Actin is one of the most abundant and highly conserved proteins in eukaryotic cells. The globular protein assembles into long filaments, which form a variety of different networks within the cytoskeleton. The dynamic reorganization of these networks - which is pivotal for cell motility, cell adhesion, and cell division - is based on cycles of polymerization (assembly) and depolymerization (disassembly) of actin filaments. Actin binds ATP and within the filament, actin-bound ATP is hydrolyzed into ADP on a time scale of a few minutes. As ADP-actin dissociates faster from the filament ends than ATP-actin, the filament becomes less stable as it grows older. Recent single filament experiments, where abrupt dynamical changes during filament depolymerization have been observed, suggest the opposite behavior, however, namely that the actin filaments become increasingly stable with time. Several mechanisms for this stabilization have been proposed, ranging from structural transitions of the whole filament to surface attachment of the filament ends. The key issue of this thesis is to elucidate the unexpected interruptions of depolymerization by a combination of experimental and theoretical studies. In new depolymerization experiments on single filaments, we confirm that filaments cease to shrink in an abrupt manner and determine the time from the initiation of depolymerization until the occurrence of the first interruption. This duration differs from filament to filament and represents a stochastic variable. We consider various hypothetical mechanisms that may cause the observed interruptions. These mechanisms cannot be distinguished directly, but they give rise to distinct distributions of the time until the first interruption, which we compute by modeling the underlying stochastic processes. A comparison with the measured distribution reveals that the sudden truncation of the shrinkage process neither arises from blocking of the ends nor from a collective transition of the whole filament. Instead, we predict a local transition process occurring at random sites within the filament. The combination of additional experimental findings and our theoretical approach confirms the notion of a local transition mechanism and identifies the transition as the photo-induced formation of an actin dimer within the filaments. Unlabeled actin filaments do not exhibit pauses, which implies that, in vivo, older filaments become destabilized by ATP hydrolysis. This destabilization can be identified with an acceleration of the depolymerization prior to the interruption. In the final part of this thesis, we theoretically analyze this acceleration to infer the mechanism of ATP hydrolysis. We show that the rate of ATP hydrolysis is constant within the filament, corresponding to a random as opposed to a vectorial hydrolysis mechanism. / Aktin ist eines der am häufigsten vorkommenden und am stärksten konservierten Proteine in eukaryotischen Zellen. Dieses globuläre Protein bildet lange Filamente, die zu einer großen Vielfalt von Netzwerken innerhalb des Zellskeletts führen. Die dynamische Reorganisation dieser Netzwerke, die entscheidend für Zellbewegung, Zelladhäsion, und Zellteilung ist, basiert auf der Polymerisation (dem Aufbau) und der Depolymerisation (dem Abbau) von Aktinfilamenten. Aktin bindet ATP, welches innerhalb des Filaments auf einer Zeitskala von einigen Minuten in ADP hydrolysiert wird. Da ADP-Aktin schneller vom Filamentende dissoziiert als ATP-Aktin, sollte ein Filament mit der Zeit instabiler werden. Neuere Experimente, in denen abrupte dynamische Änderungen während der Filamentdepolymerisation beobachtet wurden, deuten jedoch auf ein gegenteiliges Verhalten hin: Die Aktinfilamente werden mit der Zeit zunehmend stabiler. Mehrere Mechanismen für diese Stabilisierung wurden bereits vorgeschlagen, von strukturellen Übergängen des gesamten Filaments bis zu Wechselwirkungen der Filamentenden mit dem experimentellen Aufbau. Das zentrale Thema der vorliegenden Dissertation ist die Aufklärung der unerwarteten Unterbrechungen der Depolymerisation. Dies geschieht durch eine Kombination von experimentellen und theoretischen Untersuchungen. Mit Hilfe neuer Depolymerisationexperimente mit einzelnen Filamenten bestätigen wir zunächst, dass die Filamente plötzlich aufhören zu schrumpfen und bestimmen die Zeit, die von der Einleitung der Depolymerisation bis zum Auftreten der ersten Unterbrechung vergeht. Diese Zeit unterscheidet sich von Filament zu Filament und stellt eine stochastische Größe dar. Wir untersuchen daraufhin verschiedene hypothetische Mechanismen, welche die beobachteten Unterbrechungen verursachen könnten. Die Mechanismen können experimentell nicht direkt unterschieden werden, haben jedoch verschiedene Verteilungen für die Zeit bis zur ersten Unterbrechung zur Folge. Wir berechnen die jeweiligen Verteilungen, indem wir die zugrundeliegenden stochastischen Prozesse modellieren. Ein Vergleich