Submitted by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-07-06T13:30:50Z No. of bitstreams: 1 cp140202.pdf: 801715 bytes, checksum: 77b9797c6e724ebc02ec928d4905cfac (MD5) / Approved for entry into archive by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-07-06T13:31:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cp140202.pdf: 801715 bytes, checksum: 77b9797c6e724ebc02ec928d4905cfac (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-06T13:31:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cp140202.pdf: 801715 bytes, checksum: 77b9797c6e724ebc02ec928d4905cfac (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / INTRODUÇÃO: A deficiência e a exacerbação do sistema Fas/FasL está associada ao aparecimento de diversas doenças hematológicas ou não. Na HPN, existem evidências de que o sistema Fas/FasL possa atuar na seleção e proliferação do clone mutante através do aumento da apoptose das células normais. Nosso objetivo foi determinar a expressão dos marcadores de apoptose Fas e FasL em neutrófilos e monócitos de pacientes com HPN e tentar estabelecer relação entre estes marcadores de apoptose e os subtipos clínicos da doença. MATERIAL E MÉTODOS: Foram estudados 16 pacientes em acompanhamento nos Serviços de Hematologia da Universidade de São Paulo (USP) e da Escola Paulista de Medicina (UNIFESP). Os pacientes foram divididos clinicamente em HPN clássica (HPN: 9 indivíduos) e HPN associada a quadro de falência medular (HPN/FM: 7 indivíduos). Foi avaliada a expressão de Fas (CD95) e de FasL em neutrófilos (CD59) e monócitos (CD14) de portadores de HPN, através de citometria de fluxo (FACScalibur, programa Cell Quest - BDB). Nos indivíduos HPN, as populações de neutrófilos foram divididas segundo sua positividade para o antígeno CD59 (59+/PC ou 59-/PC), e nos monócitos para o CD14 (14+/PC ou 14-/PC). Também foi analisada a expressão de Fas/FasL em neutrófilos (59+/GC) e monócitos (14+/GC) de 10 indivíduos normais (grupo controle). RESULTADOS: Quando analisado o grupo total de pacientes, não foi vista diferença estatística na expressão do Fas quando comparados granulócitos (59+/PC, 59-/PC, 59+/GC) e monócitos (14+/PC, 14-/PC, 14+/GC). A expressão de FasL nos granulócitos 59-/PC foi significantemente menor do que nos 59+/PC (p=0,008). Não foi observada diferença estatística na expressão de FasL em monócitos. Quando analisados os subtipos clínicos, pacientes com HPN/FM apresentaram menor expressão de Fas nos granulócitos 59-/PC (p=0,041) e nos monócitos 14-/PC (p=0,014) do que os indivíduos com HPN. A expressão de FasL não mostrou alterações em granulócitos e monócitos entre os grupos HPN e HPN/FM. Nos indivíduos com HPN/FM, entretanto, as células 59-/PC apresentaram expressão de FasL significantemente diminuídas em relação às 59+/PC (p=0,031). DISCUSSÃO E CONCLUSÕES: Relatos anteriores sugerem que ocorra maior expressão de Fas em células-tronco CD59+ em comparação às células-tronco CD59-. Neste estudo, pacientes com falência medular associada apresentaram menor expressão de Fas em neutrófilos 59-/PC e monócitos 14-/PC do que os pacientes com HPN clássica, sugerindo que nestes pacientes as células 59+/PC e 14+/PC estariam mais sujeitas à apoptose, concordando com a hipótese de vantagem da sobrevida do clone HPN. A expressão de FasL foi maior em neutrófilos 59+/PC em comparação com 59-/PC, fato que se confirmou especialmente no grupo com falência medular associada. Este dado poderia sugerir um excesso de FasL na medula óssea levando à apoptose das células-tronco, o que explicaria a alterações medulares características da HPN. Apesar da importância do FasL na apoptose, este é o primeiro estudo a analisar a expressão de FasL em fagócitos de pacientes com HPN. / INTRODUCTION: The Fas/FasL system dysfunction has been associated with hematological and non hematological diseases. In PNH, there are evidences that this system could select and maintain the proliferation of the mutational clone through the promotion of normal cells apoptosis. The aim of this study was to analyze the expression of Fas and FasL in neuthophils and monocytes from PNH patients. We tried also to detect a possible relation between these expressions