Orientador: Francesco Langone / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T01:41:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rezende_AlexandreCesarSantosde_D.pdf: 5210413 bytes, checksum: 60e511530e7c408001bf455f9968219f (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O fator neurotrófico ciliar (CNTF) despertou grande interesse com a descoberta do seu efeito neuroprotetor sobre motoneurônios após secção de nervos periféricos em ratos neonatos e camundongos adultos. Contudo, seus efeitos colaterais de perda de peso e caquexia impedem seu uso clínico. Uma via alternativa muito promissora, no sentido de eliminar estes efeitos colaterais, parece ser a administração do CNTF conjugado com peptídeos que possuem domínio de translocação de proteínas (PTD-protein transduction domain). Previamente, mostramos que o CNTF conjugado a um PTD derivado da proteína tat do vírus HIV-1 (TAT-CNTF) também tem efeito protetor sobre motoneurônios e não produziu efeitos colaterais no tratamento, por 5 dias, de ratos neonatos (P2-P7) que sofreram secção do nervo isquiático. O presente trabalho teve como objetivo investigar se a administração da TAT-CNTF por tempos mais prolongados seria capaz de manter a sobrevivência de motoneurônios e neurônios sensoriais, bem como de estimular a regeneração axonal, sem a ocorrência dos efeitos colaterais do CNTF. Desta forma, ratos Wistar neonatos (P2) receberam tratamento subcutâneo com CNTF (1,2mg/g/dia) durante 5 dias, TATCNTF (1,2mg/g/dia) ou PBS durante 5 ou 15 dias. Ao final do período de tratamento os animais foram sacrificados por decapitação, sendo coletado para posterior análise o sangue e gorduras marrom interescapular, branca retroperitonial e branca epididimal. Um outro grupo de animais tive o nervo isquiático esquerdo esmagado em P2 e recebeu o mesmo tratamento. No período entre 20 e 60 dias de vida foi realizada a avaliação da recuperação funcional motora por meio de Walking Track Test, e da recuperação funcional sensitiva através da medida do limiar da resposta de retirada da pata a um estímulo elétrico. No 30º ou 60º dia de vida foi realizada marcação retrógrada de neurônios cujos axônios compõem o nervo isquiático utilizando-se Amina Dextrano Biotinilado (BDA). Após 7 dias, os animais foram sacrificados, sendo coletada a intumescência lombar, os gânglios sensoriais L4 e L5 e o nervo isquiático para análise histológica. As análises dos níveis plasmáticos de glicose, triglicérides e ácidos graxos revelaram que o tratamento com TAT-CNTF ou CNTF por igual período (5 dias) produziu modificações no metabolismo energético em relação aos ratos controle (PBS), contudo diferiram quanto à intensidade dos efeitos produzidos. O tratamento prolongado com TAT-CNTF (15 dias) produziu significantes alterações nas concentrações plasmáticas de triglicérides e de colesterol. Entretanto, o tratamento com TAT-CNTF (5 ou 15 dias) produziu efeitos reduzidos sobre os tecidos adiposos quando comparados ao tratamento com CNTF. Os ratos do grupo TAT-CNTF apresentaram peso corporal significativamente menor que aqueles do grupo PBS a partir do 9º dia de tratamento, porém o grupo CNTF apresentou menor peso a partir do 2º dia. Em ambos tratamentos houve reversão desse efeito sobre o peso corporal, porém esta ocorreu mais precocemente nos ratos do grupo TAT-CNTF (P25) quando comparados ao grupo CNTF (P32). A recuperação funcional motora e sensorial dos grupos CNTF e TAT-CNTF foi 50% superior ao grupo controle. Os grupos CNTF e TAT-CNTF também apresentaram maior número de neurônios sensoriais e motores BDA positivos, além de maior número de axônios mielínicos no nervo isquiático quando comparados ao grupo controle. Nossos resultados mostraram que o tratamento com TAT-CNTF, mesmo por períodos mais longos, promoveu a sobrevivência e regeneração axonal de motoneurônios e neurônios sensitivos sem a ocorrência dos efeitos colaterais produzidos pelo tratamento com CNTF. Além disso, tais propriedades da TAT-CNTF contribuíram significativamente para a recuperação funcional motora e sensorial após lesões nervosas periféricas. / Abstract: Ciliary neurotrophic factor (CNTF) is known as a neuroprotective agent on motoneurons after peripheral nerve section in neonatal rats and adult mice. However, side effects like weight loss and caquexia have limited its clinical use. A promising approach for the avoidance of such side effects is the fusion of a protein transduction domain (PTD) with CNTF. Previously we showed that CNTF fused with HIV-1 PTD (TAT-CNTF) also had protective effect on motoneurons and did not produce side effects in a 5 days treatment of sciatic nerve transected neonatal rats (P2-P7). The aim of the present work was investigate if the TAT-CNTF administration for long time was capable to support the motoneurons and sensory neurons survival, as well as to stimulate the axonal regeneration, without CNTF side effects. Thus, neonatal Wistar rats (P2) were subcutaneously treated with CNTF (1.2mg/g/day) for 5 days, TAT-CNTF (1.2mg/g/day) or PBS during 5 or 15 days. By the end of treatment rats were killed by decaptation and blood, intrascapular brown adipose tissue and retroperitonial and epididimal white adipose tissue were collected for further analysis. Another group of animals had the left sciatic nerve crushed (NCE) in P2 and received the same treatment. From 20 to 60 days of age a Walking Track Test was performed in order to evaluate the motor function recovery, and the threshold for paw withdraw was used as a measure of sensitive functional recovery. The retrograde labeling of sciatic nerve neurons using Biotinilated Dextran Amine (BDA) was performed at 30 or 60 days of age. Rats were killed after 7 days and the lumbar enlargement, L4 and L5 dorsal root ganglia and the sciatic nerve were collected for histological analysis. The analysis glucose, triglycerides and fatty acid plasmatic levels demonstrated that 5 days TAT-CNTF or CNTF treatment induced changes in energy metabolism compared to control rats, however the effects of these treatments had different intensities. The long term treatment with TAT-CNTF (15 days) induced important changes in triglycerides and cholesterol plasmatic levels. However TAT-CNTF treatment (5 or 15 days) had reduced effects on adipose tissue when compared to CNTF. After the 9th day of treatment the TAT-CNTF group had a smaller body weight when compared to the PBS group, on the other hand the CNTF group had a smaller body weight after the 2nd day compared to the PBS group. In both treatments (CNTF and TATCNTF) there was a reversion of the body weight effect, however this was earlier in the TAT-CNTF group (P25) than on the CNTF group (P32). The motor and sensorial functional recovery of CNTF and TAT-CNTF groups was 50% greater than the control group. CNTF and TAT-CNTF groups also displayed a greater number of BDA positive motor and sensory neurons, and more myelinic axons in the sciatic nerve compared to the control group. Our results demonstrate that TAT-CNTF long term treatment was able to promote the survival and axonal regeneration of motor and sensory neurons without important CNTF related side effects. Moreover, TAT-CNTF properties had significant contribution for the motor and sensory functional recovery after peripheral nerve lesion. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T20:59:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zanon_RenataGraciele_D.pdf: 7966608 bytes, checksum: 79a55fb4c6226868859fa3daefc0adb2 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC I) é uma molécula originalmente do Sistema Imunológico. A presença desses elementos no Sistema Nervoso Central (SNC) parece estar relacionada a diferentes funções, apresentando papel importante no refinamento sináptico durante o desenvolvimento do SNC e sendo fundamental no processo de eliminação sináptica após uma lesão nervosa no adulto. No intuito de investigarmos os processos de plasticidade sináptica e reatividade glial no microambiente da medula espinal foram utilizados dois imunomoduladores empregados no tratamento da Esclerose Múltipla, o interferon beta (IFN beta) e o acetato de glatirâmer (AG). O IFN beta, potencialmente capaz de influenciar a expressão de MHC I, foi utilizado in vivo, juntamente com axotomia periférica e in vitro, enquanto o AG foi utilizado para testes in vitro. Para tanto, camundongos C57BL/6J foram tratados com 10.000 UI de IFN beta durante 2 semanas, antes e depois da transecção unilateral do nervo isquiático. Os camundongos foram submetidos à eutanásia e suas medulas espinais lombares processadas para imunohistoquímica (anti-MHC I, sinaptofisina, GFAP - glial fibrillary acidc protein, ezrina e iba1), hibridação in situ (sondas para GFAP e microglobulina beta-2), Western blotting (GFAP e MHC I) e microscopia eletrônica de transmissão. Grupos axotomizados, placebo e não tratado foram utilizados como controles. Adicionalmente ao estudo in vivo, foram estabelecidas culturas purificadas de astrócitos para o tratamento com diferentes doses de IFN beta (0, 100, 500 ou 1000 UI/ml) ou AG (0, 1.2, 2.5 ou 5.0µg/ml) durante 5 dias. As culturas tratadas com IFN beta