mit der gemessenen Verteilung zeigt, dass der plötzliche Abbruch des Depolymerisationsprozesses weder auf eine Blockade der Enden, noch auf einen kollektiven strukturellen Übergang des gesamten Filaments zurückzuführen ist. An Stelle dessen postulieren wir einen lokalen Übergangsprozess, der an zufälligen Stellen innerhalb des Filaments auftritt. Die Kombination von weiteren experimentellen Ergebnissen und unserem theoretischen Ansatz bestätigt die Vorstellung eines lokalen Übergangsmechanismus und identifiziert den Übergang als die photo-induzierte Bildung eines Aktindimers innerhalb des Filaments. Nicht fluoreszenzmarkierte Aktinfilamente zeigen keine Unterbrechungen, woraus folgt, dass ältere Filamente in vivo durch die ATP-Hydrolyse destabilisiert werden. Die Destabilisierung zeigt sich durch die Beschleunigung der Depolymerisation vor der Unterbrechung. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit untersuchen wir diese Beschleunigung mit theoretischen Methoden, um auf den Mechanismus der ATP-Hydrolyse zu schließen. Wir zeigen, dass die Hydrolyserate von ATP innerhalb des Filaments konstant ist, was dem sogenannten zufälligen Hydrolysemechanismus entspricht und im Gegensatz zum sogenannten vektoriellen Mechanismus steht.

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Die vorliegende Arbeit befasst sich mit zwei neuen methodischen Ansätzen auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie. Im ersten Teil der Arbeit wir eine Methode vorgestellt, mit der die Winkelselektivität der Fluoreszenzanregung verbessert werden kann. Die ExPAN (excitation polarization angle narrowing) genannte Technik nutzt stimulierte Emission, um den Effekt der Photoselektion zu vergrößern. ExPAN lässt sich potentiell für verschiedene Methoden einsetzen, in denen fluoreszenzmarkierte Proben untersucht werden und ist insbesondere im Kontext von Fluoreszenzanisotropie-Messungen oder der Bestimmung von molekularen Orientierungen von Interesse. Solche Methoden finden in den Biowissenschaften breite Anwendung und werden z.B. zum Studium von Rezeptor-Liganden-Interaktionen oder der Proteindynamik eingesetzt. Im Rahmen der Arbeit wird ExPAN in Kombination mit einem neuen Ansatz in der Weitfeldmikroskopie untersucht, bei der die Orientierung von Farbstoffmolekülen als Kontrastmechanismus genutzt wird. Dabei wird die Polarisationsrichtung des Anregungslichts rotiert, um Informationen über die molekulare Orientierung zu gewinnen. Aufgrund der Photoselektion weist das Fluoreszenzsignal von Molekülen mit bevorzugter Ausrichtung dadurch eine periodische Modulation auf. Es wird gezeigt, dass diese Information zur Unterscheidung von Molekülen mit abweichender Orientierung genutzt werden kann, selbst wenn sich deren Signale räumlich überlagern. Für die Versuche wurde ein modifiziertes Weitfeld-Mikroskop konstruiert und die Methode zum einen experimentell an Einzelmolekülen und zum anderen mittels Simulationen erprobt. Dabei konnten Signale von Farbstoffmolekülen mit einem Abstand von bis zu 80 nm separiert werden. Darüber hinaus wurde ein moduliertes Fluoreszenzsignal bei oberflächenmarkierten Mikropartikeln in wässriger Lösung sowie bei fixierten biologischen Proben beobachtet. Eine Verbesserung der Photoselektion durch ExPAN wird experimentell nachgewiesen und gezeigt, dass mit ExPAN auch ähnlich orientierte Moleküle unterschieden werden können. Im zweiten Teil der Arbeit wird eine Methode zur Verbesserung der Auflösung von konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen vorgestellt, die als Multidetektor-Scanning (MDS) bezeichnet wird und auf dem Prinzip der Image-Scanning-Mikroskopie (ISM) beruht. Mit ISM lässt sich die Auflösung von Fluoreszenzmikroskopen theoretisch verdoppeln. Da ISM einen Flächendetektor voraussetzt, wurden in der Vergangenheit hauptsächlich CCD oder CMOS Kameras als Detektoren eingesetzt. In dieser Arbeit werden anstelle einer Kamera mehrere Einzelphotonendetektoren verwendet und über ein Glasfaserbündel zu einem Flächendetektor kombiniert. Dadurch ist es erstmals möglich, die Methode in Verbindung mit Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM) einzusetzen. FLIM hat sich in den Biowissenschaften als wichtige Mikroskopie-Technik etabliert und wird unter anderem bei Protein-Protein-Interaktionsstudien oder zur Untersuchung des NADH-Metabolismus eingesetzt. Die Verbesserung der räumlichen Auflösung von FLIM mit MDS ist somit für eine Reihe von biologischen Fragestellungen von potentiellem Interesse. Im Rahmen der Arbeit wurde ein Multidetektor-Scanning-Mikroskop konstruiert und durch die Vermessung von fluoreszierenden Mikropartikeln charakterisiert. Eine Verbesserung der Auflösung durch MDS wird an fixierten biologischen Proben demonstriert. Dabei wurde eine Auflösung von 168 nm mit MDS sowie 146 nm mit MDS und Dekonvolution erreicht. Schließlich wird die Kombination der Methode mit Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie demonstriert.

