Còpia digital de l'exemplar imprès de la tesi dipositat a la Biblioteca de la Facultat de Medicina / La distinción de diferentes formas o compuestos de bilirrubina se ha basado durante mucho tiempo en algunas particularidades de la diazoreacción que sirve para detectar la presencia del pigmento y para determinarlo cuantativamente por colorimetría. En los últimos lustros han sido introducidas algunas técnicas de análisis cromatográfico que han permitido separar distintas fracciones de bilirrubina, pero se sigue recurriendo a la diazorreacción para caracterizarlas y distinguirlas. En 1913, Hijmans Van den Bergh y Snapper introdujeron la reacción diazoica para la determinación cuantitativa de la bilirrubina en el suero, usando etanol con el fin de eliminar las proteínas y obtener un medio homogéneo, en el que fueran solubles la bilirrubina y el agente acoplante. Unos años más tarde Van den Bergh y Müller descubrieron, accidentalmente, que el alcohol no es necesario para el desarrollo del color cuando la reacción se realiza en la bilis y en ciertos sueros ictéricos, y describieron dos tipos de reacción: la “reacción directa", caracterizada por ocurrir en ausencia de alcohol, inmediatamente antes de los 30 segundos, y alcanzando rápidamente la máxima intensidad, y la "reacción indirecta", en la que el color, en ausencia de alcohol, tarda en aparecer de 2 a 4 minutos o incluso más tiempo y alcanza la intensidad máxima muy lentamente. Investigaciones posteriores condujeron a nuevas subdivisiones, ya que se distinguieron tres subtipos de "reacción directa": la inmediata, la retardada y la bifásica. No obstante, como destaca Witt, la diferenciación entre ellas es muy forzada; en realidad todos los sueros, incluso los que se consideran de reacción indirecta típica, pueden dar, sin necesidad de añadir alcohol, una ligera coloración que se inicia después de media hora, una hora o más tiempo, según los casos, y se intensifica lentamente, alcanzando su máxima intensidad en varias horas, hasta 24 en algunos casos (Katznelson, 1920). Las únicas disoluciones con una reacción verdaderamente negativa son las soluciones coloidales acuosas de bilirrubina pura, que no reaccionan aunque se añada alcohol o cualquier otra sustancia. Como resultado de estas investigaciones y las realizadas más adelante, se han descrito diversos "agentes acoplantes" capaces de acelerar la reacción diazoica y de convertir en “directa" la reacción “indirecta" de ciertos sueros y de las disoluciones puras de bilirrubina. Entre ellos se encuentran los alcoholes y otros disolventes orgánicos (acetona, piridina), ciertos ácidos orgánicos (acético glacial, acetoacético, butírico y cítrico), algunas sales de ácidos débiles (acetato sódico, benzoato sódico, salicilato sódico), los ácidos y las sales biliares, y diversas sustancias como cafeína, urea, acetamina y antipirina. En algunos casos el efecto acelerador o acoplante puede ser atribuido a modificaciones del pH, a acciones físicas facilitadoras de la solubilidad de la bilirrubina o a la formación de compuestos moleculares más fácilmente solubles; pero en otros casos, el mecanismo de acción permanece sin explicar. Además, se han encontrado algunos compuestos (ácido ascórbico, cisteína y glutation) capaces de actuar en forma contraria, inhibiendo la reacción diazoica y se ha comprobado que ciertos iones, aniones y cationes, ejercen también una considerable influencia, generalmente aceleradora, sobre la diazorreacción. (Texto extraído y adaptado de la Tesis)

According to recent studies, antioxidant supplementation on gamete processing and/or storage solutions improvesgamete quality parameters, after cooling or storage at sub zero temperature. The aim of the present study was to investigate the effects of antioxidant supplementation on pig and horse gamete storage. The first study aimed to determine the effects of resveratrol (RESV) on the apoptotic status of porcine oocytes vitrified by Cryotop method, evaluating phosphatidylserine (PS) exteriorization and caspases activation. RESV(2µM) was added during: IVM (A); 2 h post-warming incubation (B); vitrification/warming and 2 h post-warming incubation (C); all previous phases (D). The obtained data demonstrate that RESV supplementation in the various steps of IVM and vitrification/warming procedure can modulate the apoptotic process, improving the resistance of porcine oocytes to cryopreservation-induced damage. In the second work different concentrations of RESV (10, 20, 40, and 80µM) were added during liquid storage of stallion sperm for 24 hours at either 10°C or 4°C, under anaerobic conditions. Our findings demonstrate that RESV supplementation does not enhance sperm quality of stallion semen after 24 hours of storage. Moreover, the highest RESV concentrations tested (40 and 80µM) could damage sperm functional status, probably acting as pro-oxidant. Finally, in the third work other two antioxidants, ascorbic acid (AA) (100 µM) and glutathione (GSH) (5mM) were added on boar freezing and/or thawing solutions. In our study different sperm parameters were evaluated before freezing and at 30 and 240 minutes after thawing. Our results showed that GSH and AA significantly improved boar sperm cryotolerance, especially when supplemented together to both freezing and thawing media. This improvement was observed in sperm viability and acrosome integrity, sperm motility, and nucleoprotein structure. Although ROS levels were not much increased by freeze-thawing procedures, the addition of GSH and AA to both freezing and thawing extenders significantly decreased intracellular peroxide levels.

