Orientador: Francesco Langone / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:17:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rezende_AlexandreCesarSantosde_M.pdf: 2677724 bytes, checksum: 332acee58d6f9fc544b659f930833e41 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A investigação de agentes terapêuticos para o tratamento de doenças neurodegenerativas e neurotraumas recebeu um grande impulso nas últimas décadas, em virtude do desenvolvimento de técnicas que permitiram a clonagem de moléculas com reconhecida ação neurotrófica. O emprego de modelos experimentais para o estudo de processos neurodegenerativos contribuiu significativamente ao conhecimento dos mecanismos de ação e especificidade dessas moléculas. O fator neurotrófico ciliar (CNTF) despertou grande interesse com a descoberta do seu efeito neuroprotetor sobre motoneurônios após secção de nervos periféricos em ratos neonatos e camundongos adultos. Contudo, os testes clínicos em pacientes com esclerose lateral amiotrófica revelaram efeitos colaterais importantes associados às diferentes doses e esquemas de tratamento com CNTF ecombinante humano. Estes resultados tiveram como conseqüência a interrupção dos testes clínicos e estimularam a busca de vias alternativas para a administração do CNTF com o objetivo de eliminar os efeitos colaterais indesejáveis. Uma via alternativa muito promissora parece ser a administração do CNTF conjugado com peptídeos que possuem domínio de transdução ou translocação de proteínas (PTDprotein transduction domain). Neste estudo investigamos o efeito do CNTF conjugado com um PTD derivado do vírus HIV-1 (Tat-CNTF) quando administrado a ratos neonatos (P2) após secção do nervo ciático. Um grupo de ratos (Wistar) teve o nervo ciático esquerdo seccionado e recebeu um fragmento de gelfoam embebido em CNTF (6µg), Tat-CNTF (6µg ou 3µg) ou PBS. Outro grupo sofreu o mesmo tipo de lesão e foi tratado diariamente, durante 5 dias, com doses subcutâneas de CNTF (1,2µg/g), Tat-CNTF (1,2, 0,6 ou 0,3µg/g) ou PBS. O peso corporal foi registrado diariamente entre P2 e P7. Na idade de P7 os animais foram perfundidos (paraformaldeído 4%) e a medula lombar foi embebida em parafina para obtenção de cortes seriais transversais. Os cortes foram corados com cresil violeta e os motoneurônios do grupamento ventrolateral de ambos os lados foram contados. A razão entre o número de motoneurônios do lado lesado e do lado íntegro correspondeu ao índice de sobrevivência neuronal (ISN). Uma série de 9 cortes de cada animal foi reagida para investigação imunoistoquímica da expressão de GFAP pelos astrócitos. Nossos resultados mostraram que o ISN de todos os grupos tratados com Tat-CNTF, local e subcutaneamente, foi similar aos dos grupos tratados da mesma forma com CNTF e maior que nos grupos tratados com PBS. O acompanhamento do ganho de peso dos animais entre P2 e P7 mostrou que aqueles que receberam tratamento local com CNTF ou Tat-CNTF apresentaram crescimento semelhante ao do observado nos animais do grupo controle. Por outro lado, a curva de crescimento dos animais tratados com doses subcutâneas diárias de CNTF (1,2µg/g), revelou que estes tiveram ganho de peso significativamente inferior ao dos animais tratados com a mesma dose, ou com as doses inferiores, de Tat-CNTF. O menor crescimento dos animais tratados com CNTF foi significativo a partir do segundo dia de tratamento. Na idade P7 o peso corporal desses animais foi 25% e 30% inferior aos dos animais tratados com Tat-CNTF e aos animais controle, respectivamente. Não houve diferença significativa de ganho de peso entre os animais tratados com as diferentes doses de Tat-CNTF e os animais tratados com PBS subcutaneamente. Além disso, a administração subcutânea de CNTF provocou intensa mobilização da gordura marrom interescapular, fenômeno não verificado nos animais tratados com Tat-CNTF. Os dados da análise imunoistoquímica para GFAP revelaram que a resposta astroglial nos animais tratados com Tat-CNTF foi menos intensa que a observada nos animais que receberam tratamento subcutâneo com CNTF. Nossos resultados revelaram que a Tat-CNTF além de possuir ação neuroprotetora não produziu os efeitos colaterais indesejáveis do CNTF, mesmo quando administrado em dose igual à deste último. Estes dados suportam a hipótese que a adição do domínio PTD a moléculas neurotróficas é uma estratégia de neuroproteção eficaz e abre perspectivas para possível emprego da Tat-CNTF em moléstias neurodegenerativas que afetam os motoneurônios espinhais, tais como a esclerose lateral amiotrófica / Abstract: The investigation of therapeutical agents for the treatment of neurodegenerative diseases and neurotrauma received a great attention in the last decades due to cloning techniques for neurotrophic molecules. Experimental models contributed to the knowledge of the mechanisms of action and specificity of such molecules. Ciliary neurotrophic factor (CNTF) is known as a neuroprotective agent on motoneurons after peripheral nerve section in neonatal