the CTLs are remarkably delayed and suboptimal establishing the chronic phase. In the latest years, several works about Chagas disease aim to enhance the performance of CTLs. Although the effector mechanisms of target cells elimination as perforin/granzymes and Fas/FasL interactions by CTLs are well characterized, the regulation of both are non-completed understood. Here, we investigated if some parameters can be involved in the in vivo regulation of CTL effector responses by a human type 5 Adenovirus-based Trypanosoma cruzi therapeutic vaccine. We found that, the viral load and time post-immunization have an impact in the CTL switching killing phenotype. Our findings shows the evidence of the nonredundant roles of the perforin and FasL and the importance of those parameters in the FasL-independent cytotoxicity, events related with the searching for an effective vaccine against Chagas disease.