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Das Feline Coronavirus (FCoV) ist in den Katzenpopulationen der ganzen Welt weit verbreitet. Das Problem dieses Virus ist seine große Wahrscheinlichkeit zu mutieren. Einige dieser Mutationen können zu einer veränderten Pathogenität und zu einem schweren Verlauf der Infektion führen. So bleibt es möglicherweise nicht wie bei den meisten der infizierten Tiere bei einem inapparenten Verlauf oder milden Durchfall, sondern es kommt zur Entwicklung einer häufig tödlich endenden systemischen Erkrankung, der Felinen Infektiösen Peritonitis (FIP). Um dies zu verhindern ist es essentiell, Virusausscheider schnell zu identifizieren und zu eliminieren, um den Virusdruck in Katzenpopulationen so gering wie möglich zu halten. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für den Nachweis von FCoV in Kot ist der Goldstandard, aber ist zeitaufwendig und erfordert ein gut ausgestattetes Labor. Als isothermale Methode liefert die Reverse Transkription Rekombinase Polymerase Amplifikation (RT-RPA) eine schnelle und kostengünstige Alternative für den molekularen Nachweis von FCoV. Ziel dieser Studie war es, einen Schnelltest zum Nachweis von FCoV zu entwickeln, der auf der RT-RPA basiert. Drei Vorwärts- und drei Rückwärtsprimer sowie eine Sonde wurden erstellt. Als Zielsequenz wurde die hochkonservierte, nicht-translatierte Region des 7b Gens gewählt. Alle möglichen Kombinationen dieser Primer wurden getestet und das Paar mit der höchsten Sensitivität für die weitere Validierung ausgewählt. Bei einer konstanten Temperatur von 42 °C wurde die reverse Transkription mit anschließender DNA-Amplifikation und Detektion innerhalb von 15 Minuten durchgeführt. Die analytische Sensitivität wurde anhand von neun Wiederholungen mit der Verdünnungsreihe des molekularen Standards (10^3-10^0RNA Kopien/µL) ermittelt und die Nachweisgrenze mittels Probit-Analyse berechnet. Für die Untersuchung auf Kreuzreaktionen wurde DNA oder RNA von 19 Viren getestet. Die Leistung der RT-RPA unter Verwendung klinischer Proben wurde mit extrahierter RNA von 39 felinen Kotproben analysiert. Alle Ergebnisse wurden denen der real-time RT-PCR gegenübergestellt. Die UTR des 7b Gens ausgewählter Proben, einschließlich einer falsch negativ getesteten Probe, wurde sequenziert und mittels Geneious Prime analysiert. Die Probit-Analyse ergab eine Nachweisgrenze von 58,5 RNA-Kopien/Reaktion. Die RT-RPA amplifizierte keine Nukleinsäuren der 17 getesteten anderen Pathogenen, zeigte jedoch eine Kreuzreaktion mit dem Caninen Coronavirus und dem Transmissiblen Gastroenterits-Virus. Der Vergleich der Resultate der real-time RT-PCR mit den 39 extrahierten Kotproben und den Ergebnissen der RT-RPA ergab eine Sensitivität von 90,9% und eine Spezifität von 100%. Bei der Sequenzierung wurde keine Sequenzänderung in der Region von Primern und Sonde festgestellt. Die RT-RPA hat sich als schnelle und effektive Maßnahme für den Nachweis von FCoV in extrahierten Kotproben herausgestellt. Die einfache Handhabung der RPA macht wiederholtes Testen möglich, um auch die intermittierenden Ausscheider zu erkennen. Die Anwendung des Schnelltests könnte so zu einer Reduktion von FCoV innerhalb der Katzenpopulationen beitragen.:Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 2. Literaturübersicht 3 2.1 Felines Coronavirus 3 2.1.1 Virus Klassifikation 3 2.1.2 Struktur und Genom 4 2.1.3 Virusevolution 6 2.2 Epidemiologie und Krankheitsverlauf 8 2.2.1 Übertragung und Umweltstabilität 8 2.2.2 Krankheitsverlauf 9 2.2.3 Prävalenz 12 2.2.4 Prävention 13 2.2.5 Behandlung 13 2.2.6 Impfung 14 2.3 Diagnostik 15 2.3.1 Indirekter Erregernachweis 15 2.3.2 Direkter Erregernachweis 17 3. Publikation 27 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil der Publikation 27 3.2 Publikation 27 4. Diskussion und Schlussfolgerung 40 5. Zusammenfassung 47 6. Summary 49 7. Literaturverzeichnis 51 8. Abbildungsverzeichnis 64 9. Tabellenverzeichnis 64 10. Anhang 65 11. Danksagung 72

