Die hier vorliegende Forschungsarbeit überprüfte eine mögliche Beteiligung des peripheren Nervensystems bei M. Parkinson und den atypischen Parkinson-Syndromen. 31 Patienten mit einem idiopathischen Parkinson-Syndrom (IPD-Patienten) und neun Patienten mit einem atypischen Parkinson-Syndrom (APD-Patienten) sowie 35 altersentsprechende Kontrollprobanden wurden zwischen 2011 und 2012 für diese Studie rekrutiert. Neben der Eigenanamnese und der neurologischen Untersuchung erhielten die Patienten eine Suralisneurographie zur Überprüfung der large fibers und eine Quantitative sensorische Testung (QST) zur Detektion einer möglichen Small-fiber-Dysfunktion. Die Vitamin-Bestimmung diente der Untersuchung möglicher Zusammenhänge zwischen der Levodopa-Therapie, eventuell daraus resultierenden Vitamin-Mangelzuständen und einer reduzierten intraepidermalen Nervenfaser-Dichte (IENF-Dichte) beim M. Parkinson. Für die histologische Auswertung der IENF-Dichte und der dermalen, myelinisierten Nervenfaserbündel (PGP 9.5- / MBP- Doppelfärbung) sowie für die immunohistochemische Untersuchung der Nervenfasersubtypen (anti-alpha-CGRP- und anti-Substanz P-Antikörper) wurden bei jedem Probanden vier Hautbiopsien von den Extremitäten und dem Körperstamm entnommen. Sieben IPD-Patienten und ein Proband mit einem atypischen Parkinson-Syndrom wiesen ein vermindertes sensorisches Nervenaktionspotenzial (SNAP) in der Suralisneurographie auf. Dagegen war eine pathologisch reduzierte Nervenleitgeschwindigkeit nur bei einem IPD-Patienten nachweisbar. Auffällig war zudem eine negative Korrelation zwischen der Erkrankungsdauer und dem SNAP (Korrelationskoeffizient -0,367, p<0,03). In der Auswertung der Hautbiopsien konnte eine statistisch signifikante Reduktion der myelinisierten Bündel am Unterschenkel der IPD-Patienten festgestellt werden. Bei zehn von 30 IPD-Patienten, jedoch bei keinem der Probanden mit einem atypischen Parkinson-Syndrom, konnte eine verminderte IENF-Dichte nachgewiesen werden. In der statistischen Überprüfung wurde außerdem am Unterschenkel ein signifikanter Unterschied zwischen den IPD-Patienten und der Kontrollkohorte sowie eine negative Korrelation zwischen der Krankheitsdauer und der IENF-Dichte (Korrelationskoeffizient -0,320, p<0,05) festgestellt. Die QST konnte dagegen keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den einzelnen Kohorten aufzeigen. Im Kontrast dazu fand sich eine längenunabhängige Reduktion der CGRP-positiven und der Substanz P-positiven