L’espermatozoide és una cèl•lula molt especialitzada amb una estructura de la cromatina única formada per dos dominis principals: el domini nucli-protamínic on la gran majoria del DNA es troba empaquetat per protamines en toroides molt compactes, i el domini nucli-histònic on una petita proporció del DNA roman empaquetat per histones, d’una manera més accessible. Cada vegada són més les evidències que suggereixen que l’espermatozoide madur presenta una funció més enllà de la simple transmissió del material genètic patern a la següent generació. La hipòtesi principal d’aqueta tesi consisteix en que aquesta contribució paterna no és solament basada en la transmissió de patrons de metilació de DNA o modificacions d’histones concretes, si no que també es troba influïda per l’estat de la cromatina espermàtica i, en especial, per la seva composició proteica. Per aquest motiu, en aquesta tesi doctoral s’ha caracteritzat detalladament el contingut proteic del nucli de l’espermatozoide humà normal mitjançant dues estratègies diferents. Per una banda, les proteïnes majoritàries del nucli espermàtic, les protamines, han sigut analitzades per extraccions i electroforesis àcides per tal d’estudiar la seva implicació en la conservació de la cromatina. S’ha observat una relació negativa significativa entre la quantitat de protamines i el dany al DNA espermàtic (mesurat per la tècnica COMET) en pacients infèrtils que cursen tècniques de reproducció assistida. Aquests resultats han suggerit una funció de les protamines referent a la protecció del material genètic patern. A més a més, mitjançant tècniques basades en espectrometria de masses (Top-down proteomics), s’ha observat com les protamines podrien contenir modificacions post-traduccionals en la seva seqüència (fosforilacions, acetilacions, metilacions), el que suggeriria també una funció reguladora per aquestes proteïnes espermàtiques. En segon lloc, mitjançant espectrometria de masses també s’han caracteritzat la resta de proteïnes presents en el nucli del gàmeta masculí madur. S’han arribat a identificar centenars de proteïnes, la meitat de les quals corresponen a histones, variants d’histones, modificadors d’histones, factors de transcripció, proteïnes addicionals associades a la cromatina i proteïnes modificadores de la cromatina espermàtica. D’aquesta manera, mitjançant anàlisis bioinformàtics es pot observar com el nucli de l’espermatozoide humà madur es trobaria enriquit en proteïnes involucrades en processos reguladors com la modificació de la cromatina, modificació d’histones, expressió gènica i transcripció. Aquestes tendències també es trobarien presents en altres espècies de mamífers, com per exemple el ratolí, la rata o el macaco. La presència d’aquests grups de proteïnes intactes en una cèl•lula considerada transcripcionalment inerta ha suggerit una funció epigenètica/reguladora durant els primers estadis del desenvolupament embrionari. Addicionalment, en aquesta tesi doctoral s’ha observat que les proteïnes espermàtiques nuclears es poden diferenciar en dos grups diferents segons la seva afinitat per la cromatina espermàtica. D’aquesta manera, les proteïnes unides més fortament al DNA es trobarien majoritàriament implicades en funcions estructurals, mentre que les proteïnes unides al DNA d’una forma més feble es trobarien relacionades amb processos reguladors o epigenètics. Aquesta observació, juntament amb el fet conegut de que la regió més accessible de la cromatina espermàtica (associada a les histones) es troba especialment enriquida en promotors i gens del desenvolupament, suggeriria que part de les proteïnes nuclears espermàtiques podrien estar relacionades amb la regulació de la transcripció d’aquests gens, a més a més d’altres processos com la remodelació de la cromatina en el pronucli masculí. Per tant, mitjançant la caracterització del contingut proteic del nucli de l’espermatozoide humà, s’ha augmentat el coneixement d’aquesta cèl•lula i de la seva funcionalitat, recolzant la hipòtesi de que a més a més del propi material genètic patern, l’espermatozoide contribueix en la fertilització amb informació epigenètica, la qual inclou una composició proteica específica de la cromatina. / The mammalian spermatozoon is a very specialized cell with a unique chromatin structure: while the vast majority of the DNA is condensed by high compact toroids (avoiding any transcriptional and translational activity), a small part of the DNA remains packaged by nucleosomes. An increasing body of evidence is showing that, in addition to the transmission of the paternal genetic message to the next generation, the sperm cell is also involved in the transmission of epigenetic information. The main hypothesis of the present doctoral thesis is that, in addition to histone modifications, DNA methylation patterns and RNA content; protein composition of the sperm chromatin is also essential in epigenetic inheritance. Therefore, the protein content of the human sperm nucleus has been characterized using proteomic techniques. Firstly, by acid extraction and electrophoresis, it has been shown a negative relationship between protamine quantities and DNA damage in infertile patients who undergo assisted reproduction techniques, confirming an involvement of those proteins in the protection of the paternal DNA. In addition, by top-down proteomics, it has been detected several post-translational modifications in protamine sequences, which have suggested a potential regulatory role for those major sperm nuclear proteins. Secondly, it has been described the human sperm nuclear proteome using mass spectrometry techniques. A rich network of histones, histone variants, histone modifiers, transcription factors, chromatin-associated proteins and chromatin modifying proteins has been identified in the human sperm nucleus. In addition, based in Gene Ontology information, the human sperm nucleus seemed to be enriched in processes as chromatin remodelling, histone modification, transcription and gene expression. Furthermore, proteomic dissection of the sperm chromatin results in two groups of proteins differing in chromatin affinity. Higher-affinity sperm chromatin proteins seemed to be mainly involved in structural roles, while proteins with potential regulatory/epigenetic roles were identified with a lower sperm chromatin affinity. Altogether, the results obtained in this doctoral thesis have contributed in the knowledge of the nucleus of the male gamete and have suggested an involvement of the sperm nuclear proteins in post-fertilization events, as the chromatin remodelling in the male pronucleus or the transcription regulation of histone-bound paternal developmental genes.

