Le phosphate (Pi) est vital pour de nombreux processus physiologiques. Un déficit prolongé en Pi provoque une hypophosphatémie conduisant à une déminéralisation osseuse, alors qu'une hyperphosphatémie entraîne des calcifications vasculaires morbides. Un contrôle adéquat de la concentration sérique de Pi est ainsi essentiel à la qualité et l'espérance de vie. La première étape de ce contrôle est la capacité de la cellule ou de l'organisme à détecter les changements des concentrations extracellulaires de Pi. Contrairement aux levures et aux bactéries, chez lesquelles les transporteurs de Pi membranaires jouent un rôle clé dans cette détection, le mécanisme reste inconnu chez les mammifères. Dans ce travail, nous avons émis l’hypothèse que les cotransporteurs Na-Pi de haute affinité, PiT1/Slc20a1 et PiT2/Slc20a2, étaient impliqués dans ce mécanisme. Dans un premier temps, nous avons montré que la délétion de PiT1 ou de PiT2 dans des ostéoblastes et des chondrocytes in vitro empêchait l’activation de la voie MAPK/ERK1-2 par le Pi. En utilisant une approche de BRET, nous avons ensuite montré que PiT1 et PiT2 pouvaient former des hétéro-dimères modulés par les variations de Pi extracellulaire, sans lien avec le transport de Pi au travers de la membrane. En utilisant des souris invalidées pour le gène PiT2, nous avons montré que PiT2 était indispensable à la régulation par le Pi de la sécrétion de FGF23, l’hormone principalement responsable du maintien de l’homéostasie du Pi. En conclusion, nos données représentent un argument fort en faveur d’un rôle clé des protéines PiTs dans la détection du Pi chez les mammifères, indépendamment de leur fonction de transport. / Phosphate (Pi) is a vital ion involved in numerous biological processes. Prolonged deficiency of Pi results in hypophosphatemia leading to serious consequences, including impaired bone mineralization. On the other hand, hyperphosphatemia can lead to life-threatening situations such as vascular calcifications. Controlling serum Pi concentration is therefore critical to life quality and expectancy. The first necessary step of this control is the ability to detect changes in extracellular Pi levels, which implies the existence of a Pi-sensing mechanism that would inform the body or the individual cell. Contrary to yeasts and bacteria for which Pi membrane transporters play a key role in Pi signaling, the underlying mechanism in mammals remains unknown. In this work, we hypothesized that the high affinity Na-Pi cotransporters PiT1/Slc20a1 and PiT2/Slc20a2 could be involved in Pi-sensing in mammals. As a first step, we showed in vitro that deleting either PiT1 or PiT2 blunted the Pi-dependent activation of MAPK/ERK1-2 both in osteoblasts and chondrocytes. This suggested that both PiTs were necessary to Pi signaling. Using a BRET approach, we then demonstrated that PiT1 and PiT2 could form a hetero-dimeric complex that was modulated by variations of extracellular Pi, but not by Pi transport across the membrane. Using PiT2 knockout mice, we showed that PiT2 was also necessary for the Pi-dependent regulation of FGF23 secretion, the main hormone responsible for Pi homeostasis. Taken together, our data propose that the PiT proteins could play a pivotal role in the Pi-sensing mechanism in mammals, which may be uncoupled from their Pi transport function.

Background: Fibroblast growth factor 23 (FGF23) is the earliest marker of disturbed mineral metabolism as renal function decreases. Its serum levels are associated with mortality in dialysis patients, persons with chronic kidney disease (CKD) and prevalent cardiovascular disease (CVD), and it is associated with atherosclerosis, endothelial dysfunction and left ventricular hypertrophy in the general population. The primary aim of this study is to examine the association between FGF23 and mortality, in relation to renal function in the community. A secondary aim is to examine the association between FGF23 and CVD related death. Methods: The population-based cohort of MrOS Sweden included 3014 men (age 69-81 years). At inclusion intact FGF23, intact parathyroid hormone (PTH), 25 hydroxyl vitamin D (25D), calcium and phosphate were measured. Mortality data were collected after an average of 4.5 years follow-up. 352 deaths occurred, 132 of CVD. Association between FGF23 and mortality was analyzed in quartiles of FGF23. Kaplan-Meier curves and Log-rank test were used to examine time to events. Cox proportional hazards regression was used to examine the association between FGF23, in quartiles and as a continuous variable, with mortality. The associations were also analyzed in the sub-cohort with estimated glomerular filtration rate (eGFR) above 60 ml/min/1.73 m(2). Results: There was no association between FGF23 and all-cause mortality, Hazard ratio (HR) 95% confidence interval (CI): 1.02 (0.89-1.17). For CVD death the HR (95% CI) was 1.26 (0.99 - 1.59)/(1-SD) increase in log(10) FGF23 after adjustment for eGFR, and other confounders. In the sub-cohort with eGFR > 60 ml/min/1.73 m(2) the HR (95% CI) for CVD death was 55% (13-111)/(1-SD) increase in log(10) FGF23. Conclusions: FGF23 is not associated with mortality of all-cause in elderly community living men, but there is a weak association with CVD death, even after adjustment for eGFR and the other confounders. The association with CVD death is noticeable only in the sub-cohort with preserved renal function.