Endgültig fehlgefaltete oder anderweitig beschädigte Proteine des Endoplasmatischen Retikulums (ER) werden durch das Proteasom in einem Prozess abgebaut, der als Endoplasmatischer Retikulum Assoziierter Abbau (ERAD) bezeichnet wird. Der Hrd1-Komplex ist ein aus mehreren Komponenten bestehender Transmembran-Proteinkomplex, der die Ubiquitinierung und den Export von Proteinen aus dem ER vermittelt, welche dann im Zytosol abgebaut werden. Trotz erheblicher Anstrengungen in den letzten zwei Jahrzehnten führte die biochemische Charakterisierung seiner Architektur und seines Mechanismus zu inkonsistenten und sogar widersprüchlichen Ergebnissen, sodass kein Konsens darüber besteht, wie Hrd1 den Proteintransport realisiert. In diesem Projekt habe ich Fluoreszenz-Mehrfarben-Einzelmolekül-Mikroskopie verwendet, um eine neue Perspektive auf die Architektur, Bildung und Dynamik des Hrd1-Komplexes zu eröffnen. Im Projektverlauf habe ich zellbiologische, experimentelle und analytische Werkzeuge entwickelt, um die Hrd1-Oligomerisierung in vivo robust zu quantifizieren und zu charakterisieren. Durch die Kombination von Mehrfarben-Einzelmolekül-Mikroskopie mit chemischer Inhibierung, der Herunterregulierung anderer Komplexkomponenten und einem neuartigen, auf Bindungswettbewerb basierenden Assay konnte ich nachweisen, dass Hrd1 ein stabiles Homo-Tetramer bildet, das über seine zytosolische Domäne Hrd1480-529 geformt wird. Durch Strukturmodellierung über AlphaFold konnte ich nachweisen, dass sich diese Domäne unabhängig von anderen Komplexkomponenten oder der Aktivität von Hrd1 zu einer kanonischen „coiled-coil“ Domäne zusammensetzt. Während diese Arbeit neue spezifische biologische Einblicke in die Hrd1-Komplexbildung liefert, dient sie auch als allgemeine Blaupause dafür, wie Einzelpartikel-Tracking verwendet werden kann, um Fragen zu beantworten, die mit klassischer Biochemie in der Regel nur begrenzt untersucht werden können. / Terminally misfolded or otherwise damaged proteins of the Endoplasmic Reticulum (ER) are degraded by the proteasome in a process termed Endoplasmic Reticulum Associated Degradation (ERAD). The Hrd1 complex is a multicomponent transmembrane protein complex that mediates ubiquitination and export of proteins from the ER to be degraded in the cytosol. Despite substantial effort in the past two decades, the biochemical characterization of its architecture and mechanism produced inconsistent and even contradictory results, yielding no consensus on how it mediates protein transport. Its elusive nature is representative of the limitations of classical biochemical approaches, whose often harsh experimental conditions directly interfere with the objects they study. In this project I used fluorescence multi-color single molecule microscopy to offer a new perspective on the architecture, formation and dynamics of the Hrd1 complex. In this process I developed cell biological, experimental and analytical tools to robustly quantify and characterize Hrd1 oligomerization in vivo. Combining live-cell dual-color single-particle tracking with chemical inhibition, downregulation of complex components and a novel, binding-competition based tracking assay, I demonstrated that Hrd1 forms a stable homo-tetramer via its cytosolic domain Hrd1480-529. By structural modeling via AlphaFold, results of which were validated with both single-particle tracking and recombinant protein expression, I showed that this domain assembles into a canonical coiled-coil domain independently of other complex components or Hrd1's activity. While yielding specific novel biological insight into Hrd1 complex formation, it also serves as a general blueprint on how dual-color single particle tracking can be used to address questions that bring classical biochemistry to its limits.