and clinical subtypes of this disease. METHODS: We analyzed 16 patients followed in 2 institutions: Sao Paulo State University (USP) and Federal University of Sao Paulo (UNIFESP). The patients were clinically classified as classic PNH (PNH/CL: 9 patients) and PNH in the setting of another bone marrow failure syndrome (PNH/BF: 7 patients). The expression of Fas (CD95) e Fas ligant (FasL) in neutrophils (CD59) and monocytes (CD14) was analyzed by flow citometry (FACScalibur, Cell Quest software - BDB). In PNH individuals, the neutrophils were divided according CD59 positivity (59+/Pt or 59- /Pt), and in monocytes according CD14 positivity (14+/Pt or 14-/Pt). There was analyzed the Fas/FasL expression in neutrophils (59+/CG) and monocytes (14+/CG) in 10 normal individuals (control group). RESULTS: When we analyzed all patients, no statistical difference was found in Fas expression among the neutrophils 59+/Pt, 59-/Pt and 59+/CG. The same result was observed among monocytes 14+/Pt, 14-/Pt and 14+/CG. FasL expression on 59-/Pt neutrophils was significantly less than on 59+/Pt (p=0.008). FasL expression on monocytes showed no statistical difference. When we analyzed the data according with clinical subtypes, PNH/BF patients had less Fas expression on 59-/Pt neutrophils (p=0.041) and on 14-/Pt monocytes (p=0.014) than PNH/CL. FasL expression did not showed difference on neutrophils and monocytes between PNH/CL and PNH/BF patients. The group of PNH/BF individuals, however, had 59-/Pt with less FasL expression than 59+/Pt cells (p=0.031). DISCUSSION: Previous studies had been show higher expression of Fas in CD59+/stem cells than CD59-/stem cells. In this study, PNH/BF patients had less Fas expression on 59-/Pt and on 14-/Pt cells than PNH/CL patients. This data suggest that 59+/Pt and 14+/PT cells could be more susceptible to apoptosis, with is in agreement with the PNH clone survival advantage hypothesis. FasL expression was higher on 59+/Pt than on 59-/Pt, especially in the PNH/BF group. We could speculate, with this data, that FasL in excess could act in bone marrow, initiating the stem cells apoptosis process, what explain the characteristics bone marrow alterations found in PNH. Although of the importance of FasL in apoptosis, this is the first study to analyze its expression on PNH. / FAPESP: 04/12342-4 / FAPESP: 04/16019-3

INTRODUÇÃO: A HPN é uma patologia na qual a atividade do sistema complemento, sem oposição, leva a complicações sistêmicas. Ela é caracterizada por anemia hemolítica adquirida com hemoglobinúria intermitente, falência medular e fenômenos tromboembólicos (TE). A trombose venosa é a sua principal causa de mortalidade, entretanto o seu mecanismo fisiopatológico é apenas parcialmente elucidado. O grande número de pacientes com trombocitopenia dificulta o manejo da profilaxia antitrombótica secundária e primária. Optou-se por evidenciar o desequilíbrio hemostático associado ao clone HPN através de um teste de avaliação global da coagulação. MÉTODOS: Para a detecção do potencial hemostático de cada indivíduo foi utilizado um ensaio fluorogênico de geração de trombina, em amostra de plasma pobre em plaquetas na presença e na ausência de trombomodulina (TM). A eficiência na redução do potencial de trombina endógeno (ETP) e da concentração máxima de trombina (pico) pela TM foi utilizada para a identificação do estado de hipercoagulabilidade. O tempo para o início da geração de trombina (tempo de latência) e para a concentração máxima de trombina foram utilizados para a detecção do fenótipo hemorrágico. Os indivíduos foram categorizados em três grupos: HPN, se clone HPN >= 10%; anemia aplástica idiopática adquirida ou associada a clone < 10%, e normais. Os pacientes e controles foram submetidos a avaliação laboratorial que incluiu pesquisa de trombofilia (TB) e do clone HPN, hemograma, testes habituais de avaliação da hemostasia, e no grupo de pacientes análise bioquímica. Os participantes foram avaliados para a identificação da presença de fatores de risco para TE através de questionário. A análise dos resultados foi realizada em duas fases: a primeira incluiu apenas indivíduos com pesquisa de TB negativa e sem