rats and adult mice. However, clinical trials with human recombinat CNTF showed dose dependent-side effects. Consequently, new approaches for avoiding those side effects have been investigated, such as CNTF fused with domain transduction protein (PTD). In the present work, we studied the effects of CNTF fused with the PDT of the HIV-1 (Tat-CNTF) in neonatal rats (P2) after sciatic nerve transection. Wistar rats had their left sciatic nerve cut and embedded in gelfoam with either CNTF (6µg), Tat-CNTF (6µg or 3µg) or PBS. Other lesioned rats were treated subcutaneously with either CNTF (1.2µg/gr), Tat-CNTF (1.2, 0.6 or 0.3µg/gr) or PBS, once a day, for 5 days. The body weight was registered from P2 to P7. At P7 the rats were perfused (4% paraformaldehyde) and the lumbar spinal cord was infiltrated with paraffin. Serial transverse sections were stained with cresyl violet and used for ventrolateral motoneuron counting. The ratio between the number of motoneurons counted in the operated and control sides was defined as neuronal survival ratio (NSR). From each animal, a series of nine sections was used for immunohistochemical detection of glial fibrillary acidic protein (GFAP) expressed by astrocytes. The animals that received either local or subcutaneous Tat-CNTF showed NSR similar to those observed in CNTF groups and higher than the registered in the controls (PBS). Body weight of rats from P2 to P7 treated with a local dose of CNTF or Tat-CNTF was similar to that of the control groups. On the other hand, rats treated with subcutaneous daily doses of CNTF had lower body weight than the observed in the other groups. Animals treated with CNTF had lower weight gain from the second day on. At P7 the body weight of CNTF treated animals was 25% and 30% lower than those receiving Tat-CNTF and PBS, respectively. The animals treated with different subcutaneous doses of Tat-CNTF had similar body growth as the control groups. Moreover, only subcutaneous administration of CNTF led to fat mobilization from the intrascapular brown adipose tissue. Immunostaining for GFAP showed that astrocytic response was less intense after Tat-CNTF administration in comparison with subcutaneous treatment with CNTF. Our results showed that Tat-CNTFis a neuroprotective agent not associated with the side effects attributed to CNTF, even when administered in similar doses. These data support the hypothesis that the addition of PTD to neurotrophic molecules is an efficient neuroprotective strategy and opens up perspectives for using Tat-CNTF in neurodegenerative diseases that affect the spinal motoneurons, such as the amyotrofic lateral sclerosis / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Francesco Langone / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T01:41:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rezende_AlexandreCesarSantosde_D.pdf: 5210413 bytes, checksum: 60e511530e7c408001bf455f9968219f (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O fator neurotrófico ciliar (CNTF) despertou grande interesse com a descoberta do seu efeito neuroprotetor sobre motoneurônios após secção de nervos periféricos em ratos neonatos e camundongos adultos. Contudo, seus efeitos colaterais de perda de peso e caquexia impedem seu uso clínico. Uma via alternativa muito promissora, no sentido de eliminar estes efeitos colaterais, parece ser a administração do CNTF conjugado com peptídeos que possuem domínio de translocação de proteínas (PTD-protein transduction domain). Previamente, mostramos que o CNTF conjugado a um PTD derivado da proteína tat do vírus HIV-1 (TAT-CNTF) também tem efeito protetor sobre motoneurônios e não produziu efeitos colaterais no tratamento, por 5 dias, de ratos neonatos (P2-P7) que sofreram secção do nervo isquiático. O presente trabalho teve como objetivo investigar se a administração da TAT-CNTF por tempos mais prolongados seria capaz de manter a sobrevivência de motoneurônios e neurônios sensoriais, bem como de estimular a regeneração axonal, sem a ocorrência dos efeitos colaterais do CNTF. Desta forma, ratos Wistar neonatos (P2) receberam tratamento subcutâneo com CNTF (1,2mg/g/dia) durante 5 dias, TATCNTF (1,2mg/g/dia) ou PBS durante 5 ou 15 dias. Ao final do período de tratamento os animais foram sacrificados por decapitação, sendo coletado para posterior análise o sangue e gorduras marrom interescapular, branca retroperitonial e branca epididimal. Um outro grupo de animais tive o nervo isquiático esquerdo esmagado em P2 e recebeu o mesmo tratamento. No período entre 20 e 60 dias de vida foi realizada a avaliação da recuperação funcional motora por meio de Walking Track Test, e da recuperação funcional sensitiva através da medida do limiar da resposta de retirada da pata a um estímulo elétrico. No 30º ou 60º dia de vida foi realizada marcação retrógrada de neurônios cujos axônios compõem o nervo isquiático utilizando-se Amina Dextrano Biotinilado (BDA). Após 7 dias, os animais foram sacrificados, sendo coletada a intumescência lombar, os