Disturbances in mineral metabolism contribute to vascular calcification and mortality risk in chronic kidney disease (CKD). Serum levels of fibroblast growth factor (FGF)23, a bone derived, phosphaturic peptide, are associated with cardiovascular mortality in CKD. Membrane bound klotho(KL) is an obligate co receptor for FGF23 signaling in the kidney. To study aspects of FGF23 in mild to moderate impairment of renal function we have analyzed FGF23, estimated glomerular filtration rate (eGFR), parathyroid hormone(PTH), 1,25 (OH)2 vitamin D (1,25D), calcium and phosphate in one patient with a FGF23 producing tumor, before and after tumor removal (study 1), in 72 CKD patients with varying degree of renal dysfunction (study 2), in 9 healthy kidney donors, before and after nephrectomy (study 3). We also analyzed FGF23 (study 4), and performed genotyping of 27 single nucleotide polymorphisms (SNP) of the KL gene (study 5) in 2838 elderly Swedish men (MrOs study) and examined the association with mortality. FGF23 normalizes in 30-45 minutes after removal of a FGF23 producing tumor (study 1). 1,25D increases in hours and remains elevated months, even when the other parameters have normalized. FGF23 increase early in CKD, initially slowly, in correlation with PTH, but exponentially when hyperphosphatemia ensues (study 2). After unilateral nephrectomy (study 3) mineral homeostasis remain stable, initially due to a rise in PTH and later to an increase in FGF23. FGF23 levels are not correlated with mortality in elderly men after adjustment for eGFR, but with mortality due to cardiovascular disease, even in persons with normal eGFR (study 4). Polymorphism of the KL gene do not correlate with increased mortality risk in elderly men (study 5), but there is a modulating effect on FGF23 levels. FGF23 is of importance in maintaining phosphate homeostasis as renal function declines. It is co regulated with PTH until advanced renal dysfunction, and adjust the 1,25D to the actual GFR. FGF23 is associated with cardiovascular mortality. Further studies are needed to determine the mechanism, and if reduction of FGF23 by reducing phosphate intake may be beneficial even in persons with mild to moderate renal function.

Τα επίπεδα φωσφόρου αλλάζουν με την ηλικία. Ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών 23 (FGF23) είναι μία φωσφατουρική ορμόνη που παίζει σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση φωσφόρου. Η πρωτεΐνη Klotho είναι ο συμπαράγοντας του FGF23 που μεσολαβεί τη σύνδεση του FGF23 στον υποδοχέα του. Στη βιβλιογραφία για τα υγιή παιδιά υπάρχουν λίγα δεδομένα για τον FGF23 και ακόμη λιγότερα για το Klotho. Σκοπός μελέτης: Nα διερευνήσουμε την ύπαρξη πιθανής συσχέτισης μεταξύ των κυκλοφορούντων επιπέδων FGF23 και Klotho με την ηλικία και το ρυθμό μέγιστης σωληναριακής επαναρρόφησης φωσφόρου (TmP/GFR) και να μελετήσουμε τις παραμέτρους που τυχόν επηρεάζουν τα επίπεδα FGF23 και Klotho. Μέθοδοι: Σε 159 υγιή παιδιά (82 αγόρια) με μέση ± SD ηλικία 8.78 ± 3.47 έτη μετρήθηκε ο FGF23 (τόσο ο iFGF23 όσο και ο cFGF23) και το κυκλοφορούν Klotho (sKlotho) με τεχνικές ELISA. Υπολογίσαμε επίσης τα επίπεδα του TmP/GFR. Αποτελέσματα: Η μέση τιμή ± SD του cFGF23 ήταν 51.14 ± 12.79 RU/ml ενώ η διάμεσος (εύρος) του iFGF23 και του Klotho ήταν 35 (8.8, 120) pg/ml and 1945 (372, 5866) pg/ml αντιστοίχως. Ούτε ο FGF23 αλλά ούτε και το Klotho δε σχετίζονταν με την ηλικία. Τα παιδιά που είχαν μπει στην εφηβεία είχαν υψηλότερα επίπεδα Klotho (p < 0.05). Τα κορίτσια είχαν υψηλότερα επίπεδα cFGF23 (p < 0.05) και Klotho (p < 0.001). Τα επίπεδα του κυκλοφορούντος φωσφόρου και TmP/GFR ήταν θετικώς συσχετιζόμενα με τον cFGF23 (p < 0.01 και p < 0.001), iFGF23 (p < 0.05 και p < 0.001) και Klotho (p < 0.05 και p < 0.01). Το Klotho ήταν θετικώς συσχετιζόμενο με τον IGF-I (p < 0.0001) και 1,25 (OH)2 βιταμίνη D (p < 0.05). Συμπεράσματα: Στην παρούσα μελέτη παρουσιάζουμε δεδομένα για τα επίπεδα cFGF23, iFGF23, και Klotho που μετρήθηκαν ταυτόχρονα σε υγιή παιδιά. Η θετική συσχέτιση μεταξύ κυκλοφορούντος φωσφόρου και TmP/GFR με τον FGF23 και το Klotho υποδηλώνει ότι έχουν έναν αντισταθμιστικό ρόλο στην ομοιόσταση φωσφόρου. Η ισχυρή συσχέτιση μεταξύ Klotho και IGF-I μπορεί να σημαίνει ότι το Klotho έχει κάποιο ρόλο στην κατά μήκος ανάπτυξη κατά την παιδική ηλικία μέσω ρύθμισης της ομοιόστασης του φωσφόρου αλλά περισσότερες μελέτες χρειάζονται για να διευκρινιστεί αυτό περαιτέρω. / Phosphate serum levels in children vary with age. Fibroblast Growth Factor 23 (FGF23) is a phosphaturic hormone that plays an important role in phosphate homeostasis. Klotho is the essential co-player of FGF23 that mediates the binding of FGF23 to its receptor. Data for fibroblast growth factor 23 (FGF23) and particularly for Klotho in healthy children are limited. Objective and hypotheses: We aimed to investigate the relationship between FGF23 and Klotho serum levels with age and TmP/GFR and to evaluate parameters that might affect FGF23 and Klotho. Methods: In 159 healthy children (82 boys) with a mean ± SD age of 8.78 ± 3.47 years we measured FGF23 (intact FGF23/ iFGF23 and C-terminal FGF23/ cFGF23) and soluble Klotho (sKlotho) serum levels by ELISA. We also determined the