fatores de risco para TE; a segunda, realizada apenas no grupo de pacientes, também incluiu indivíduos em uso de contraceptivo hormonal, diagnóstico de infecção assintomática, evento de TE associado a fator de risco temporário, em período superior a 1 ano da inclusão no estudo, e com pesquisa de TB positiva. Esta última fase da análise teve como objetivo incluir um maior número de pacientes com o diagnóstico destas patologias, de baixa prevalência populacional. RESULTADOS: A presença do clone >= 10% foi associada à ineficiência da ação da TM em reduzir o ETP e o pico. O primeiro, de maior relevância científica e clínica, apresentou correlação positiva e negativa, respectivamente, com a atividade do fator von Willebrand (FvW:RCo) e com níveis plasmáticos de proteína C (PC). O grupo HPN apresentou menor tempo para atingir o pico. Na segunda fase, o tempo de latência apresentou correlação negativa com o número de plaquetas no grupo HPN, e houve correlação positiva do clone com a ineficiência da ação da TM na redução do ETP. CONCLUSÕES: o teste de geração de trombina é eficaz na detecção do fenótipo protrombótico associado ao clone HPN. As correlações encontradas com o FvW:RCo e a PC sugerem que a ativação endotelial e o sistema da PC, respectivamente, podem estar comprometidos. A inflamação secundária à ativação do sistema complemento pode levar à redução de expressão endotelial da TM e do receptor da PC. Entretanto os nossos achados, associados à descrição recente da redução de expressão e de atividade da TM, secundária à depleção de óxido nítrico (em estudos com estatinas), podem justificar a característica agressiva da trombofilia na HPN, e o desenvolvimento de TE mesmo nos pacientes em anticoagulação oral. Os parâmetros que avaliam o \'tempo\' no trombograma (tempo de latência e tempo para o pico) podem auxiliar na identificação do risco hemorrágico eventualmente associado à HPN / INTRODUCTION: PNH is a pathology in which the uncontrolled activity of the complement system leads to systemic complications. The pathology is characterized by an acquired hemolytic anemia with intermittent hemoglobinuria, bone marrow failure and thromboembolic event (TE). Venous thrombosis is the main cause of death, however, its physiopathological mechanism is only partially understood. The large number of patients with thrombocytopenia affects the management of primary and secondary antithrombotic prophylaxis. We chose to demonstrate the hemostatic unbalance associated with PNH clone through a global evaluation of the coagulation test. METHODS: To detect the hemostatic potential, we used a fluorogenic thrombin-generation assay, in platelet-poor plasma, with and without throbomodulin (TM). Analysis of the efficiency of TM in reducing the endogenous thrombin potential (ETP) and of the upper limit of thrombin concentration (peak) was done to identify the hypercoagulable state. Times to initiate thrombin generation (latency time-LT) and for reaching the peak were used to identify hemorrhagic phenotypes. Subjects were divided in three groups: PNH patients (if PNH clone >= 10%), patients with acquired idiopathic aplastic anemia or clone-associated (clone < 10%), and controls. Patients and controls were investigated for thrombophilia (TB) and PNH clone, underwent blood test, and regular exams to evaluate hemostasis. Patients were evaluated for the presence of risk factors for TE through questionnaires. Results were analyzed in two steps: the first included only patients negative for TB and with no risk factors for TE; the second step, done only in patients, included individuals using hormonal contraceptive, diagnosis of any asymptomatic infection, TE associated to temporary risk factors, and which have occurred in a period longer than one year since inclusion in the study, and positive TB. The aim of the second step was to gather the largest possible number of patients in these low prevalence pathologies. RESULTS: The presence of the clone >= 10% was associated with TM inefficiency in reducing the ETP (ETP+TM) and peak. In the first analysis, which had greater clinical relevance, we observed a positive correlation between ETP+TM and the activity of the von