IENF-Dichte bei den Patienten mit einem idiopathischen Parkinson-Syndrom. Bemerkenswert war zudem eine signifikante Verminderung der Substanz P-positiven intraepidermalen Nervenfasern am Oberschenkel und Rücken bei den APD-Patienten. Eine statistisch signifikante Abweichung der CGRP- und Substanz P-positiven Bündel konnte dagegen nicht festgestellt werden. In der laborchemischen Untersuchung war ein Zusammenhang zwischen den bestimmten Vitamin-Spiegeln und der kumulativen Levodopa-Dosis sowie zwischen den Vitaminen und der IENF-Dichte lediglich bei dem Vitamin B6 nachweisbar. Zusammengefasst erscheint eine Beteiligung des peripheren Nervensystems beim idiopathischen Parkinson als wahrscheinlich, wohingegen bei den atypischen Parkinson-Syndromen vor allem von einer zentralen Genese ausgegangen werden kann. Basierend auf den Ergebnissen der Suralisneurographie und der Bestimmung der myelinisierten Bündel erscheint eine krankheitsbedingte Large-fiber-Beeinträchtigung beim M.Parkinson möglich. Die nachgewiesene längenabhängige Small-fiber-Reduktion bei IPD-Patienten wird vermutlich durch eine axonale Transportstörung verursacht. Einen krankheitsbedingten Erklärungsansatz für die längenunabhängige Reduktion der CGRP-positiven und der Substanz P-positiven IENF-Dichte bei IPD-Patienten liefert der Nachweis von neurotoxischem α-Synuclein in den sensiblen Spinatganglien mit einem daraus resultierenden Untergang von sensorischen Nervenfasern. Aufgrund der geringen Anzahl an Parkinson-Patienten mit sensiblen Symptomen und dem fehlenden Nachweis eines statistisch signifikanten Unterschiedes in der QST liegt der Verdacht nahe, dass die ermittelte intraepidermale Nervenfaserreduktion der IPD-Patienten nicht stark genug ausgeprägt ist, um eine signifikante Abweichung der QST-Ergebnisse zu verursachen. Weiterhin konnte kein Zusammenhang zwischen der kumulativen Levodopa-Menge, den Vitaminen B12, Methylmalonsäure sowie Homocystein und dem Auftreten einer Nervenfaserverminderung nachgewiesen werden, was gegen eine iatrogene Beteiligung des peripheren Nervensystems als Nebenwirkung der Levodopa-Therapie spricht. Das idiopathische Parkinson-Syndrom geht mit einer Reduktion der kleinen Nervenfasern einher, welche vermutlich auf die Grunderkrankung selbst zurückzuführen ist. Die Untersuchung der Haut erscheint somit vielversprechend für die Erforschung der Pathogenese und für die Differentialdiagnostik des M. Parkinson. / Small- and large-fiber-neuropathy in Parkinson's disease