TmP/GFR. Results: Mean ± SD value for cFGF23 was 51.14 ±12.79 RU/ml whereas median (range) values for iFGF23 and Klotho were 35 (8.8, 120) pg/ml and 1945 (372, 5866) pg/ml respectively. Neither FGF23 nor Klotho were significantly associated with age. Pubertal children had higher Klotho (p < 0.05). Girls had higher levels of cFGF23 (p < 0.05) and Klotho (p < 0.001). Serum phosphate and TmP/GFR were positively associated with cFGF23 (p < 0.01 and p < 0.001), iFGF23 (p < 0.05 and p < 0.001) and sKlotho (p < 0.05 and p < 0.01). Klotho was positively correlated with IGF-I (p < 0.0001) and 1,25 (OH)2 vitamin D (p < 0.05). Conclusions: We provide data on FGF23, and Klotho measured simultaneously in healthy children. The positive association of serum phosphate and TmP/GFR with FGF23 and Klotho suggests that they have a counterregulatory effect on phosphate homeostasis. The strong association of Klotho with IGF-I could indicate a role of Klotho in linear growth through regulation of phosphate homeostasis, but further studies are required.

PHEX est une protéine importante dans le processus de minéralisation osseuse. Des mutations ou la délétion d’une partie de ce gène causent l’hypophosphatémie liée au chromosome X (XLH). Cette maladie est caractérisée par une hypophosphatémie, accompagnée de défauts de minéralisation, de rachitisme et de lésions ostéomalaciques. Avec l’hypophosphatémie, les taux circulants de vitamine D devraient être augmentés, ce qui n’est pas le cas d’où une régulation anormale de la production de vitamine D a lieu. Cependant, malgré le fait que cette protéine soit une peptidase, aucun substrat physiologique n’a encore été répertorié pour PHEX. PHEX est une protéine membranaire de type II de la famille M13 des métalloendopeptidases à zinc possédant un court domaine N-terminal cytosolique, un segment transmembrannaire d’environ 20 acides aminés et une large portion C-terminale extracellulaire où se trouve le site actif de l’enzyme. PHEX est exprimée de façon majoritaire dans les os et dans les dents et elle apparaît à l’initiation de la minéralisation. Les patients souffrant de XLH et la souris Hyp, qui est un modèle animal de la maladie humaine, montrent des quantités importantes de la protéine FGF23. De plus, FGF23 est impliqué dans une autre maladie reliée au métabolisme du phosphate, l’hypophosphatémie rachitique autosomale dominante (ADHR) où des mutations de FGF23 causent sensiblement les mêmes symptômes que XLH. FGF23 est produit principalement par les ostéoblastes et les ostéocytes. FGF23 cause une hypophosphatémie par la diminution de l’expression du cotransporteur NaPi de type II, responsable de la réabsorption du phosphate rénal. L’hypothèse proposée dans la littérature serait que PHEX activerait ou inactiverait des peptides importants pour la minéralisation osseuse. Plus spécifiquement, l’activation ou l’inactivation de ces peptides aurait pour rôle de réguler les quantités de FGF23. Selon l’hypothèse mentionnée précédemment, la régulation de PHEX pourrait donc avoir un effet sur la minéralisation. Une quantité croissante de données sur la régulation de PHEX sont maintenant disponibles. Par exemple, la vitamine D diminue l’expression de PHEX tandis que les glucocorticoïdes et l’hormone de croissance augmentent son expression. Dans une première étude, nous avons voulu déterminer si un peptide relié à la minéralisation osseuse, le PTHrP1-34, pouvait réguler l’expression de PHEX. Nous avons déterminé que le PTHrP1-34 peut réguler de façon négative l’expression de PHEX dans les cellules UMR-106, une lignée cellulaire ostéoblastique. Cette régulation passe par la voie de l’AMPc/protéine kinase A. De plus, cette diminution d’expression est également observée au jour 7 dans des cultures primaires d’ostéoblastes de rat en minéralisation. Par la suite, nous avons étudié un mutant de PHEX, le mutant E4Q retrouvé chez un patient souffrant de XLH, où la mutation se retrouve dans le domaine cytosolique de PHEX. Cette mutation n’interfère pas avec le site catalytique de l’enzyme puisque ce mutant de PHEX peut tout aussi bien cliver un substrat synthétique que la protéine sauvage. Il a été déterminé que cette mutation annule un motif di-acide. Nous avons démontré que ce motif di-acide est responsable de la liaison de PHEX à COPII, responsable de la formation de vésicules de sécrétion. De plus, il semblerait que ce motif soit important, probablement par son interaction avec COPII, à l’incorporation de PHEX dans des vésicules de calcification, lesdites vésicules étant importantes dans le processus de minéralisation. Finalement, des essais de compétitions ont démontré que la minéralisation pouvait être perturbée lorsque l’on surexprimait la queue cytosolique sauvage de PHEX, contrairement à la queue mutée. Ceci suggère possiblement que l’interaction avec COPII menant à l’incorporation de PHEX dans les vésicules de calcification ou d’autres protéines comprenant de tels motifs pourrait être importante pour la minéralisation. Finalement, la dernière étude porte sur la protéine FGF23. Nous avons démontré, par la surexpression de FGF23 dans la lignée MC3T3 d’ostéoblastes de souris, que cette surexpression a un effet sur la sénescence