Desinfektionsmittel sind ein elementarer Bestandteil der Tierseuchenbekämpfung und damit auch der Lebensmittelsicherheit. Die Prüfung chemischer Desinfektionsmittel ist Voraussetzung für deren zuverlässige Wirksamkeit und zielgerichteten Einsatz. In Deutschland geschieht dies nach den Richtlinien der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V. (DVG). Seit der ersten Fassung sind die Richtlinien einem ständigen Anpassungsprozess unterworfen. Im Zuge der europäischen Harmonisierung gilt es nun, sich gesamteuropäischen Richtlinien, verfasst durch das europäische Komitee für Normung (Comité Européen de Normalisation) (CEN) anzupassen. Das Thema dieser Arbeit entwickelte sich im Kontext der derzeitigen Diskussion über Verbesserungsvorschläge zu den bestehenden Richtlinien und deren Anpassung an die europäischen Normen. Es wurden je zwei Testviren für die Bereiche Tierhaltung und tierärztliche Praxis ausgewählt, um sie auf Eignung für die Viruzidieprüfung zu testen und gegebenenfalls zu etablieren. Des Weiteren wurde in einem zweiten Teil, in Anlehnung an die Forderungen der europäischen Normen die Prüfung zu vereinfachen, ein alternatives Zellkulturnachweissystem für das Newcastle-Disease-Virus (NDV) geprüft. Die Prüfung der viruziden Wirksamkeit erfolgte mit fünf verschiedenen Grundsubstanzen, gewählt um ein möglichst breites Spektrum an Desinfektionsmittelwirkstoffen abzudecken. Es wurden Glutaraldehyd, Ethanol, Natronlauge, Natriumhypochlorit und Peressigsäure verwendet. Die Versuche wurden mit einer niedrigen Eiweißbelastung und bei einer Temperatur von 20°C durchgeführt. Um eine praxisnahe Situation zu simulieren wurde auf, bereits in den DVG-Richtlinien, verankerten Stahl- und Holzkeimträgertests zurückgegriffen. Als mögliche Prüfviren für die Tierhaltung wurden das Equine Arteritis-Virus (EAV) und das Bovine Virus Diarrhoe Virus verwendet. Bei beiden Viren handelt es sich um weit verbreitete Tierseuchenerreger mit einer großen epidemiologischen Bedeutung. Die Untersuchung von fünf verschiedenen Desinfektionsmitteln erfolgte im Keimträgertest auf Holz. Sowohl EAV als auch BVD stellen ein weniger geeignetes Prüfvirus dar, da beide Viren enorme Titerverluste im Trocknungsvorgang der Holzkeimträger zeigten. Die Viren ließen sich zwar leicht vermehren, aber die erzielten Ausgangstiter reichten nicht aus um die Trocknungsverluste zu kompensieren und aussagekräftige Ergebnisse zu produzieren. Für den Bereich tierärztliche Praxis wurden das Feline Coronavirus (FCoV) und das Murine Parvovirus (MPV) genutzt. FCoV ist ein weltweit in Hauskatzenpopulationen vorkommendes Virus mit einer hohen Seroprävalenz und wurde daher ausgewählt. MPV wurde als Stellvertreter für die, in der Praxis häufig vorkommenden Parvovirusinfektionen gewählt. Es schien ein ideales Modellvirus aufgrund seiner weiten Verbreitung in der Forschung zu sein. Bei beiden Viren erfolgte die Prüfung auf Stahlkeimträgern. Unter Laborbedingungen konnte FCoV ohne Probleme zu hohen Titern vermehrt werden. Es gab keine nennenswerten Trocknungsverluste. FCoV erwies sich als geeignetes Prüfvirus. MPV hingegen ist bedingt durch die langen Versuchszeiten und schwierig auszuwertenden Zellkulturen, sowie wegen der niedrigen Ausgangstiter weniger geeignet als Modellvirus für die Desinfektionsmittelprüfung. Die Anzucht von NDV in Allantoisflüssigkeit von SPF Hühnereiern erschien sehr aufwendig und mit hohem Eiweißfehler belastet. In den Versuchen konnte ein deutlich höherer Eiweißgehalt als in den vergleichend geprüften, in Zellkultur angezogenen Viren nachgewiesen werden. Infolge der Probleme mit der Kultivierung der LMH-Zelllinie und den damit verbundenen langen Wartezeiten bis zur eigentlichen Versuchsdurchführung kann nur eine teilweise Empfehlung, von auf Zellkultur vermehrtem NDV (NDV (ZK)) gegeben werden. Nach Behebung dieser Probleme ist durchaus eine Ablösung, von in Allantoisflüssigkeit angezüchtetem NDV durch NDV (ZK) zu empfehlen. Die Verfälschung der Ergebnisse durch die höheren Eiweißgehalte bei Desinfektionsmitteln mit deutlichem Eiweißfehler könnten so vermieden werden.