The thesis provides insights in reconstruction and analysis pipelines for processing of three-dimensional cell and vessel images of megakaryopoiesis in intact murine bone. The images were captured in a Light Sheet Fluorescence Microscope. The work presented here is part of Collaborative Research Centre (CRC) 688 (project B07) of the University of Würzburg, performed at the Rudolf-Virchow Center. Despite ongoing research within the field of megakaryopoiesis, its spatio-temporal pattern of megakaryopoiesis is largely unknown. Deeper insight to this field is highly desirable to promote development of new therapeutic strategies for conditions related to thrombocytopathy as well as thrombocytopenia. The current concept of megakaryopoiesis is largely based on data from cryosectioning or in vitro studies indicating the existence of spatial niches within the bone marrow where specific stages of megakaryopoiesis take place. Since classic imaging of bone sections is typically limited to selective two-dimensional views and prone to cutting artefacts, imaging of intact murine bone is highly desired. However, this has its own challenges to meet, particularly in image reconstruction. Here, I worked on processing pipelines to account for irregular specimen staining or attenuation as well as the extreme heterogeneity of megakaryocyte morphology. Specific challenges for imaging and image reconstruction are tackled and solution strategies as well as remaining limitations are presented and discussed. Fortunately, modern image processing and segmentation strongly benefits from continuous advances in hardware as well as software-development. This thesis exemplifies how a combined effort in biomedicine, computer vision, data processing and image technology leads to deeper understanding of megakaryopoiesis. Tailored imaging pipelines significantly helped elucidating that the large megakaryocytes are broadly distributed throughout the bone marrow facing a surprisingly dense vessel network. No evidence was found for spatial niches in the bone marrow, eventually resulting in a revised model of megakaryopoiesis. / Im Rahmen dieses Dissertationsvorhabens wurden Segmentierungs- und Auswertepipelines dreidimensionaler Bilder von Zellen und Gefäßen im intakten Mausknochen erarbeitet. Die Bilder entstanden durch Fluoreszenzaufnahmen eines Lichtblattmikroskops. Das Dissertationsvorhaben war Teil des Sonderforschungsbereichs 688 (Teilprojekts B07) der Universität Würzburg und es wurde am Rudolf-Virchow-Zentrum durchgeführt. Trotz einer Vielzahl aktueller Forschungsprojekte auf dem Gebiet der Megakaryopoese sind Erkenntnisse über deren räumlich-zeitliche Zusammenhänge größtenteils unbekannt. Neuere wissenschaftliche Erkenntnisse auf diesem Gebiet wären insbesondere hilfreich für die Weiterentwicklung von Behandlungsstrategien für Patienten, die an Thrombozytopenien oder Thrombozytopathien leiden. Das aktuell vorherrschende Modell zur Erklärung der Megakaryopoese geht von der Existenz räumlicher Nischen im Knochenmark aus, in denen sich die einzelnen Schritte der Megakaryopoese vollziehen. Dieses Modell basiert hauptsächlich auf Auswertungen von Gefrierschnitten sowie in-vitro Experimenten. Da die klassische Bildgebung von Knochenschnitten nur auf eine bestimmte Anzahl zweidimensionaler Schnitte begrenzt ist und deren Qualität unter Schnittartefakten leidet, ist die Bildgebung des intakten Knochens von besonderem Interesse. Dennoch führt dies zu neuen Herausforderungen im Bereich der Bilddatenauswertung. Im vorliegenden Dissertationsvorhaben beschäftige ich mich in diesem Bereich mit der Erarbeitung von Auswerteprotokollen, welche beispielsweise den Einfluss unregelmäßiger Färbungen oder Signalabschwächungen sowie die extreme Heterogenität der Megakaryozytenmorphologie berücksichtigen. Spezifische Herausforderungen für die Bildgebung und Bildrekonstruktion werden in Angriff genommen und Lösungsstrategien sowie verbleibende Einschränkungen werden vorgestellt und diskutiert. Erfreulicherweise profitieren insbesondere die moderne Bildbearbeitung sowie die Objekterkennung in großem Ausmaß von fortlaufenden Entwicklungen aus dem Hard- sowie Softwarebereich. Dieses Dissertationsvorhaben zeigt auf exemplarische Art und Weise auf, wie gemeinsame Forschungsanstrengungen im Bereich der Biomedizin, des Maschinellen Sehens, der Datenverarbeitung sowie der Bildtechnologie zu einem tieferen Verständnis der Megakaryopoese führen. Die maßgeschneiderten Pipelines zur Bilddatenauswertung stützten letztlich die These, dass größere Megakaryozyten im Knochenmark breit verteilt sind und von einem überraschend dichten Gefäßnetz umgeben sind. Beweise für die Existenz räumlicher Nischen im Knochenmark konnten nicht gefunden warden. Dieses führte schließlich zur Vorstellung eines überarbeiteten Modells der Megakaryopoese.