de ces cellules. En effet, des essais de sénescence ont montré l’augmentation de celle-ci lorsque FGF23 est surexprimé. Par contre, la prolifération n’est pas altérée. De plus, il semblerait que la différenciation soit plus rapide, tel qu’observé par une minéralisation survenant plus tôt, mais n’étant pas plus importante. Bref, la surexpression de FGF23 semblerait faire en sorte que les ostéoblastes se différencient plus rapidement et passent donc à un état de sénescence prématuré comparativement aux cellules sauvages. Ceci est en accord avec la littérature où KLOTHO, un cofacteur de FGF23 permettant sa liaison avec une plus grande affinité sur son récepteur, lorsqu’inactivé démontre un phénotype similaire au vieillissement incluant un phénotype de sénescence. / PHEX is an important protein in the process of osseous mineralisation. Mutations or deletions of a part of the PHEX gene cause X-linked hypophosphatemia (XLH). This disease is characterized by hypophosphatemia, accompanied by defects of bone mineralisation, rickets and osteomalacia. With the hypophosphatemia, the circulating levels of vitamin D should be increased, which is not the case where an abnormal regulation of the production of vitamin D takes place. However, in spite of the fact that this protein is a peptidase, no physiological substrate has been identified. PHEX is a membrane type II integral protein member of the M13 family of zinc metalloendopeptidasee. These proteins have a short N-terminal cytosolic domain, a transmembrane domain of approximately 20 amino acids and a large extracellular C-terminal portion where the active site of the enzyme is located. PHEX is expressed predominantly in bones and teeth in osteoblasts and odontoblasts, respectively. PHEX is expressed at initiation of mineralization. Patients suffering from XLH and the Hyp mouse, which has been used widely as an animal model of the human disease, show large quantities of the FGF23 protein. Moreover, FGF23 is implicated in another disease connected to phosphate metabolism, the autosomal dominant hypophosphatemic rickets (ADHR) where activating mutations in FGF23 cause roughly the same symptoms as XLH. FGF23 is produced mainly by osteoblasts and osteocytes. FGF23 causes hypophosphatemia by decreasing the expression of the type II sodium phosphate cotransportor, partly responsible for renal phosphate reabsorption. The hypothesis suggested in the literature would be that PHEX would activate or inactivate important peptides for osseous mineralisation. More specifically, the activation or the inactivation of these peptides would have a role in the control of FGF23 expression. According to the assumption mentioned previously, the regulation of PHEX could thus have an effect on mineralization. An increasing quantity of data on the regulation of PHEX is now available. For example, vitamin D decreases the expression of PHEX while glucocorticoids and growth hormone increase its expression. In a first study, we examined the possibility that a peptide connected to osseous mineralization could control the expression of PHEX. We determined that PTHrP1-34 can control in a negative way the expression of PHEX in UMR-106 cells, a cell line of osteoblastic origin. This regulation involves the cAMP/protein kinase A pathway. Moreover, this decrease in PHEX expression is also observed at day 7 in primary cultures of mineralizing rat osteoblasts. Next, we looked more closely at PHEX cellular localization. We used a mutant of PHEX, mutant E4Q identified in an XLH patient, where the mutated amino acid is found in the cytosolic domain of PHEX. This change does not interfere with the catalytic site of the enzyme since this PHEX mutant can still cleave a synthetic substrate as well as wildtype protein. This mutation disrupts a di-acidic motif present in the cytosolic domain of PHEX. We showed that this di-acidic motif is reponsible for the interaction of PHEX with COPII, a protein complex involved in the formation of secretion vesicles. Moreover, it would seem that this di-acidic motif is important, probably by its interaction with COPII, to the incorporation of PHEX in matrix vesicles, which are important in the mineralization process. Finally, competition assays showed that mineralization could be disturbed when the wildtype PHEX cytosolic tail is overexpressed, as opposed with the mutated cytosolic tail. This suggests that the interaction with COPII and the subsequent incorporation of PHEX in matrix vesicles or other proteins that possesses this motif could be important for mineralization. Finally, the last study examined the role of FGF23 on mineralization. We showed, by the overexpression of FGF23 in the mouse MC3T3 osteoblast cell line, that FGF23 can cause senescence of these cells. On the other hand, proliferation is not affected. Moreover, differentiation seems to occur at a faster rate, as indicated by earlier mineralization. Overexpression of FGF23 would accelerate differentiation and induce senescence. This is in agreement with the literature where KLOTHO, a FGF23 cofactor that increase the affinity of FGF23 for its receptor, when inactivated, shows a similar phenotype that includes senescence and aging.