La implicación de la salud oral en el rendimiento físico del deportista es un área que ha suscitado un interés creciente en los últimos años. Atendiendo a los factores etiológicos de las patologías orales y a las repercusiones que éstas pueden tener sobre el organismo, se plantean las siguientes hipótesis de trabajo: (i) los hábitos higiénicos y dietéticos de la población deportista los sitúan, a priori, en un grupo de riesgo para el desarrollo de caries y erosión dental; (ii) el ejercicio anaeróbico máximo podría inducir respuestas específicasa a nivel oral que determinaran una diferente experiencia de caries; (iii) la oclusión dental podría estar asociada a alteraciones en el equilibrio del sujeto, de especial trascendencia en especialidades con un alto componente técnico. Esta tesis doctoral se lleva a cabo a través de varios estudios con los siguientes objetivos: (i) analizar y comparar la experiencia de caries (índice CAOD) en atletas de disciplinas anaeróbicas en comparación con la población general; (ii) estudiar el efecto de la realización de ejercicio anaeróbico máximo en carrera (series interválicas de 300 metros) en el valor del pH salival. A la vez, valorar la posible correlación entre el valor de pH salival y el lactato sanguíneo; (iii) comprobar si realizando un ejercicio de carácter similar al descrito en el punto (ii) en condiciones de hipoxia (series de saltos con contramovimiento (CMJ)) se modifica el pH salival en comparación con el mismo protocolo de ejercicio realizado en normoxia. A la vez, valorar una posible correlación entre el valor de pH salival y la saturación arterial de oxígeno (SaO2); (iv) valorar la influencia de la oclusión dental en el control postural del sujeto bajo condiciones de estabilidad opuestas (estática vs dinámica) en plataforma inestable; y (v) determinar si la fatiga muscular resultante de la realización de ejercicio máximo (CMJ o circuito de fuerza general) altera el equilibrio y si la oclusión dental es un factor determinante en el control del equilibrio del sujeto después del ejercicio. Los resultados obtenidos aportan las siguientes conclusiones: (i) la población deportista especialista en disciplinas anaeróbicas manifiesta una menor experiencia de caries que la población general; (ii) la realización de ejercicio anaeróbico láctico provoca una alcalinización en el valor del pH salival. Sin embargo, pese a observar una tendencia incremental paralela en los valores de lactato sanguíneo y del pH salival, la correlación entre ambos valores es inconcluyente; (iii) cuando se realiza ejercicio anaeróbico máximo en condiciones de hipoxia normobárica se produce una mayor alcalinización del pH salival en comparación con normoxia. A la vez, parece existir una correlación estadísticamente significativa entre la SaO2 y el pH salival; (iv) la información aferente de la oclusión dental podría contribuir en mayor medida en el proceso de control postural en presencia de mayores condiciones de inestabilidad. Además, existen determinadas características de la oclusión dental que influyen negativamente en el control postural del sujeto: el resalte, la desviación de la línea media, la clase de Angle, la mordida abierta anterior, la mordida cruzada, y el apiñamiento; y (v) la fatiga muscular resultante de la realización de un ejercicio máximo no causa alteraciones inmediatas en el equilibrio. De manera global, se puede concluir que la práctica de ejercicio físico anaeróbico de alta intensidad produce una alcalinización en el pH salival. A la vez, la oclusión dental parece influir en el equilibrio de la población físicamente activa sólo en condiciones de alta inestabilidad. El ejercicio anaeróbico produce respuestas específicamente diferentes que el aeróbico en la fisiología oral y de la misma manera, el estado de salud bucodental puede influir de modo diferente en el rendimiento anaeróbico y aeróbico. / The influence of oral health on the sport performance is a matter of growing interest. Here we conduct several researches with the following aims: (i) to compare the DMFT index in athletes of anaerobic disciplines with general population; (ii) to determine if high intensity anaerobic exercise could affect the salivary pH response; (iii) to determine if high intensity exercise performed in hypoxia could affect the salivary pH response in comparison to normoxia; (iv) to assess a possible correlation between salivary pH values and blood lactate or SaO2; (v) to determine whether there are differences in balance between opposed dental occlusion (Intercuspal position (ICP)/Rest position (RP)) for two extreme levels of stability (stable/unstable); and (vi) to determine whether the muscle fatigue affects stability and if it differs according to the dental occlusion condition. Results allow us to obtain the following conclusions: (i) athletes of anaerobic disciplines has less dental decay experience than general population; (ii) performing anaerobic lactic acid-producing exercise has an effect on saliva alkalinization; (iii) exercise performed in normobaric hypoxia has stronger effects in saliva alkalinization than when performed under normoxia; (iv) significant negative correlation was found between salivary pH and SaO2 levels for the tests performed under hypoxia conditions, whereas correlation between salivary pH and blood lactate was inconclusive; (v) the stability index was significantly better when dental occlusion was set in RP than in ICP in unstable conditions; and (vi) the postural control was not affected after maximal exercise. These results suggest and important interactions of oral health status and the anaerobic performance that may differ from aerobic exercise. Specifically, conclusions indicate that (i) a salivary pH alkalinization may occur after performing maximal anaerobic exercise; and (ii) the sensory information linked to the dental occlusion for the balance control comes strongly into effect in unstable conditions.