Thesis (doctoral)--Rupertus Carola University, 2001. / Includes bibliographical references.

Konstanz, Univ., Diplomarb., 2002.

Stuttgart, Univ., Diss., 2005.

Techn. University, Diss., 2001--Berlin.

Techn. Hochsch., Diss., 2001--Aachen.

Universiẗat, Diss., 2001--Jena.

Tierärztl. Hochsch., Diss., 2004--Hannover.

The resolution of fluorescence light microscopy was long believed to be limited by the diffraction limit of light of around 200-250 nm described in 1873 by Ernst Abbe. Within the last decade, several approaches, such as structured illumination microscopy (SIM), stimulated emission depletion STED and (direct) stochastic optical reconstruction microscopy (d)STORM have been established to bypass the diffraction limit. However, such super-resolution techniques enabling a resolution <100 nm require specialized and expensive setups as well as expert knowledge in order to avoid artifacts. They are therefore limited to specialized laboratories. Recently, Boyden and colleagues introduced an alternate approach, termed expansion microscopy (ExM). The latter offers the possibility to perform superresolution microscopy on conventional confocal microscopes by embedding the sample into a swellable hydrogel that is isotropically expanded. Since its introduction in 2015, expansion microscopy has developed rapidly offering protocols for 4x, 10x and 20x expansion of proteins and RNA in cells, tissues and human clinical specimens. Mitochondria are double membrane-bound organelles and crucial to the cell by performing numerous tasks, from ATP production through oxidative phosphorylation, production of many important metabolites, cell signaling to the regulation of apoptosis. The inner mitochondrial membrane is strongly folded forming so-called cristae. Besides being the location of the oxidative phosphorylation and therefore energy conversion and ATP production, cristae have been of great interest because changes in morphology have been linked to a plethora of diseases from cancer, diabetes, neurodegenerative diseases, to aging and infection. However, cristae imaging remains challenging as the distance between two individual cristae is often below 100 nm. Within this work, we demonstrate that the mitochondrial creatine kinase MtCK linked to fluorescent protein GFP (MtCK-GFP) can be used as a cristae marker. Upon fourfold expansion, we illustrate that our novel marker enables visualization of cristae morphology and localization of mitochondrial proteins relative to cristae without the need for specialized setups. Furthermore, we show the applicability of expansion microscopy for several bacterial pathogens, such as Chlamydia trachomatis, Simkania negevensis, Neisseria gonorrhoeae and Staphylococcus aureus. Due to differences in bacterial cell walls, we reveal important aspects for the digestion of pathogens for isotropic expansion. We further show that expansion of the intracellular pathogens C. trachomatis and S. negevensis, enables the differentiation between the two distinct developmental forms, catabolic active reticulate bodies (RB) and infectious elementary bodies (EB), on a conventional confocal microscope. We demonstrate the possibility to precisely locate chlamydial effector proteins, such as CPAF or Cdu1, within and outside the chlamydial inclusion. Moreover, we show that expansion microscopy enables the investigation of bacteria, herein S. aureus, within LAMP1 and LC3-II vesicles. With the introduction of the unnatural α-NH2-ω-N3-C6-ceramide, we further present the first approach for the expansion of lipids that may also be suitable for far inaccessible molecule classes like carbohydrates. The efficient accumulation and high labeling density of our functionalized α-NH2-ω-N3-C6-ceramide in both cells and bacteria enables in combination with tenfold expansion nanoscale resolution (10-20 nm) of the interaction of proteins with the plasma membrane, membrane of organelles and bacteria. Ceramide is the central molecule of the sphingolipid metabolism, an important constituent of cellular membranes and regulates many important cellular processes such as differentiation, proliferation and apoptosis. Many studies report about the importance of sphingolipids during infection of various pathogens. While the transport of ceramide to Chlamydia has been reported earlier, one of the unanswered questions remaining was if ceramide forms parts of the outer or inner bacterial membrane. Expansion of α-NH2-ω-N3-C6-ceramide enabled the visualization of ceramide in the inner and outer membrane of C. trachomatis and their distance was determined to be 27.6 ± 7.7 nm. / Aufgrund der Beugungseigenschaften des Lichtes wurde bereits 1873 durch Ernst Abbe für die Lichtmikroskopie eine theoretische Auflösungsgrenze