Willebrand factor (FvW:RCo), whereas a negative correlation was observed with the levels of protein C (PC). The PNH group presented the shortest time to reach the peak. In the second step of the analysis, the LT showed negative correlation with platelet counts in the PNH group, whereas a positive correlation between the clone and ETP+TM was observed. CONCLUSION: The thrombin-generation assay effectively detects the prothrombotic phenotype associated to PNH. The correlation found with both FvW:RCo and PC suggests that endothelial activation, and the PC system as well, may be deficient in these patients. Secondary inflammation to activation of the complement system may lead to lower endothelial expression of TM and of the PC receptor. However, our findings, together with recent descriptions of a reduced expression of the TM activity secondary to nitric oxide depletion (observed in studies on statin) may explain the aggressive nature of thrombophilia in PNH and the development of TE in these patients, even in those taking oral anticoagulants. The parameters that measure the time of thrombin generation may help identify the hemorrhagic risk that might be associated with PNH

INTRODUÇÃO: A HPN é uma patologia na qual a atividade do sistema complemento, sem oposição, leva a complicações sistêmicas. Ela é caracterizada por anemia hemolítica adquirida com hemoglobinúria intermitente, falência medular e fenômenos tromboembólicos (TE). A trombose venosa é a sua principal causa de mortalidade, entretanto o seu mecanismo fisiopatológico é apenas parcialmente elucidado. O grande número de pacientes com trombocitopenia dificulta o manejo da profilaxia antitrombótica secundária e primária. Optou-se por evidenciar o desequilíbrio hemostático associado ao clone HPN através de um teste de avaliação global da coagulação. MÉTODOS: Para a detecção do potencial hemostático de cada indivíduo foi utilizado um ensaio fluorogênico de geração de trombina, em amostra de plasma pobre em plaquetas na presença e na ausência de trombomodulina (TM). A eficiência na redução do potencial de trombina endógeno (ETP) e da concentração máxima de trombina (pico) pela TM foi utilizada para a identificação do estado de hipercoagulabilidade. O tempo para o início da geração de trombina (tempo de latência) e para a concentração máxima de trombina foram utilizados para a detecção do fenótipo hemorrágico. Os indivíduos foram categorizados em três grupos: HPN, se clone HPN >= 10%; anemia aplástica idiopática adquirida ou associada a clone < 10%, e normais. Os pacientes e controles foram submetidos a avaliação laboratorial que incluiu pesquisa de trombofilia (TB) e do clone HPN, hemograma, testes habituais de avaliação da hemostasia, e no grupo de pacientes análise bioquímica. Os participantes foram avaliados para a identificação da presença de fatores de risco para TE através de questionário. A análise dos resultados foi realizada em duas fases: a primeira incluiu apenas indivíduos com pesquisa de TB negativa e sem fatores de risco para TE; a segunda, realizada apenas no grupo de pacientes, também incluiu indivíduos em uso de contraceptivo hormonal, diagnóstico de infecção assintomática, evento de TE associado a fator de risco temporário, em período superior a 1 ano da inclusão no estudo, e com pesquisa de TB positiva. Esta última fase da análise teve como objetivo incluir um maior número de pacientes com o diagnóstico destas patologias, de baixa prevalência populacional. RESULTADOS: A presença do clone >= 10% foi associada à ineficiência da ação da TM em reduzir o ETP e o pico. O primeiro, de maior relevância científica e clínica, apresentou correlação positiva e negativa, respectivamente, com a atividade do fator von Willebrand (FvW:RCo) e com níveis plasmáticos de proteína C (PC). O grupo HPN apresentou menor tempo para atingir o pico. Na segunda fase, o tempo de latência apresentou correlação negativa com o número de plaquetas no grupo HPN, e houve correlação positiva do clone com a ineficiência da ação da TM na redução do ETP. CONCLUSÕES: o teste de geração de trombina é eficaz na detecção do fenótipo protrombótico associado ao clone HPN. As correlações encontradas com o