foram submetidas à imunohistoquímica para MHC I, ezrina, GFAP, enquanto nas culturas tratadas com AG foi realizado o estudo para verificar a reatividade e proliferação através da marcação anti-GFAP e DAPI (para identificação dos núcleos das células). In vivo, os resultados mostraram um aumento do RNAm e da expressão protéica para MHC I após axotomia, sendo que este incremento foi maior no grupo tratado com INF. Observou-se a intensificação da expressão das proteínas que expressam a reatividade astrocitária, GFAP e ezrina, concomitantemente à diminuição da imunomarcação para sinaptofisina, especialmente no grupo tratado. O tratamento realizado não influenciou a reatividade da microglia. A análise do material in vitro também mostrou, após o tratamento com IFN beta, um aumento da expressão de MHC I e GFAP, bem como de ezrina. As doses que mais estimularam a elevação da expressão dos marcadores estudados foram as de 500 e 1000 UI/ml. Dado que não ocorreu para o tratamento com o acetato de glatirâmer. Assim, o tratamento com AG não alterou o nível de reatividade astrocitária, apesar de estimular a proliferação celular. A ultraestrutura das sinapses mostrou uma intensa retração dos terminais pré-sinápticos em contato com os motoneurônios alfa, induzida pela axotomia mais o tratamento com IFN beta. Em conjunto, esses resultados reforçam a importância da expressão de moléculas de MHC I em resposta à lesão nervosa e seu papel como mecanismo de comunicação entre neurônio e glia, além de reafirmar que os astrócitos são elementos ativos no processo de plasticidade sináptica. / Abstract: The class I main histocompatibility complex (MHC I) is a molecule originally restricted to Immune System. The presence of such element in the Central Nervous System (CNS) may indicate other functions, including an important role in the synaptic refinement during the development of the CNS as well as in the synaptic elimination process after a peripheral nerve injury in the adult. To investigate the synaptic plasticity and glial reactivity in the spinal cord, two immunomodulators, widely used for treating Multiple Sclerosis, were applied, namely the Interferon beta (IFN beta) and the glatiramer acetate (GA). The IFN beta was used in order to upregulate the MHC I expression in vivo, after a peripheral axotomy, and also in vitro. GA treatment was only used for in vitro experiments. C57BL/6J mice were injected with 10,000 IU of IFN beta for 2 weeks, before and after the nerve transection. The animals were sacrificed and the lumbar spinal cords were processed for immunohistochemistry (MHC I, synapthophysin, GFAP, ezrin and Iba-1 antisera), in situ hybridization (beta 2 immunoglobulin, a component of the MHC I molecule, and GFAP), Western blotting (GFAP and MHC I) and transmission electron microscopy. Placebo and non-treated axotomized groups were used as controls. Additionally to the in vivo study, primary cultures of astrocytes were established and treated during five consecutive days with different doses of IFN beta (0, 100 IU, 500 IU and 1000 IU/ml). In this case, some cultures were treated with GA (0, 1.2, 2,5 and 5.0 µg/ml). INF treated cultures were processed for immunocitochemistry (MHC I, GFAP and ezrin antisera). GA treated cultures were evaluated with anti-GFAP antibody and cell proliferation was accessed with DAPI staining. In vivo, the results showed an upregulation of MHC I mRNA and protein expression after axotomy, that was stronger in the IFN treated group. We observed a greater GFAP and ezrin expression, coupled with a decrease of synapthophysin immunoreactivity. Such alterations were more evident in the IFN treated group. Interestingly, the IFN beta treatment did not interfere in the microglial reactivity. The in vitro analysis also showed a sharp upregulation of MHC I, GFAP and ezrin, mostly when the cultures were subjected to 500 and 1000 IU/ml of IFN beta. Regarding the GA treatment, the results showed that treatment did not change the level of astroglial reactivity despite stimulating cellular proliferation. The ultrastructural analysis of synapses showed a larger pruning of presynaptic terminals in contact with alpha motoneurons, induced by axotomy plus IFN beta treatment. Together, our results reinforce the importance of the MHC I expression as a response to nerve injury and its role as a communication mechanism between neurons and surrounding glial cells. Furthermore, the present data confirm that astrocytes are active elements during the synaptic plasticity process. / Doutorado / Anatomia / Biologia Celular e Estrutural