PHEX est une protéine importante dans le processus de minéralisation osseuse. Des mutations ou la délétion d’une partie de ce gène causent l’hypophosphatémie liée au chromosome X (XLH). Cette maladie est caractérisée par une hypophosphatémie, accompagnée de défauts de minéralisation, de rachitisme et de lésions ostéomalaciques. Avec l’hypophosphatémie, les taux circulants de vitamine D devraient être augmentés, ce qui n’est pas le cas d’où une régulation anormale de la production de vitamine D a lieu. Cependant, malgré le fait que cette protéine soit une peptidase, aucun substrat physiologique n’a encore été répertorié pour PHEX. PHEX est une protéine membranaire de type II de la famille M13 des métalloendopeptidases à zinc possédant un court domaine N-terminal cytosolique, un segment transmembrannaire d’environ 20 acides aminés et une large portion C-terminale extracellulaire où se trouve le site actif de l’enzyme. PHEX est exprimée de façon majoritaire dans les os et dans les dents et elle apparaît à l’initiation de la minéralisation. Les patients souffrant de XLH et la souris Hyp, qui est un modèle animal de la maladie humaine, montrent des quantités importantes de la protéine FGF23. De plus, FGF23 est impliqué dans une autre maladie reliée au métabolisme du phosphate, l’hypophosphatémie rachitique autosomale dominante (ADHR) où des mutations de FGF23 causent sensiblement les mêmes symptômes que XLH. FGF23 est produit principalement par les ostéoblastes et les ostéocytes. FGF23 cause une hypophosphatémie par la diminution de l’expression du cotransporteur NaPi de type II, responsable de la réabsorption du phosphate rénal. L’hypothèse proposée dans la littérature serait que PHEX activerait ou inactiverait des peptides importants pour la minéralisation osseuse. Plus spécifiquement, l’activation ou l’inactivation de ces peptides aurait pour rôle de réguler les quantités de FGF23. Selon l’hypothèse mentionnée précédemment, la régulation de PHEX pourrait donc avoir un effet sur la minéralisation. Une quantité croissante de données sur la régulation de PHEX sont maintenant disponibles. Par exemple, la vitamine D diminue l’expression de PHEX tandis que les glucocorticoïdes et l’hormone de croissance augmentent son expression. Dans une première étude, nous avons voulu déterminer si un peptide relié à la minéralisation osseuse, le PTHrP1-34, pouvait réguler l’expression de PHEX. Nous avons déterminé que le PTHrP1-34 peut réguler de façon négative l’expression de PHEX dans les cellules UMR-106, une lignée cellulaire ostéoblastique. Cette régulation passe par la voie de l’AMPc/protéine kinase A. De plus, cette diminution d’expression est également observée au jour 7 dans des cultures primaires d’ostéoblastes de rat en minéralisation. Par la suite, nous avons étudié un mutant de PHEX, le mutant E4Q retrouvé chez un patient souffrant de XLH, où la mutation se retrouve dans le domaine cytosolique de PHEX. Cette mutation n’interfère pas avec le site catalytique de l’enzyme puisque ce mutant de PHEX peut tout aussi bien cliver un substrat synthétique que la protéine sauvage. Il a été déterminé que cette mutation annule un motif di-acide. Nous avons démontré que ce motif di-acide est responsable de la liaison de PHEX à COPII, responsable de la formation de vésicules de sécrétion. De plus, il semblerait que ce motif soit important, probablement par son interaction avec COPII, à l’incorporation de PHEX dans des vésicules de calcification, lesdites vésicules étant importantes dans le processus de minéralisation. Finalement, des essais de compétitions ont démontré que la minéralisation pouvait être perturbée lorsque l’on surexprimait la queue cytosolique sauvage de PHEX, contrairement à la queue mutée. Ceci suggère possiblement que l’interaction avec COPII menant à l’incorporation de PHEX dans les vésicules de calcification ou d’autres protéines comprenant de tels motifs pourrait être importante pour la minéralisation. Finalement, la dernière étude porte sur la protéine FGF23. Nous avons démontré, par la surexpression de FGF23 dans la lignée MC3T3 d’ostéoblastes de souris, que cette surexpression a un effet sur la sénescence de ces cellules. En effet, des essais de sénescence ont montré l’augmentation de celle-ci lorsque FGF23 est surexprimé. Par contre, la prolifération n’est pas altérée. De plus, il semblerait que la différenciation soit plus rapide, tel qu’observé par une minéralisation survenant plus tôt, mais n’étant pas plus importante. Bref, la surexpression de FGF23 semblerait faire en sorte que les ostéoblastes se différencient plus rapidement et passent donc à un état de sénescence prématuré comparativement aux cellules sauvages. Ceci est en accord avec la littérature où KLOTHO, un cofacteur de FGF23 permettant sa liaison avec une plus grande affinité sur son récepteur, lorsqu’inactivé démontre un phénotype similaire au vieillissement incluant un phénotype de sénescence. / PHEX is an important protein in the process of osseous mineralisation. Mutations or deletions of a part of the PHEX gene cause X-linked hypophosphatemia (XLH). This disease is characterized by hypophosphatemia, accompanied by defects of bone mineralisation, rickets and osteomalacia. With the hypophosphatemia, the circulating levels of vitamin D should be increased, which is not the case where an abnormal regulation of the production of vitamin D takes place. However, in spite of the fact that this protein is a peptidase, no physiological substrate has been