gânglios sensoriais L4 e L5 e o nervo isquiático para análise histológica. As análises dos níveis plasmáticos de glicose, triglicérides e ácidos graxos revelaram que o tratamento com TAT-CNTF ou CNTF por igual período (5 dias) produziu modificações no metabolismo energético em relação aos ratos controle (PBS), contudo diferiram quanto à intensidade dos efeitos produzidos. O tratamento prolongado com TAT-CNTF (15 dias) produziu significantes alterações nas concentrações plasmáticas de triglicérides e de colesterol. Entretanto, o tratamento com TAT-CNTF (5 ou 15 dias) produziu efeitos reduzidos sobre os tecidos adiposos quando comparados ao tratamento com CNTF. Os ratos do grupo TAT-CNTF apresentaram peso corporal significativamente menor que aqueles do grupo PBS a partir do 9º dia de tratamento, porém o grupo CNTF apresentou menor peso a partir do 2º dia. Em ambos tratamentos houve reversão desse efeito sobre o peso corporal, porém esta ocorreu mais precocemente nos ratos do grupo TAT-CNTF (P25) quando comparados ao grupo CNTF (P32). A recuperação funcional motora e sensorial dos grupos CNTF e TAT-CNTF foi 50% superior ao grupo controle. Os grupos CNTF e TAT-CNTF também apresentaram maior número de neurônios sensoriais e motores BDA positivos, além de maior número de axônios mielínicos no nervo isquiático quando comparados ao grupo controle. Nossos resultados mostraram que o tratamento com TAT-CNTF, mesmo por períodos mais longos, promoveu a sobrevivência e regeneração axonal de motoneurônios e neurônios sensitivos sem a ocorrência dos efeitos colaterais produzidos pelo tratamento com CNTF. Além disso, tais propriedades da TAT-CNTF contribuíram significativamente para a recuperação funcional motora e sensorial após lesões nervosas periféricas. / Abstract: Ciliary neurotrophic factor (CNTF) is known as a neuroprotective agent on motoneurons after peripheral nerve section in neonatal rats and adult mice. However, side effects like weight loss and caquexia have limited its clinical use. A promising approach for the avoidance of such side effects is the fusion of a protein transduction domain (PTD) with CNTF. Previously we showed that CNTF fused with HIV-1 PTD (TAT-CNTF) also had protective effect on motoneurons and did not produce side effects in a 5 days treatment of sciatic nerve transected neonatal rats (P2-P7). The aim of the present work was investigate if the TAT-CNTF administration for long time was capable to support the motoneurons and sensory neurons survival, as well as to stimulate the axonal regeneration, without CNTF side effects. Thus, neonatal Wistar rats (P2) were subcutaneously treated with CNTF (1.2mg/g/day) for 5 days, TAT-CNTF (1.2mg/g/day) or PBS during 5 or 15 days. By the end of treatment rats were killed by decaptation and blood, intrascapular brown adipose tissue and retroperitonial and epididimal white adipose tissue were collected for further analysis. Another group of animals had the left sciatic nerve crushed (NCE) in P2 and received the same treatment. From 20 to 60 days of age a Walking Track Test was performed in order to evaluate the motor function recovery, and the threshold for paw withdraw was used as a measure of sensitive functional recovery. The retrograde labeling of sciatic nerve neurons using Biotinilated Dextran Amine (BDA) was performed at 30 or 60 days of age. Rats were killed after 7 days and the lumbar enlargement, L4 and L5 dorsal root ganglia and the sciatic nerve were collected for histological analysis. The analysis glucose, triglycerides and fatty acid plasmatic levels demonstrated that 5 days TAT-CNTF or CNTF treatment induced changes in energy metabolism compared to control rats, however the effects of these treatments had different intensities. The long term treatment with TAT-CNTF (15 days) induced important changes in triglycerides and cholesterol plasmatic levels. However TAT-CNTF treatment (5 or 15 days) had reduced effects on adipose tissue when compared to CNTF. After the 9th day of treatment the TAT-CNTF group had a smaller body weight when compared to the PBS group, on the other hand the CNTF group had a smaller body weight after the 2nd day compared to the PBS group. In both treatments (CNTF and TATCNTF) there was a reversion of the body weight effect, however this was earlier in the TAT-CNTF group (P25) than on the CNTF group (P32). The motor and sensorial functional recovery of CNTF and TAT-CNTF groups was 50% greater than the control group. CNTF and TAT-CNTF groups also displayed a greater number of BDA positive motor and sensory neurons, and more myelinic axons in the sciatic nerve compared to the control group. Our results demonstrate that TAT-CNTF long term treatment was able to promote the survival and axonal regeneration of motor and sensory neurons without important CNTF related side effects. Moreover, TAT-CNTF properties had significant contribution for the motor and sensory functional recovery after peripheral nerve lesion. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural