O típico sabor de chocolate é único, obtido somente de sementes fermentadas, secas e torradas de cacau, não podendo ser sintetizado artificialmente. O desenvolvimento desse sabor é influenciado pela constituição genética das sementes, processamento pós-colheita e manufatura. Proteínas dos cotilédones são potencialmente precursores do sabor e aroma de chocolate. O presente trabalho teve como objetivo analisar diferenças qualitativas e quantitativas nas proteínas de sementes de três genótipos de Theobroma cacao após a colheita e durante a fermentação, de forma a correlacionar estes resultados com diferenças na qualidade (sabor e aroma) obtidas por análise sensorial. Um dos desafios foi o isolamento de proteínas das sementes, evitando o alto teor de polifenóis e polissacarídeos que interferem na separação das proteínas e na análise do proteoma. A metodologia de extração composta por filtração em Miracloth, solubilização e precipitação em ácido ticloroacético (TCA) apresentou géis de maior resolução e repetibilidade, tendo sido escolhida como metodologia de extração protéica para estudo das alterações no proteoma das sementes de cacau durante a fermentação. Foi necessária também a utilização de kit comercial de purificação de proteínas e utilização de método de coloração com nitrato de prata para garantir géis com resolução dos spots e repetibilidade satisfatórias. Os spots foram isolados e após digestão tríptica, submetidos ao sequenciamento por cromatografia líquida associado ao espectrômetro de massas. Os espectros foram analisados pelo programa MASCOT MS/MS Ion Search, utilizando bancos de dados do NCBI. Análises dos mapas 2-D mostraram variação no número de spots entre as variedades. Ao final da fermentação, as proteínas ainda presentes nas sementes das variedades SIAL 70 e Catongo eram ácidas, e o processo de degradação foi caracterizado pelo desaparecimento de quase todas as proteínas neutras ou básicas e também de algumas proteínas ácidas; as proteínas com massa molar acima de 35 kDa também foram todas degradadas. Na variedade CCN 51, não ocorreu o mesmo perfil degradativo, havendo proteínas até pI 6,5 e massa molar acima de 100 kDa. Dos cem spots submetidos ao sequenciamento, 89 foram identificados. As proteínas 21kDa e vicilina foram as proteínas mais abundantes nos cotilédones. Correlacionando os resultados da análise sensorial e a proteômica concluiu-se que existe correlação tanto quantitativa como qualitativa das proteínas dos cotilédones de cacau e possivelmente com as proteínas precursoras de sabor de chocolate / Typical chocolate flavor is unique, only obtained from fermented, dried and roasted cocoa seeds, and can not be synthesized artificially. The flavor development is influenced by the genetic constitution, post-harvest processing and manufactures. Cotyledons proteins are believed to be the precursors of the chocolate flavor. The aim of the present work was to analyze qualitative and quantitative protein differences in seeds of three cocoa genotypes after harvesting and during the fermentation and to correlate these results with differences in quality (flavor and aroma) obtained by sensorial evaluation. One of the challenges was the isolation of proteins from cocoa seeds, avoiding the high content of polyphenols and polysaccharides which disturb protein separation and proteome analysis. The methodology of extraction by filtration in Miracloth, solubilization and precipitation in trichloroacetic acid showed the highest gel resolution and reprodutivity, and, thus, was chosen to be used in the analyses of the proteome of cocoa seeds during the fermentation. It was also necessary to use commercial kit for protein purification and a silver-based staining method with nitrate to guarantee gels with spots resolution and satisfactory reproducibility. Proteins were excised from de gels and after tryptic digestion, MS analysis was conducted by on line chromatografhy using a Cap-LC coupled to a mass spectrometer. The spectra were processed using MASCOT MS/MS Ion Search, and the sequences searched against NCBI databases. The 2-DE maps analysis of cocoa seeds showed significant variation of the spots number among the genotypes. At the end of fermentation, proteins still present in the Sial 70 and Catongo genotypes were acid and the degradation process was characterized by the disappearance of almost all the neutral or basic proteins and also some acid proteins. The genotype CCN 51 did not show the same degradation profile. Of the spots submitted to the mass spectrometer, 89 were identified. The 21kDa protein and vicilin were the most abundant proteins in the cocoa cotyledons. Correlating sensorial analysis and the proteomic results we could observe the existence of quantitative as qualitative correlation of proteins from cocoa cotyledons and possibly with the precursors proteins of chocolate flavor

O típico sabor de chocolate é único, obtido somente de sementes fermentadas, secas e torradas de cacau, não podendo ser sintetizado artificialmente. O desenvolvimento desse sabor é influenciado pela constituição genética das sementes, processamento pós-colheita e manufatura. Proteínas dos cotilédones são potencialmente precursores do sabor e aroma de chocolate. O presente trabalho teve como objetivo analisar diferenças qualitativas e quantitativas nas proteínas de sementes de três genótipos de Theobroma cacao após a colheita e durante a fermentação, de forma a correlacionar estes resultados com diferenças na qualidade (sabor e aroma) obtidas por análise sensorial. Um dos desafios foi o isolamento de proteínas das sementes, evitando o alto teor de polifenóis e polissacarídeos que interferem na separação das proteínas e na análise do proteoma. A metodologia de extração composta por filtração em Miracloth, solubilização e precipitação em ácido ticloroacético (TCA) apresentou géis de maior resolução e