identified. PHEX is a membrane type II integral protein member of the M13 family of zinc metalloendopeptidasee. These proteins have a short N-terminal cytosolic domain, a transmembrane domain of approximately 20 amino acids and a large extracellular C-terminal portion where the active site of the enzyme is located. PHEX is expressed predominantly in bones and teeth in osteoblasts and odontoblasts, respectively. PHEX is expressed at initiation of mineralization. Patients suffering from XLH and the Hyp mouse, which has been used widely as an animal model of the human disease, show large quantities of the FGF23 protein. Moreover, FGF23 is implicated in another disease connected to phosphate metabolism, the autosomal dominant hypophosphatemic rickets (ADHR) where activating mutations in FGF23 cause roughly the same symptoms as XLH. FGF23 is produced mainly by osteoblasts and osteocytes. FGF23 causes hypophosphatemia by decreasing the expression of the type II sodium phosphate cotransportor, partly responsible for renal phosphate reabsorption. The hypothesis suggested in the literature would be that PHEX would activate or inactivate important peptides for osseous mineralisation. More specifically, the activation or the inactivation of these peptides would have a role in the control of FGF23 expression. According to the assumption mentioned previously, the regulation of PHEX could thus have an effect on mineralization. An increasing quantity of data on the regulation of PHEX is now available. For example, vitamin D decreases the expression of PHEX while glucocorticoids and growth hormone increase its expression. In a first study, we examined the possibility that a peptide connected to osseous mineralization could control the expression of PHEX. We determined that PTHrP1-34 can control in a negative way the expression of PHEX in UMR-106 cells, a cell line of osteoblastic origin. This regulation involves the cAMP/protein kinase A pathway. Moreover, this decrease in PHEX expression is also observed at day 7 in primary cultures of mineralizing rat osteoblasts. Next, we looked more closely at PHEX cellular localization. We used a mutant of PHEX, mutant E4Q identified in an XLH patient, where the mutated amino acid is found in the cytosolic domain of PHEX. This change does not interfere with the catalytic site of the enzyme since this PHEX mutant can still cleave a synthetic substrate as well as wildtype protein. This mutation disrupts a di-acidic motif present in the cytosolic domain of PHEX. We showed that this di-acidic motif is reponsible for the interaction of PHEX with COPII, a protein complex involved in the formation of secretion vesicles. Moreover, it would seem that this di-acidic motif is important, probably by its interaction with COPII, to the incorporation of PHEX in matrix vesicles, which are important in the mineralization process. Finally, competition assays showed that mineralization could be disturbed when the wildtype PHEX cytosolic tail is overexpressed, as opposed with the mutated cytosolic tail. This suggests that the interaction with COPII and the subsequent incorporation of PHEX in matrix vesicles or other proteins that possesses this motif could be important for mineralization. Finally, the last study examined the role of FGF23 on mineralization. We showed, by the overexpression of FGF23 in the mouse MC3T3 osteoblast cell line, that FGF23 can cause senescence of these cells. On the other hand, proliferation is not affected. Moreover, differentiation seems to occur at a faster rate, as indicated by earlier mineralization. Overexpression of FGF23 would accelerate differentiation and induce senescence. This is in agreement with the literature where KLOTHO, a FGF23 cofactor that increase the affinity of FGF23 for its receptor, when inactivated, shows a similar phenotype that includes senescence and aging.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / FGF23 is an osteocyte produced hormone necessary for maintaining systemic phosphate handling, and thus bone structure and function in both rare and common disorders such as chronic kidney disease (CKD). FGF23 is a critical factor in CKD, with elevated levels causing alterations in mineral metabolism and increased odds for mortality. However, the mechanisms directing the production of key modulators of skeletal homeostasis and biomineralization within osteocytes, and how this is altered in chronic kidney disease, remain unclear. The experimental focus of this dissertation was to dissect the molecular systems and role of oxygen sensing in the regulated production of FGF23. In CKD, up to 75% of patients have anemia and concomitant marked elevations in FGF23, increasing mortality odds. Anemia is a potent driver of FGF23 secretion, therefore, current and emerging therapies, including recombinant EPO and the hypoxia inducible factorprolyl hydroxylase inhibitors (HIF-PHI) FG-4592 and BAY 85-3934, were used to improve anemia in the adenine diet-induced mouse model of CKD. In the mice with CKD, iFGF23 was markedly elevated in control mice but was attenuated by 65-85% after delivery of EPO or HIF-PHI, with no changes in serum phosphate. This was associated with improved systemic iron utilization and reductions in mRNA markers of renal fibrosis. In osteocyte-like cell cultures treated with HIF-PHI, integrative RNAseq and ATACseq analysis identified candidate genes upregulated in response to mimicked hypoxia, concomitant with elevated Fgf23 expression. These genes were found to be downregulated in CKD bone, therefore, knock-out cells were generated using CRISPR/Cas9 technology. These cells were found to be functionally similar to in vivo conditional knockout models that have enhanced bone mass and elevated FGF23. Taken together, these results further define novel factors involved in the regulation of FGF23 and identify new therapeutic targets. / 2023-05-26