El trans-resveratrol (trans-3,5,4’-trihidroxiestilbè) és un polifenol que es troba a diferents components de la dieta amb propietats beneficioses per a la salut. Per aquesta raó, ha estat considerat com un compost bioactiu i, recentment, com un nutracèutic. En el present treball s’ha aprofundit en l’estudi d’aquest compost per tal de conèixer nous aspectes metabòlics i terapèutics del trans-resveratrol. En primer lloc, s’han estudiat els canvis que pateix durant el seu trànsit intestinal així com el seu metabolisme a l’enteròcit al ser administrat per via oral a la rata. S’ha demostrat que el trans-resveratrol és metabolitzat a l’enteròcit formant els seus conjugats glucurònid i sulfat. Aquests compostos retornen majoritàriament a la llum intestinal mitjançant les proteïnes transportadores ABC. El trans-resveratrol no absorbit i que arriba a l’intestí gruixut és convertit en dihidroresveratrol per acció de la microbiota que redueix el doble enllaç del trans-resveratrol. També el dihidroresveratrol és conjugat i convertit en els seus respectius glucurònid i sulfat. Per determinar aquests compostos, s’ha posat a punt una tècnica per a la determinació del dihidroresveratrol a plasma per extracció en fase sòlida i el resveratrol a contingut intestinal mitjançant una extracció líquid-líquid seguides de l’anàlisi per HPLC. Els mètodes que s’han descrit són exactes, precisos i tenen recuperacions superiors al 95%. En una segona part, s’ha posat a punt un model d’inducció de càncer de còlon en rata per tal d’avaluar l’efecte del trans-resveratrol sobre les lesions preneoplàstiques induïdes per 1,2-dimetilhidrazina. L’administració de 60 mg/kg durant 49 dies, ha demostrat que el trans-resveratrol, el sulfat, el glucurònid i el dihidroresveratrol es troben en el contingut intestinal i que es produeix una reducció del 52% dels focus de criptes aberrants i del 45% dels focus amb depleció de mucines. S’observa una correlació directa entre la disponibilitat del trans-resveratrol a còlon i la reducció de les lesions preneoplàstiques. A continuació s’ha fet un estudi de la biodisponibilitat en ratolins modificats genèticament que no expressen la glicoproteïna P (Mdr1a-/-) i, per últim, en ratolins sense la breast cancer resistance protein (Bcrp1-/-), comparant-la amb la dels ratolins control. Els resultats indiquen similar biodisponibilitat en els controls i Mdr1a-/- mentre que es modifica en els ratolins Bcrp1-/- indicant que aquesta proteïna participa en l’absorció i la distribució del trans-resveratrol i els seus derivats. Finalment, s’ha desenvolupat un model farmacocinètic per al trans-resveratrol i els seus conjugats glucurònid i sulfat seguint una aproximació poblacional. El model que millor descriu les concentracions plasmàtiques en rata vincula els models bicompartimentals del trans-resveratrol, del glucurònid i del sulfat. Aquest model és robust i capaç de predir adequadament les concentracions plasmàtiques, possibilitant així la planificació de futurs estudis PK-PD per tal d’establir la contribució relativa dels conjugats en l'eficàcia del trans-resveratrol. / trans-Resveratrol (trans-3,5,4'-trihydroxystilbene) is a polyphenol found in several components of the diet with beneficial health properties. Therefore, it has been considered a bioactive compound, and most recently as a nutraceutical. This work has studied this compound in-depth to meet new therapeutic and metabolic aspects. Firstly, we evaluated the changes that occur during intestinal transit and metabolism in the enterocyte when it is orally administered in the rat. trans-Resveratrol is metabolized in the enterocyte forming its glucuronide and sulfate conjugates that mostly return back into the intestinal lumen by ABC transporters. Unabsorbed trans-resveratrol reaches the colon where microbiota converts this polyphenol in dihydroresveratrol by its double bond reduction which is also conjugated in its glucuronide and sulfate in the intestine. Two techniques have been developed to determine dihydroresveratrol in plasma by a solid-phase extraction and trans-resveratrol in the intestinal content by a liquid-liquid extraction followed by HPLC analysis. The methods are accurate, precise with recoveries exceeding 95%. Secondly, a colon cancer model in rats has been developed to evaluate the effect of trans-resveratrol on preneoplastic lesions induced by 1,2-dimethylhydrazine. After 49 days of administration, trans-resveratrol, its sulfate and glucuronide, and dihydroresveratrol are found in the intestinal content and produce a reduction of aberrant crypt foci and mucin-depleted foci. There is a direct correlation between the availability of trans-resveratrol in colon and the reduction of preneoplastic lesions. Afterward a study of the bioavailability has been carried out in mice lacking P-glycoprotein (Mdr1a-/-) and in knockout mice for breast cancer resistance protein (Bcrp1-/-) as compared with that in wild-type mice. The results indicate similar bioavailability in controls and Mdr1a-/- mice while it is altered in Bcrp1-/- mice indicating that only BCRP is involved in the absorption and distribution of trans-resveratrol and its metabolites. Finally, we have developed a pharmacokinetic (PK) model for trans-resveratrol and its glucuronide and sulfate conjugates following a population PK approach. A three-linked two-compartment model was built for trans-resveratrol, glucuronide and sulfate which describes the plasmatic concentration profile in rat. This model is robust and able to accurately predict plasmatic concentrations, thus enabling future PK/PD studies to establish the relative contribution of the conjugates in the efficiency of trans-resveratrol.

El diagnòstic genètic preimplantacional (PGD) permet diagnosticar embrions obtinguts mitjançant tècniques de reproducció assistida. L’objectiu principal del PGD és diagnosticar els embrions de parelles portadores de malalties hereditàries greus, per tal d’aconseguir el naixement d’individus sans. S’ha postulat que les aneuploïdies són, en molts casos, responsables de la infertilitat o del fracàs de les metodologies de fecundació in vitro (FIV) per això, s’ha desenvolupat una variant del PGD, el PGS (Preimplantational Genetic Screening). Aquest té com a objectiu estudiar alteracions cromosòmiques, ja siguin numèriques o estructurals. Fins a l’actualitat la tècnica més emprada per al diagnòstic d’aquest tipus d’alteracions ha estat la FISH (Hibridació in situ Fluorescent). Rutinàriament amb aquesta metodologia s’estudien 9 cromosomes dels 24 totals del complement. Una altra metodologia per a l’estudi d’aneuploïdies és la CGH (Hibridació Genòmica Comparada), aquesta permet analitzar citogenèticament tot el complement cromosòmic de la cèl·lula d’estudi. L’anàlisi conjunta de malalties monogèniques familiars i d’aneuploïdies de tot el complement cromosòmic conformen el diagnòstic genètic preimplantacional