FvW:RCo e a PC sugerem que a ativação endotelial e o sistema da PC, respectivamente, podem estar comprometidos. A inflamação secundária à ativação do sistema complemento pode levar à redução de expressão endotelial da TM e do receptor da PC. Entretanto os nossos achados, associados à descrição recente da redução de expressão e de atividade da TM, secundária à depleção de óxido nítrico (em estudos com estatinas), podem justificar a característica agressiva da trombofilia na HPN, e o desenvolvimento de TE mesmo nos pacientes em anticoagulação oral. Os parâmetros que avaliam o \'tempo\' no trombograma (tempo de latência e tempo para o pico) podem auxiliar na identificação do risco hemorrágico eventualmente associado à HPN / INTRODUCTION: PNH is a pathology in which the uncontrolled activity of the complement system leads to systemic complications. The pathology is characterized by an acquired hemolytic anemia with intermittent hemoglobinuria, bone marrow failure and thromboembolic event (TE). Venous thrombosis is the main cause of death, however, its physiopathological mechanism is only partially understood. The large number of patients with thrombocytopenia affects the management of primary and secondary antithrombotic prophylaxis. We chose to demonstrate the hemostatic unbalance associated with PNH clone through a global evaluation of the coagulation test. METHODS: To detect the hemostatic potential, we used a fluorogenic thrombin-generation assay, in platelet-poor plasma, with and without throbomodulin (TM). Analysis of the efficiency of TM in reducing the endogenous thrombin potential (ETP) and of the upper limit of thrombin concentration (peak) was done to identify the hypercoagulable state. Times to initiate thrombin generation (latency time-LT) and for reaching the peak were used to identify hemorrhagic phenotypes. Subjects were divided in three groups: PNH patients (if PNH clone >= 10%), patients with acquired idiopathic aplastic anemia or clone-associated (clone < 10%), and controls. Patients and controls were investigated for thrombophilia (TB) and PNH clone, underwent blood test, and regular exams to evaluate hemostasis. Patients were evaluated for the presence of risk factors for TE through questionnaires. Results were analyzed in two steps: the first included only patients negative for TB and with no risk factors for TE; the second step, done only in patients, included individuals using hormonal contraceptive, diagnosis of any asymptomatic infection, TE associated to temporary risk factors, and which have occurred in a period longer than one year since inclusion in the study, and positive TB. The aim of the second step was to gather the largest possible number of patients in these low prevalence pathologies. RESULTS: The presence of the clone >= 10% was associated with TM inefficiency in reducing the ETP (ETP+TM) and peak. In the first analysis, which had greater clinical relevance, we observed a positive correlation between ETP+TM and the activity of the von Willebrand factor (FvW:RCo), whereas a negative correlation was observed with the levels of protein C (PC). The PNH group presented the shortest time to reach the peak. In the second step of the analysis, the LT showed negative correlation with platelet counts in the PNH group, whereas a positive correlation between the clone and ETP+TM was observed. CONCLUSION: The thrombin-generation assay effectively detects the prothrombotic phenotype associated to PNH. The correlation found with both FvW:RCo and PC suggests that endothelial activation, and the PC system as well, may be deficient in these patients. Secondary inflammation to activation of the complement system may lead to lower endothelial expression of TM and of the PC receptor. However, our findings, together with recent descriptions of a reduced expression of the TM activity secondary to nitric oxide depletion (observed in studies on statin) may explain the aggressive nature of thrombophilia in PNH and the development of TE in these patients, even in those taking oral anticoagulants. The parameters that measure the time of thrombin generation may help identify the hemorrhagic risk that might be associated with PNH