Desinfektionsmittel sind ein elementarer Bestandteil der Tierseuchenbekämpfung und damit auch der Lebensmittelsicherheit. Die Prüfung chemischer Desinfektionsmittel ist Voraussetzung für deren zuverlässige Wirksamkeit und zielgerichteten Einsatz. In Deutschland geschieht dies nach den Richtlinien der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V. (DVG). Seit der ersten Fassung sind die Richtlinien einem ständigen Anpassungsprozess unterworfen. Im Zuge der europäischen Harmonisierung gilt es nun, sich gesamteuropäischen Richtlinien, verfasst durch das europäische Komitee für Normung (Comité Européen de Normalisation) (CEN) anzupassen. Das Thema dieser Arbeit entwickelte sich im Kontext der derzeitigen Diskussion über Verbesserungsvorschläge zu den bestehenden Richtlinien und deren Anpassung an die europäischen Normen. Es wurden je zwei Testviren für die Bereiche Tierhaltung und tierärztliche Praxis ausgewählt, um sie auf Eignung für die Viruzidieprüfung zu testen und gegebenenfalls zu etablieren. Des Weiteren wurde in einem zweiten Teil, in Anlehnung an die Forderungen der europäischen Normen die Prüfung zu vereinfachen, ein alternatives Zellkulturnachweissystem für das Newcastle-Disease-Virus (NDV) geprüft. Die Prüfung der viruziden Wirksamkeit erfolgte mit fünf verschiedenen Grundsubstanzen, gewählt um ein möglichst breites Spektrum an Desinfektionsmittelwirkstoffen abzudecken. Es wurden Glutaraldehyd, Ethanol, Natronlauge, Natriumhypochlorit und Peressigsäure verwendet. Die Versuche wurden mit einer niedrigen Eiweißbelastung und bei einer Temperatur von 20°C durchgeführt. Um eine praxisnahe Situation zu simulieren wurde auf, bereits in den DVG-Richtlinien, verankerten Stahl- und Holzkeimträgertests zurückgegriffen. Als mögliche Prüfviren für die Tierhaltung wurden das Equine Arteritis-Virus (EAV) und das Bovine Virus Diarrhoe Virus verwendet. Bei beiden Viren handelt es sich um weit verbreitete Tierseuchenerreger mit einer großen epidemiologischen Bedeutung. Die Untersuchung von fünf verschiedenen Desinfektionsmitteln erfolgte im Keimträgertest auf Holz. Sowohl EAV als auch BVD stellen ein weniger geeignetes Prüfvirus dar, da beide Viren enorme Titerverluste im Trocknungsvorgang der Holzkeimträger zeigten. Die Viren ließen sich zwar leicht vermehren, aber die erzielten Ausgangstiter reichten nicht aus um die Trocknungsverluste zu kompensieren und aussagekräftige Ergebnisse zu produzieren. Für den Bereich tierärztliche Praxis wurden das Feline Coronavirus (FCoV) und das Murine Parvovirus (MPV) genutzt. FCoV ist ein weltweit in Hauskatzenpopulationen vorkommendes Virus mit einer hohen Seroprävalenz und wurde daher ausgewählt. MPV wurde als Stellvertreter für die, in der Praxis häufig vorkommenden Parvovirusinfektionen gewählt. Es schien ein ideales Modellvirus aufgrund seiner weiten Verbreitung in der Forschung zu sein. Bei beiden Viren erfolgte die Prüfung auf Stahlkeimträgern. Unter Laborbedingungen konnte FCoV ohne Probleme zu hohen Titern vermehrt werden. Es gab keine nennenswerten Trocknungsverluste. FCoV erwies sich als geeignetes Prüfvirus. MPV hingegen ist bedingt durch die langen Versuchszeiten und schwierig auszuwertenden Zellkulturen, sowie wegen der niedrigen Ausgangstiter weniger geeignet als Modellvirus für die Desinfektionsmittelprüfung. Die Anzucht von NDV in Allantoisflüssigkeit von SPF Hühnereiern erschien sehr aufwendig und mit hohem Eiweißfehler belastet. In den Versuchen konnte ein deutlich höherer Eiweißgehalt als in den vergleichend geprüften, in Zellkultur angezogenen Viren nachgewiesen werden. Infolge der Probleme mit der Kultivierung der LMH-Zelllinie und den damit verbundenen langen Wartezeiten bis zur eigentlichen Versuchsdurchführung kann nur eine teilweise Empfehlung, von auf Zellkultur vermehrtem NDV (NDV (ZK)) gegeben werden. Nach Behebung dieser Probleme ist durchaus eine Ablösung, von in Allantoisflüssigkeit angezüchtetem NDV durch NDV (ZK) zu empfehlen. Die Verfälschung der Ergebnisse durch die höheren Eiweißgehalte bei Desinfektionsmitteln mit deutlichem Eiweißfehler könnten so vermieden werden.