de doble factor (DF-DGP). El primer objectiu d’aquesta tesi ha estat dur a terme un estudi bàsic que permetés aprofundir en el coneixement de les aneuploïdies pre-meiòtiques existents en l’oòcit utilitzant la tècnica de CGH. Estudiant 157 oòcits immadurs de dones de diferents edats i indicacions, s’ha determinat que el 15,9% dels oòcits estudiats presentaven aquest tipus d’anomalies. Aquestes alteracions cromosòmiques d’origen pre-meiòtic es troben en un nivell basal en totes les dones, sense veure’s afectades per l’edat materna o per problemes de fertilitat, i s’han trobat en un 33,9% de les dones estudiades. El segon objectiu ha estat posar a punt una nova aproximació per al DF-DGP, que permetés diagnosticar monogènicament i citogenèticament els embrions a Dia+3, per tal d’obtenir els resultats de l’anàlisi monogènica i citogenètica poc més de 30h després de la biòpsia i poder transferir els embrions sans i euploides dins del mateix cicle de FIV. S’han posat a punt dues aproximacions diferents de DF-DGP. La primera consisteix en biopsiar dos blastòmers dels embrions evolutius per fer-ne servir un per a l’anàlisi monogènica i l’altre per a la citogenètica. La segona aproximació consisteix en biopsiar un sol blastòmer i realitzar el doble diagnòstic a partir d’una sola cèl·lula. Ambdues aproximacions s’han aplicat clínicament en diferents parelles portadores de malalties monogèniques greus, obtenint embarassos i naixements d’individus sans. Algunes d’aquestes aplicacions per a determinades malalties monogèniques com per exemple la síndrome de Lynch, han estat pioneres a l’estat espanyol aconseguint per primera vegada el naixement d’individus sans per la malaltia. En conclusió, durant aquesta tesi doctoral s’ha demostrat la rellevància dels desequilibris cromosòmics en els oòcits i embrions estudiats, amb orígens molt diversos. És per això que les aproximacions del DF-DGP proposades prenen importància, ja que permeten seleccionar els embrions sans i que alhora són euploides, per tant, tindran més probabilitats d’implantar i de donar lloc al naixement d’individus sans. Cal destacar també, que tots aquests procediments diagnòstics es duen a terme durant el mateix cicle de FIV, i es pot realitzar transferència embrionària a final del dia+4 o dia+5, sense haver de criopreservar els embrions, fet que podria reduir la seva viabilitat. / Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) enables genetic analysis of embryos produced by assisted reproductive technologies. The aim of PGD is to diagnose embryos from couples carrying monogenic hereditary diseases, and to achieve birth of healthy individuals. It has been described that aneuploidies are the main causes of infertility or failure of IVF techniques (in vitro fertilisation), that is the reason why PGS (Preimplantational Genetic Screening) was developed. The most frequent technique to perform PGS is FISH (Fluorescent in situ hybridisation) where usually 9 chromosomes are analysed. Another methodology to screen aneuploidies is CGH (Comparative Genomic Hybridisation), which permits the assessment of the whole chromosome complement of the cell. Double Factor Preimplantation Genetic Diagnosis (DF-PGD) is based on the analysis of single gene diseases together with comprehensive aneuploidy screening of the embryos. The first objective of this work was to perform a basic study to have a better knowledge of the pre-meiotic aneuploidies found in oocytes using CGH. Different female groups were studied according to age and fertility problems. A total of 157 immature oocytes were analysed, and 15,9% of them showed aneuploidies originated before entering meiosis. The differences between the studied groups showed no significant differences. These type of abnormalities have been found in 33,9% of the females. The second aim of the study was to set up a new methodology for DF-PGD, that permits not only monogenic but also cytogenetic diagnosis of cleavage-stage embryos. Two different approaches were applied, the first one consists in biopsying two blastomeres from each evolved embryo at day+3, and use one of them for monogenic analysis, and the other for comprehensive aneuploidy screening by CGH. The other strategy was to biopsy a single blastomere to perform both analyses from the single biopsied cell. These two methodologies have been applied clinically in different diseases and birth of healthy individuals was achieved. Certain monogenic diseases such as Lynch syndrome, had never been analysed before by PGD in our country, but in this work were applied for the first time and birth of healthy offspring was achieved. In conclusion, this work has demonstrated the importance of chromosomal abnormalities originated in different stages either in oocytes or blastomeres. That is the reason why DF-PGD approaches catch importance, because they permit the selection of not only healthy but also euploid embryos for transfer. Therefore, theses embryos would have more implantation potential. All these DF-PGD procedures can be performed within approximately 30h, which permits embryo transfer in the same IVF cycle, avoiding cryopreservation steps that might be detrimental for the embryos.

Les molècules adaptadores són essencials en l'organització de les molècules de senyalització i en la coordinació i compartimentació de la seva activitat . 3BP2 és una proteïna adaptadora citoplasmàtica expressada ubiqüament però principalment en cèl·lules hematopoètiques. S'ha demostrat que actua com un regulador positiu transduïnt la senyal cel·lular en cèl·lules T , B i NK. 3BP2 és un important regulador en l’alliberació de grànuls citotòxics en les cèl·lules NK. Els mastòcits es desgranulen de manera similar després de l'agregació depenent d'antigen de l'alta afinitat del receptor per IgE (FceRI) a la superfície cel·lular. L'activació d'aquestes cèl·lules indueix l'alliberament de mediadors inflamatoris preformats i la síntesi de novo i també la secreció de citocines i quimiocines. El receptor KIT forma part dels receptors factors de creixement tirosin cinasa. El lligand de KIT és el SCF (stem cell factor), considerat com el factor de creixement més rellevant en mastòcits. L’activació de KIT a través del SCF és crucial per al desenvolupament, la diferenciació i la supervivència dels mastòcits, així com per a una òptima desgranulació depenent d'IgE i producció de citocines. En aquesta tesis s’estudia el paper del 3BP2 en la regulació de l’activitat cel·lular a través dels receptors de membrana, FcepcilonRI i KIT. Amb els resultats podem concloure que el 3BP2 és necessari per obtenir una òptima resposta del mastòcit, tan a nivell de les respostes immediates, com la desgranulació, com en les respostes tardanes com la secreció de IL-8 i de GM-CSF. En la transducció de senyals a traves del FceRI, el 3BP2 és un important regulador de l’activació de mastòcits humans. Per tant, 3BP2 