La maladie rénale chronique (MRC) induit des anomalies du métabolisme phosphocalcique, avec des conséquences à la fois osseuses, vasculaires et biologiques. La prise en charge optimale de ces désordres représente un challenge quotidien pour le néphrologue pédiatre, à la fois sur le court terme (équilibre biologique) et sur le long terme (prévention des fractures, optimisation de la croissance et limitation de l’apparition des calcifications vasculaires). Peu d’outils sont actuellement disponibles pour évaluer ces atteintes, et de nouveaux outils prometteurs, à la fois biologiques (FGF23) et radiologiques (HR-pQCT) apparaissent. Néanmoins, les données pédiatriques sur ces outils restent rares. Cette thèse de doctorat a permis d’évaluer ces nouveaux moyens chez ces enfants MRC, notamment en évaluant l’HR-pQCT dans cette population, et en déterminant des valeurs de référence du FGF23 en fonction de l’âge, du sexe et de la fonction rénale. Nous avons pu aussi montrer que les concentrations circulantes de FGF23 ne sont pas dépendantes du sexe dans une population pédiatrique, mais qu’elles augmentent avec l’âge et l’indice de masse corporelle, mais aussi en cas d’antécédent de transplantation d’organe solide ou de traitement par corticostéroïdes. D’un point de vue plus fondamental, nous avons pu montrer que dans des monocytes issus de donneurs sains, une exposition au FGF23 induit une diminution de l’expression des 2 enzymes principales impliquées dans le métabolisme de la vitamine D (1α hydroxylase et 24 hydroxylase), en induisant également une diminution du peptide antimicrobien cathélicidine. Ces résultats permettent donc de décrire un nouveau rôle pour le FGF23 dans la régulation de l’immunité innée / Chronic kidney disease can induce mineral and bone disorders (CKD-MBD), with deleterious consequences for bone and vessels. The management of such abnormalities can be challenging, from the daily biological balance between calcium, phosphorus and PTH levels, to the long-term prevention of morbidities such as fractures, growth impairment and vascular calcifications. Some tools can help to accurately assess CKD-MBD, e.g., new bone imaging techniques (HR-pQCT) and FGF23, but they are rarely used in pediatric populations. In addition to evaluating HR-pQCT in CKD children and healthy controls, this PhD thesis allowed us to determine reference values for circulating FGF23 levels depending on age, gender and renal function; we also showed that FGF23 levels increased not only with age and BMI, but also in cases of solid organ transplant or corticosteroids therapy. We have also showed in vitro that FGF23 could inhibit the two key enzymes of vitamin D metabolism (1α hydroxylase et 24 hydroxylase) in monocytes issued from healthy donors, with in turn a decreased synthesis of the antimicrobial cathelicidin. These later results highlight a new role for FGF23 in innate immunity, and may bring new insights in the understanding of FGF23 deregulation during CKD

L'arthrose (OA) est une maladie articulaire chronique qui résulte de changements complexes dans le phénotype des chondrocytes. La présence de microcristaux contenant du phosphate dans les zones de cartilage lésées suggère que le métabolisme phosphocalcique contribue en partie aux modifications du phénotype chondrocytaire au cours de la maladie. De nombreuses études ont montré que des concentrations élevées en Phosphate Inorganique extracellulaire (ePi) ou en PyroPhosphate Inorganique (ePPi) ont respectivement un effet activateur ou répressif sur la minéralisation du cartilage articulaire. Comme le Fibroblast Growth Factor 23 (FGF23) régule les concentrations de Pi, FGF23 semble être un candidat aux modifications phénotypiques observées dans l'OA. De plus, il a récemment été mis en évidence que l’ePPi prévient la dédifférenciation in vitro des chondrocytes articulaires chez le rat, un effet provoqué par la production de PPi par la protéine Ank. Cela suggère que l’ePPi pourrait être un candidat pour prévenir les modifications du phénotype chondrocytaire. Premièrement, nous avons montré que l’expression de FGF23 est plus importante dans du cartilage lésé que dans du cartilage sain. Sous stimulation croissante de FGF23, les chondrocytes humains OA présentent une expression soutenue des marqueurs d’hypertrophie tels que COL10A1, VEGF et MMP13. Nous avons également démontré que l’expression de MMP13 est fortement dépendante de FGFR1 mais indépendante de Klotho et qu’elle est fortement régulée par la voie MEK/ERK et dans une moindre mesure par la voie PI3K/AKT. Deuxièmement, nous avons montré que FGF23 est produit de façon plus importante au cours de la différenciation des ATDC5 et qu’une stimulation par FGF23 augmente la minéralisation et l’expression des marqueurs d’hypertrophie, et ce, d’autant plus fortement en présence d’une stimulation par du Pi dans ces cellules. Dans la seconde partie, nous avons montré que des chondrocytes humains OA stimulés par du PPi présentent une expression diminuée des composants collagéniques de la matrice et une expression augmentée des MMPs, de la fibronectine