repetibilidade, tendo sido escolhida como metodologia de extração protéica para estudo das alterações no proteoma das sementes de cacau durante a fermentação. Foi necessária também a utilização de kit comercial de purificação de proteínas e utilização de método de coloração com nitrato de prata para garantir géis com resolução dos spots e repetibilidade satisfatórias. Os spots foram isolados e após digestão tríptica, submetidos ao sequenciamento por cromatografia líquida associado ao espectrômetro de massas. Os espectros foram analisados pelo programa MASCOT MS/MS Ion Search, utilizando bancos de dados do NCBI. Análises dos mapas 2-D mostraram variação no número de spots entre as variedades. Ao final da fermentação, as proteínas ainda presentes nas sementes das variedades SIAL 70 e Catongo eram ácidas, e o processo de degradação foi caracterizado pelo desaparecimento de quase todas as proteínas neutras ou básicas e também de algumas proteínas ácidas; as proteínas com massa molar acima de 35 kDa também foram todas degradadas. Na variedade CCN 51, não ocorreu o mesmo perfil degradativo, havendo proteínas até pI 6,5 e massa molar acima de 100 kDa. Dos cem spots submetidos ao sequenciamento, 89 foram identificados. As proteínas 21kDa e vicilina foram as proteínas mais abundantes nos cotilédones. Correlacionando os resultados da análise sensorial e a proteômica concluiu-se que existe correlação tanto quantitativa como qualitativa das proteínas dos cotilédones de cacau e possivelmente com as proteínas precursoras de sabor de chocolate / Typical chocolate flavor is unique, only obtained from fermented, dried and roasted cocoa seeds, and can not be synthesized artificially. The flavor development is influenced by the genetic constitution, post-harvest processing and manufactures. Cotyledons proteins are believed to be the precursors of the chocolate flavor. The aim of the present work was to analyze qualitative and quantitative protein differences in seeds of three cocoa genotypes after harvesting and during the fermentation and to correlate these results with differences in quality (flavor and aroma) obtained by sensorial evaluation. One of the challenges was the isolation of proteins from cocoa seeds, avoiding the high content of polyphenols and polysaccharides which disturb protein separation and proteome analysis. The methodology of extraction by filtration in Miracloth, solubilization and precipitation in trichloroacetic acid showed the highest gel resolution and reprodutivity, and, thus, was chosen to be used in the analyses of the proteome of cocoa seeds during the fermentation. It was also necessary to use commercial kit for protein purification and a silver-based staining method with nitrate to guarantee gels with spots resolution and satisfactory reproducibility. Proteins were excised from de gels and after tryptic digestion, MS analysis was conducted by on line chromatografhy using a Cap-LC coupled to a mass spectrometer. The spectra were processed using MASCOT MS/MS Ion Search, and the sequences searched against NCBI databases. The 2-DE maps analysis of cocoa seeds showed significant variation of the spots number among the genotypes. At the end of fermentation, proteins still present in the Sial 70 and Catongo genotypes were acid and the degradation process was characterized by the disappearance of almost all the neutral or basic proteins and also some acid proteins. The genotype CCN 51 did not show the same degradation profile. Of the spots submitted to the mass spectrometer, 89 were identified. The 21kDa protein and vicilin were the most abundant proteins in the cocoa cotyledons. Correlating sensorial analysis and the proteomic results we could observe the existence of quantitative as qualitative correlation of proteins from cocoa cotyledons and possibly with the precursors proteins of chocolate flavor

La mise au point de techniques de fractionnement des moûts de Sauvignon blanc par chromatographie de partage centrifuge et par chromatographie Flash, a permis de mettre en évidence la présence de deux « nouvelles » formes précurseurs du 3SH (le S-3-(hexan-1-al)-glutathion et l'acide S-3-glutathionyl-hydroxyhexanesulfonique). L’ensemble de ces résultats a permis de confirmer la contribution majeure des S-conjugués au potentiel en 3SH des moûts. Le S-3-(hexan-1-ol)-L-cystéine, le S-3-(hexan-1-ol)-glutathion ainsi que les deux nouvelles formes identifiées, permettent d’expliquer près de 65% du 3SH libéré dans les vins. Par ailleurs, nous avons montré que l’ensemble des formes précurseurs appartenait à la même voie d’assimilation de la levure et que le S-3-(hexan-1-ol)-L-cystéine est un intermédiaire indispensable à la biotransformation des S-conjugués au glutathion, précurseurs du 3-sulfanylhexanol. De plus, le pourcentage de biotransformation des différents S-conjugués en 3SH semble directement lié à leur position dans le flux métabolique. / The development of fractionation techniques in Sauvignon Blanc musts such as centrifugal partition chromatography and flash chromatography, permitted to identify two precursor forms of 3-sulfanylhexanol : the S-3-(hexan-1-al)-glutathione, and the S-3-glutathionyl-hydroxy hexanesulfonic acid. These results confirmed the major contribution of S-conjugates in the potential liberation of 3-sulfanylhexanol in musts. The two newly identified forms along with S-3-(hexan-1-ol)-L-cysteine and S-3-(hexan-1-ol)-glutathione, explain up to 65% of the total release of 3-sulfanylhexanol. Futhermore, we showed that all precursor forms belonged to the same assimilation pathway of yeast and the S-3-(hexan-1-ol)-L-cysteine is an essential intermediate in the metabolism of S-glutathione conjugates, which is a precursor of 3-sulfanylhexanol . Finally, the biotransformation percentage of different S-conjugates of 3-sulfanylhexanol seems directly related to their position in the metabolic flow.