podria ser una diana terapèutica potencial per les malalties inflamatòries mediades pels mastòcits dependents d'IgE. Per altre banda, el silenciament del 3BP2 redueix l’expressió del receptor KIT, tant en la superfície com a nivell transcripcional, això implica un paper del 3BP2 en aquest procés. De fet, el silenciament del 3BP2 condueix a una reducció de MITF, factor de transcripció implicat en l’expressió de KIT. Les mutacions d’activació en KIT s'han associat amb diverses malalties com la mastocitosi, per tant analitzem la capacitat de 3BP2 per regular l'expressió de KIT en la línia cel·lular HMC-1 on KIT es troba mutat. Trobem que el silenciament de 3BP2 en aquestes cèl·lules també redueix l’expressió de KIT. Curiosament el silenciament de KIT i la inhibició de l’activitat cinasa del receptor redueix l’expressió de 3BP2, tot això suggereix una estreta relació entre ambdues molècules. Per tant, 3BP2 podria ser una possible diana terapèutica, en malalties inflamatòries mediades per mastòcits i en trastorns on el KIT esta desregulat. Una d’aquestes malalties associades a la desregulació del receptor KIT son els tumors de cèl·lules de l'estroma gastrointestinal (GIST). La majoria dels GIST presenten mutacions en KIT (85%) o en el receptor PDGFRa (5%) que comporten un increment de l’activitat cinasa d’ambdós receptors. En el present treball es mostra que 3BP2 s'expressa en línies cel·lulars procedents de pacients amb GIST i que la reducció de l’expressió de 3BP2 indueix un decrement de l’expressió del KIT. Curiosament, el silenciament de 3BP2 també redueix l’expressió de PDGFRa. Per altre part, 3BP2 coprecipita amb els receptors KIT i PDGFRa indicant que la molècula pot ser mediador de la senyalització d’ambdós receptors. Aquests nous resultats destaquen la importància del 3BP2 en la regulació de l’expressió i senyalització d’aquests dos receptors oncogènics, mostrant un paper com a possible diana terapèutica en GIST, especialment rellevant en els casos de pacients que han adquirit resistència als inhibidors de l’activitat cinasa d’aquests receptors. / 3BP2 is a cytoplasmic adaptor protein mainly expressed by haematopoietic cells that has been shown to act as a positive regulator in T, B and NK cell signal transduction. 3BP2 is an important regulator of cytotoxic granule release in NK cells. Mast cells similarly degranulate following antigen-dependent aggregation of the high affinity receptor for IgE (FceRI) on the cell surface. Activation of these cells induces the release of preformed inflammatory mediators and the de novo synthesis and secretion of cytokines and chemokines. The KIT receptor whose ligand is the stem cell factor (SCF) is necessary for mast cell development, proliferation and survival as well as for optimal IgE dependent signal. This thesis studied 3BP2 role in regulating cellular activity through membrane receptors, FcepcilonRI and KIT. Our findings point to a requirement for 3BP2 in optimal immediate and late mast cells responses such as degranulation and IL-8 or GM-CSF secretion. In signal transduction through FceRI, 3BP2 is an important regulator of the activation of human mast cells. Moreover 3BP2 silencing reduces expression of KIT receptor both on the surface and at the transcriptional level, this implies a role in this process 3BP2. In fact, the silencing of 3BP2 leads to a reduction in MITF, transcription factor involved in expression of KIT. Our results suggest a potential of 3BP2 as a therapeutic target in mast cell-mediated inflammatory diseases and deregulated KIT disorders. One of this disorders are gastrointestinal stromal tumors (GIST). Most GISTS contain oncogenic gain-of­function of KIT (85%) or PDGFRa receptor (5%) which is accompanied by strong expression of the protein products of these oncogenes. We show that 3BP2 is also expressed in cell lines form GIST patients and there are an interaction with3BP2 and both receptors. Interestingly, silencing of 3BP2 reduce oncogenic KIT and PDGFRa expression. These novel findings highlight the importance of 3BP2 in the regulation of the two oncogenic receptors expression and signalling indicating a role as a potential target in GIST, including those cases containing mutations that confer resistance to the KIT/ PDGFRa kinase inhibitors.

La Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb Quists subcorticals (MLC) és un tipus rar de leucodistròfia vacuolitzant de progressió lenta, que presenta com a principals característiques clíniques macrocefàlia acusada durant els primers anys de vida, deteriorament de les funcions motores, epilèpsia i retard mental de grau mig. Actualment encara es desconeix el mecanisme fisiopatològic de la malaltia, i per tant ni hi ha cap tractament possible per als pacients. S’han descrit dos gens implicats en la malaltia MLC. El primer gen descobert s’anomena MLC1 i codifica per una proteïna de membrana que porta el mateix nom. El segon gen s’anomena GLIALCAM i codifica per una proteïna transmembrana de tipus I que també porta el mateix nom. S’ha decrit que la proteïna GlialCAM actua com a subunitat ß de MLC1 ja que es capaç de dirigir-la i concentrar-la a les unions cel·lulars. Per altra banda, GlialCAM també s’ha descrit com a subunitat auxiliar del canal de Cl- ClC-2 ja que és capaç de modificar les propietats d’activació i rectificació del canal. Recentment s’ha descrit mutacions en ClC-2 associades a un tipus de leucodistròfia vacuolitzant. L’objectiu general d’aquesta Tesi és avançar en la comprensió del possible mecanisme d’acció i la funció de la proteïna GlialCAM i ClC-2 i així aprofundir en el coneixement de en el seu paper en les cèl·lules glials així com en la fisiopatologia de les leucoencefalopaties vacuolitzants. Per a realizar aquest objectiu es van realitzar estudis d’estructura-funció de GlialCAM mitjançant la caracterització bioquímica i funcional de noves mutacions en GLIALCAM associades a MLC. S’ha obtingut una classificació de les mutacions en GLIALCAM en funció del defecte que presentaven. S’ha descrit mutacions defectives en la expressió proteica, defectives en la homooligomerització i en el tràfic a les unions cel·lulars, defectives únicament en el tràfic cel·lular, mutacions sensibles a la manca de MLC1 i mutacions defectives en la internalització de la proteïna. Paral·lelament es va aprofundir en la relació bioquímica entre GlialCAM i ClC-2 a partir de l’estudi bioquímic i funcional de mutacions en CLCN2 associades a leucoencefalopaties vacuolitzants. S’ha observat que GlialCAM augmenta la funció del canal ClC-2 a través de la modificació del gating del canal i de la estabilització de ClC-2 a la membrana plasmàtica però no sembla que millori la sortida de ClC-2 del reticle endoplasmàtic. A més, aquesta estabilització requereix de la formació d’homocomplexes de GlialCAM. Per últim, es va generar i caracteritzar un model knock-down de la proteïna ClC-2 per aprofundir