et des intégrines. Une stimulation par le PPi active de façon importante la voie p38 et dans une moindre mesure la voie ERK pour réguler l’expression de ses gènes cibles et notamment MMP13 d’une manière Ank indépendante. Enfin, nous avons démontré qu’une stimulation par FGF23 entraine une augmentation de l’expression de Pit-1, ENPP1 et ANK ainsi que la production de PPi par les chondrocytes humains OA. Les résultats obtenus dans cette étude démontrent que le FGF23 permet localement une différenciation des chondrocytes OA vers un phénotype hypertrophique et peut potentiellement être considéré comme un facteur aggravant de l’OA. Contrairement aux données préliminaires chez le rat, le PPi permet un remodelage matriciel des chondrocytes humains OA et pourrait potentiellement contribuer aux effets pro-hypertrophiques du FGF23 / Osteoarthritis (OA) is the most common form of chronic joint disease, characterized by cartilage degeneration that results from complex changes in the chondrocyte phenotype. The presence of phosphate-containing microcrystals in the injured cartilage areas suggests the contribution of the phosphocalcic metabolism in the phenotype switch of chondrocytes during the disease. Numerous studies have shown that elevated concentrations of extracellular inorganic phosphate (ePi) or inorganic pyrophosphate (ePPi) have, respectively, activating or repressive mineralizing effects on articular cartilage. As Fibroblast Growth Factor 23 (FGF23) plays a major role in regulating concentrations of Pi, FGF23 is an attractive candidate to participate in the phenotype switch of the articular chondrocyte observed in OA. Moreover, we recently demonstrated that ePPi also prevents the in vitro dedifferentiation of articular chondrocyte in rats, an effect mostly triggered by Ank-induced release of PPi. This suggests that PPi may be an attractive candidate to prevent the phenotype switch of the articular chondrocyte. Firstly, we showed that FGF23 expression was higher in OA samples than in healthy one. When stimulated with increasing concentrations of FGF23, human OA chondrocytes displayed a sustained expression of markers of hypertrophy such as COL10A1, VEGF and MMP13. We demonstrated further, that MMP13 expression was mainly dependent on FGFR1 and independent of Klotho and was strongly regulated by the MEK/ERK cascade and to a lesser extent by the PI-3K/AKT pathway. Secondly, we showed that FGF23 and FGFRs were produced more importantly during ATDC5 differentiation and that FGF23 stimulation increased hypertrophic markers expression and mineralization in a synergic manner with Pi. In the second part, we showed that human OA chondrocytes stimulated with PPi displayed a decreased expression of collagen components of the matrix and sustained expression of MMPs, fibronectin and integrins. We demonstrated further that PPi stimulation mostly activates p38 pathway and to a lesser extent ERK pathway to regulate the expression of its target genes in an Ank-independent manner. Finally, we demonstrated that FGF23 stimulation increased Pit-1, ENPP1 and Ank expressions and PPi production by human OA chondrocyte. Altogether, the results obtained in this study demonstrate that FGF23 locally promotes differentiation of OA chondrocytes towards a hypertrophic phenotype and may therefore be considered as an aggravating factor for OA. In contrast to previous data obtained in rats, we demonstrated that PPi promotes matrix-remodeling of human OA chondrocytes and might contribute to FGF23 pro-hypertrophic effect

<p>Human physiology is dependent on an accurate phosphate (Pi) homeostasis. Defective Pi regulation causes hyper- or hypophosphatemia, which are associated with ectopic calcification or impaired bone mineralization, and a shortened life span. Current endocrine models of Pi homeostasis are incomplete. However, studies of acquired and hereditary disorders of Pi homeostasis have revealed new potential Pi regulating hormones, Phosphatonin(s). One of these is fibroblast growth factor-23 (FGF23). FGF23 is produced in bone and is secreted into the circulation. Mutations in FGF23 causes disturbed Pi regulation, without the appropriate counter-regulatory actions of parathyroid hormone or vitamin D. By the generation of FGF23 transgenic mice, which display phenotypic similarities to patients with hypophosphatemic disorders, we show that FGF23 exerts endocrine actions in the kidney and causes osteomalacia. Renal FGF23 actions severely decrease Pi reabsorption and expression of Klotho, a suggested age suppressor gene, known to be crucial in FGF23 receptor binding and activation. In bone, our transgenic model displays impaired osteoclast polarization, which should be detrimental to osteoclastic bone resorption in osteomalacia. However, in our model osteoclasts efficiently participate in bone matrix degradation. Furthermore, we investigated a large population-based cohort in order to elucidate the role of FGF23 in normal physiology. Importantly, we were able to demonstrate an association of FGF23 to parathyroid hormone, renal function and bone mineral density and we found a correlation of FGF23 to weight and body fat mass. The studies on which this thesis is based, demonstrate that FGF23 has phosphatonin-like properties and that the skeleton functions as an endocrine organ. In addition, the results indicate that FGF23 has a role in bone mineral and lipid metabolism, and that FGF23 is a possible diagnostic marker and therapeutic target for the future.</p>