von 200-250 nm definiert. Durch die Einführung verschiedener hochauflösender Mikroskopiemethoden, wie beispielsweise SIM-Mikroskopie (structured illumination microscopy), STED-Mikroskopie (stimulated emission depletion) und (d)STORM-Mikroskopie ((direct) stochastic optical reconstruction microscopy), konnte im letzten Jahrzehnt jedoch die Auflösung auf unter 100 nm verbessert werden. Allerdings benötigen solche Hochauflösungstechniken sowohl spezialisierte und kostenintensive Geräte als auch Expertenwissen zur Vermeidung von Artefakten, sodass diese nur in wenigen Laboren angewendet werden können. Ein alternativer Ansatz, die sogenannte Expansionsmikroskopie, wurde kürzlich von der Arbeitsgruppe um Ed Boyden etabliert. Hierbei wird eine Probe mit einem quellfähigen Gel vernetzt, welches daraufhin isotrop expandiert wird, sodass auch an konventionellen konfokalen Mikroskopen Hochauflösung ermöglicht wird. Seit ihrer Einführung im Jahre 2015 hat sich die Expansionsmikroskopie schnell entwickelt und bietet Protokolle für 4-fache, 10-fache oder sogar 20-fache Expansion von Proteinen als auch RNA in Zellen oder sogar komplexen Geweben. Mitochondrien besitzen zwei Membranen und sind für die Zelle von großer Bedeutung, da sie eine Vielzahl wichtiger Aufgaben übernehmen - von der ATP-Produktion durch die oxidative Phosphorylierung über die Produktion vieler wichtiger Metabolite bis hin zur Regulation zellulärer Signalwege. Die innere Mitochondrienmembran ist stark gefaltet und bildet Einstülpungen, die sogenannten Cristae, in welchen die oxidative Phosphorylierung und somit die Energieumwandlung und ATP-Synthese stattfindet. Morphologische Veränderungen der Cristae können sowohl beim Altern von Zellen, als auch bei verschiedenen Infektionen beobachtet werden und können darüber hinaus auch im Rahmen diverser Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, Diabetes oder neurodegenerativen Erkrankungen auftreten. Die Visualisierung der Cristae durch Fluoreszenzmikroskopie ist herausfordernd, da der Abstand zwischen einzelnen Cristae oftmals unter 100 nm beträgt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Expression der mitochondrialen Kreatinkinase gekoppelt an das Fluoreszenzprotein GFP (MtCK-GFP) als Cristaemarker genutzt werden kann. In Kombination mit vierfacher Expansion ermöglicht unser Marker die Untersuchung morphologischer Veränderungen von Cristae, sowie die Lokalisierung mitochondrialer Proteine relativ zu den Cristae. Darüber hinaus wird im Rahmen dieser Arbeit die Anwendbarkeit der Expansionsmikroskopie für mehrere bakterielle Pathogene, und zwar Chlamydia trachomatis, Simkania negevensis, Neisseria gonorrhoeae und Staphylococcus aureus, gezeigt. Hierbei verdeutlichen wir wichtige Aspekte für den vollständigen Verdau unterschiedlicher bakterieller Zellwände und somit isotropen Expansion. Die Expansion der intrazellulären Pathogene C. trachomatis und S. negevensis ermöglichte es uns an konventionellen konfokalen Mikroskopen zwischen den zwei verschiedenen Entwicklungsstadien, der katabolisch aktiven Retikulärkörperchen (RBs) und der infektiösen Elementarkörperchen (EBs), zu unterscheiden. Außerdem konnte die Möglichkeit der präzisen Lokalisierung chlamydialer Proteine wie CPAF und Cdu1 innerhalb und außerhalb der chlamydialen Inklusion gezeigt werden und Bakterien, in diesem Fall S. aureus, in LAMP1 und LC3-II Vesikeln visualisiert werden. Mit der Einführung des unnatürlichen α-NH2-ω-N3-C6-Ceramides, präsentieren wir zudem ein erstes Konzept für die Expansion von Lipiden, welches möglicherweise auch für deutlich unzugänglichere Molekülklassen wie beispielsweise Kohlehydrate geeignet ist. Die effiziente Akkumulierung unseres funktionalisierten α-NH2-ω-N3-C6-Ceramides in Zellen sowie Bakterien ermöglicht in Kombination mit zehnfacher Expansion die Untersuchung der Interaktion von Proteinen mit der Zellmembran, Membranen von Organellen und Bakterien mit einer räumlichen Auflösung von 10-20 nm. Ceramid ist das zentrale Molekül des Sphingolipidstoffwechsels, ein wichtiger Baustein zellulärer Membrane und reguliert viele essentielle Prozesse wie die Zelldifferenzierung, die Proliferation als auch die Apoptose. Viele Studien berichten von der Bedeutung der Sphingolipide während der Infektion verschiedener Pathogene. So wurde beispielsweise zuvor berichtet, dass Ceramide aktiv zu Chlamydien transportiert und in deren Membranen eingebaut werden. Hierbei verblieb allerdings die Frage, ob Ceramide in der äußeren oder inneren bakteriellen Membran lokalisiert sind. Die Expansion unseres α-NH2-ω-N3-C6-Ceramides ermöglichte es uns Ceramide in der inneren und äußeren Membran von C. trachomatis zu visualisieren und den Abstand zwischen beiden Membranen auf 27.6 ± 7.7 nm zu bestimmen.