el paper de ClC-2 en els astròcits. Així com també es va avançar en la relació bioquímica i funcional entre GlialCAM i ClC-2 en la fisiologia astrocitària. S’ha descrit que en astròcits en cultiu en condicions d’alta concentració de K+, similar al que succeiria en situacions d’alta activitat neuronal, ClC-2 es transloca de l’aparell de Golgi a les membranes cel·lulars, modificant les seves propietats funcionals per l’efecte de GlialCAM. En canvi, en astròcits deficients de MLC1, ClC-2 es troba retinguda citoplasmàticament. Aquest fet, indicaria que aquestes proteïnes podrien tenir un paper en el procés de sifoneig del K+, i per tant, la deslocalització de ClC-2 podria donar lloc a un desordre en l’homeòstasi d’aigua i ions. / Megalencephalic Leukoencephalopathy with subcortical Cysts (MLC) is a rare type of vacuolating leukodystrophy. Currently still unknown pathophysiological mechanism of the disease, and therefore there is no effective treatment possible for patients. There are two genes involved in the MLC disease. Gene was first discovered was MLC1 and this encodes for a membrane protein with the same name. The second gene is called GLIALCAM and encodes for a transmembrane protein type I that also carries the same name. In our group is has been described that GlialCAM acts as a protein ß subunit of MLC1 because it is able to direct and concentrate in the cellular junctions. Moreover, GlialCAM also act as auxiliary subunit of CLC-2 Cl channel as it is capable of modifying the activation and rectification properties of the channel. Recently, mutations in ClC-2 have been associated with a rare type of vacuolating leukodystrophy. The principal aim of this study is to advance in the knowledge of GlialCAM and ClC-2 in the glial cells and into the pathogenesis of vacuolating leukodistrophies. To accomplish the study, the group performed a biochemical and funcional characterization of new mutations in GLIALCAM associated with MLC. We suggest that the HEPACAM mutations described up to now can be classified in several groups. Some mutations can affect GlialCAM protein expression, affect its ability to cis-homooligomerize and consequently reduce their localization in cell–cell junctions. Some mutations can affect specifically only transinteractions between GlialCAM molecules or may be unstable without MLC1 and finally some mutations affect the protein internalization. Parallel progress was made in the biochemical relationship between GlialCAM and ClC-2 from biochemical and functional studies of mutations in CLCN2 associated with vacuolating leukodystrophies. GlialCAM has been observed to increase ClC-2 function by the modification of its gating and the stabilization of ClC-2 in the plasma membrane. In addition, the stabilization requires a previous formation of GlialCAM’s homocomplexes. Finally, a knock-down model of the CLC-2 protein was generated and characterized to deepen the role of CLC -2 astrocytes. As well as progress was made in biochemistry and functional relationship between CLC -2 and GlialCAM in the astrocitic physiology. It has been reported that astrocytes cultured in conditions of high concentrations of K + , similar to what happens in situations of high neuronal activity , CLC -2 translocates from the Golgi apparatus to the cell membrane , changing the its functional properties for the purpose of GlialCAM . However, in MLC1 deficient astrocytes, CLC -2 is retained intracellularly. This would indicate that these proteins could play a role in the potassium siphoning, and therefore the relocation of CLC -2 could lead to disorder in the homeostasis of water and ions.

"Acinetobacter baumannii" es una bacteria causante de infecciones nosocomiales a nivel mundial con una creciente incidencia y resistencia a todos los antibióticos. En el hospital de Bellvitge, desde 1992 se detectó una endemia por esta bacteria multirresistente de considerables proporciones. En este contexto realizamos diversos estudios epidemiológicos para clarificar los factores de riesgo para adquirir cepas con resistencia a carbapenémicos, que fueron: El estado previo de portador de cepas resistentes, haber recibido tratamiento con imipenem y haber estado en una unidad con otros pacientes colonizados o infectados por cepas carbapenem-resistentes. Aparte del clon previo sensible a imipenem, aparecieron 2 nuevos clones no relacionados epidemiológicamente resistentes a carbapenémicos, que rápidamente sustituyeron a los clones iniciales. No hubo diferencias significativas en las localizaciones de infección y la morbimortalidad entre las cepas sensibles y resistentes a carbapenémicos. Las medidas epidemiológicas de control, incluyendo la restricción del uso de carbapenémicos en las UCIs, fracasaron en el intento de control de la endemia. Las cepas con resistencia a todos los antibióticos, incluidos carbapenémicos, planteaban importantes dificultades en el tratamiento, puesto que según el antibiograma el único antibiótico que mantenía la sensibilidad in vitro era la colistina, y éste era un antibiótico en desuso, con importantes efectos secundarios y cuya actividad antibacteriana estaba en entredicho. Se planteó entonces la necesidad de un modelo experimental en animales, para intentar hallar algún antibiótico o combinación eficaz en las infecciones por cepas de "A. baumannii" resistentes a todos los antibióticos, incluso carbapenémicos. En este modelo de neumonía en ratón, utilizamos 3 cepas de "A. baumannii" con sensibilidad a imipenem, sensibilidad intermedia y resistencia de alto nivel. Analizamos la eficacia de diversos antibióticos con interés clínico en el tratamiento de estas infecciones: Imipenem, sulbactam, tobramicina, rifampicina y colistina, así como diversas combinaciones. Observamos que la colistina, el único antibiótico que mantenía in vitro la sensibilidad, era menos eficaz que otras combinaciones: En el clon con resistencia intermedia a carbapenémicos, las combinaciones de imipenem-tobramicina o sulbactam-tobramicina fueron los tratamientos más eficaces y superiores; a colistina mientras que en el clon con alta resistencia a carbapenémicos, las combinaciones de imipenem-rifampicina y tobramicina-rifampicina fueron las más activas, también más eficaces que colistina. Finalmente realizamos un estudio clínico piloto donde ensayamos, en 10 pacientes con infecciones por cepas resistentes a carbapenémicos, la pauta más activa obtenida del modelo animal (imipenem-rifampicina), concluyendo que aunque se consiguió la curación clínica en el 70 % de los pacientes, la combinación no consiguió evitar la aparición de resistencia a rifampicina en 7 de los casos. A la vista de nuestros resultados, aparte de la posible utilidad de otras combinaciones en la práctica clínica, parece que lo más efectivo en el control de las infecciones por A. baumannii multirresistente es asegurar las medidas de intervención epidemiológicas.

I. INTRODUCCIÓLa insuficiència renal crònica (IRC) és una patologia d'incidència creixent i en conseqüència, els requeriments de tractament substitutiu renal són també cada cop majors a les societats occidentalitzades. El trasplantament renal és el tractament substitutiu d'elecció en els pacients que desenvolupen IRC terminal, aportant una major supervivència, qualitat de vida i és menys cosotosa que la resta de teràpies substitutives renals.Des de que al 1954 es realitzà el primer trasplantament renal reeixit fins a l'actualitat, s'ha recorregut un camí molt llarg. El trasplantament renal ha passat de ser una teràpia anecdòtica i exclusiva, practicada solament en casos molt seleccionats, a fer-se de forma rutinària com a tractament electiu als centres hospitalaris.Els resultats del trasplantament renal a curt termini han millorat de forma significativa en els darrers quinze anys, assolint una taxa de supervivència de l'empelt de quasi el 95% durant el primer any del trasplantament. És evident que l'avenç significatiu en el coneixement dels mecanismes de la resposta immunitària ha permès l'elaboració de noves drogues immunosupressores, cada cop més selectives dirigides sobre dianes específiques i claus en l'activació de la resposta immunològica. Entre aquests fàrmacs cal destacar l'aparició durant les dècades dels 80 i 90 dels inhibidors de la calcineurina (ciclosporina i tacrolimus) i l' antiproliferatiu micofenolat mofetil, i a partir del 2000 els inhibidors de m-TOR (mamalian target of rapamycin) i les noves formulacions de l'àcid micofenòlic així com nous anticossos monoclonals i policlonals utilitzats com a teràpia d'inducció. Amb ells, s'aconseguí una reducció significativa dels episodis de rebuig agut cel.lulars, passant d'una incidència del 30-40% a una incidència actual entre el 10-15%. Malgrat tot, l'aparició inexorable de disfunció crònica de l'empelt, que es tradueix histològicament en lesions inespecífiques de fibrosi intersticial i atròfia tubular, i la mort del pacient essencialment degut a malaltia cardiovascular i al càncer, ambdues causes paradoxalment relacionades a l'ús crònic d'aquestes potents teràpies immunosupressores, han fet que la supervivència de l'empelt renal a llarg termini no s'hagi incrementat en els darrers 15 anys tal i com s'hauria esperat. Per tant, malgrat les noves estratègies terapèutiques immunosupressores aparegudes en les darreres dues dècades, no s'ha pogut evidenciar un impacte significatiu en la supervivència de l'empelt a més llarg termini. És per aquest motiu que sorgeix en els darrers anys una corrent de pensament, cada cop més majoritària entre la comunitat científica, que es postula a favor d'intentar preparar o programar al sistema immunològic per assolir un estat d'hiporesposta o tolerància immunològica específica enfront el donant, amb la finalitat de poder reduir o fins i tot en casos seleccionats, eliminar totalment el tractament immunosupressor d'una forma segura. Per assolir aquest objectiu però, és essencial disposar de marcadors biològics i eines de monitoratge de la resposta immunològica amb prou sensibilitat i especificitat que ens permetin conèixer l'estat funcional d'aquesta resposta d'una manera dinàmica en els diferents períodes evolutius del trasplantament.Il. HIPÒTESILa hipòtesi que proposem en el nostre treball és que el monitoratge de les subpoblacions limfocitàries T de memòria/efectora secretora d'IFN-gamma i T reguladora FoxP3+ donantespecífiques en el trasplantament renal podria exercir un paper rellevant com a biomarcadors de la funció immunològica donant-específica i per tant relacionar-se amb la funció i el dany histològic de l'empelt, tant en protocols protolerogènics com en el seguiment del pacient trasplantat en tractament de manteniment.III. OBJECTIUS1. El primer objectiu del treball de tesi és avaluar si el monitoratge dels linfòcits T de memòria/efectors circulants donant-específics i activats per les dues vies de presentación antigènica (directe i indirecte) mitjançant la tècnica d'Elispot IFN-gamma en pacients portadors d'un empelt renal de llarga evolució (>2 anys), és un bon biomarcador capaç de discriminar aquells pacients que presenten alteracions de la funció renal. 2. El segon objectiu és avaluar si la presència de cèl·lules Tregs (CD4+CD25+FoxP3+) entre infiltrats cel.lulars en pacients diagnosticats de rebuig agut subclínic, és un bon biomarcador per a diferenciar entre infiltrats lesius d'aquells amb un rol protector sobre l'empelt.3. El tercer objectiu d'aquest treball és avaluar els mecanismes a través dels quals l'administració d'un protocol immunosupressor amb propietats inmunomoduladores basat amb un tractament inductor deplecionador limfocitari T amb rATG a dosis baixes, acompanyat d'un tractament de manteniment amb sirolimus i micofenolat mofetil, sense esteroides ni fàrmacs anti-calcineurínics, és capaç d'induir un estat d'hiporesposta donant-específica després del trasplantament renal. Per assolir aquest objectiu, es realitza un monitoratge acurat de les diferents respostes immunològiques efectores d'aquests pacients en diferents períodes del trasplantament; la resposta cel.lular donant-específica per tècnica d'Elispot IFN-gamma, la resposta humoral mitjançant l'estudi d'al'loanticossos donant-específics (DSA) circulants i presència de C4d a nivell de capil.lars peritubulars de l'empelt i la resposta reguladora estudiant la presència i comportament funcional de les TregsFoxP3+ tant en sang perifèrica com directament a nivell de l'empelt renal.