In numerous Gram-negative and Gram-positive bacteria as well as in Archaea SL proteins form the outermost layer of the cell envelope. SL (glyco)monomers self-assemble with oblique (p2), tetragonal (p4), or hexagonal (p3, p6) symmetries [12]. SL subunits interact with each other and with the underlying cell surface by relatively weak non-covalent forces such as hydrogen-bonds, ionic bonds, salt-bridges or hydrophobic interactions. This makes them easy to isolate by applying chaotropic agents like urea and guanidine hydrochloride (GuHCl), chelating chemicals, or by changing the pH of the environment [10]. Upon dialysis in an ambient buffer monomers recrystallize into regular arrays that possess the forms of flat sheets, open ended cylinders, or spheres on solid substrates, at air-water intefaces and on lipid films, making them appealing for nanobiotechnological applications [3, 18]. The aim of this study was to investigate the structure, thermal stability, in vivo self-assembly process, recrystallization and metallization of three different recombinant SL proteins (SslA-eGFP, mSbsC-eGFP and S13240-eGFP) expressed in yeast S. cerevisiae BY4741 which could be further used in nanobiotechnological applications. In order to fulfill this aim, I investigated the in vivo expression of SL proteins (SslA, SbsC, S13240) tagged with eGFP (SL-eGFP) in the yeast S. cerevisiae BY4141. First, I characterized the heterologous expression of SL fusion constructs with growth and fluorescence measurements combined with Western blot analyses. Fluorescence microscopy investigations of overnight grown cultures showed that SslA-eGFP fusion protein was expressed as fluorescent patches, mSbsC-eGFP as tubular networks, and S13240-eGFP as hollow-like fibrillar network structures, while eGFP did not show any distinct structure Thermal stability of in vivo expressed SL-eGFP fusion proteins were investigated by fluorescence microscopy and immunodetection. In vivo self-assembly kinetics during mitosis and meiosis was the second main issue. In parallel, association of in vivo mSbsC-eGFP structures with the cellular components was of interest. A network of tubular structures in the cytosol of the transformed yeast cells that did not colocalize with microtubules or the actin cytoskeleton was observed. Time-resolved analysis of the formation of these structures during vegetative growth and sporulation was investigated by live fluorescence microscopy. While in meiosis ascospores seemed to receive assembled structures from the diploid cells, during mitosis surface layer structures were formed de novo in the buds. Surface layer assembly always started with the appearance of a dot-like structure in the cytoplasm, suggesting a single nucleation point. In order to get these in vivo SL assemblies stably outside the cells (in situ), cell distruption experiments were conducted. The tubular structures formed by the protein in vivo were retained upon bursting the cells by osmotic shock; however their average length was decreased. During dialysis, monomers obtained by treatment with chaotropic agents recrystallized again to form tube-like structures. This process was strictly dependent on calcium ions, with an optimal concentration of 10 mM. Further increase of the Ca2+ concentration resulted in multiple non-productive nucleation points. It was further shown that the lengths of the S-layer assemblies increased with time and could be controlled by pH. After 48 hours the average length at pH 9.0 was 4.13 µm compared to 2.69 µm at pH 5.5. Successful chemical deposition of platinum indicates the potential of recrystallized mSbsC-eGFP structures for nanobiotechnological applications. For example, such metalized protein nanotubes could be used in conductive nanocircuit technologies as nanowires.

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Diese Arbeit beschreibt die Untersuchung der Diffusion in dünnen Flüssigkeitsfilmen auf festen Oberflächen mit Methoden der Einzelmoleküldetektion. Anhand von Computersimulationen wird die Spotgrößenanalyse als neue Methode zur Analyse von Diffusionsprozessen vorgestellt. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Diffusion von Farbstoffen in ultradünnen Flüssigkeitsfilmen stark verlangsamt ist. In einem ca. 3 nm dicken Film aus Tetrakis(2-ethyl-hexoxy)-silan werden Diffusionsprozesse beobachtet, die durch Sprünge zwischen Bereichen mit diskreten Werten der Diffusionskonstante gekennzeichnet sind. Die Existenz diskreter Werte der Diffusionskonstante kann durch die Ausbildung von Flüssigkeitsschichten molekularer Dicke (Liquid Layering) erklärt werden. Die Spotgrößenanalyse erweist sich als unabhängige Methode zur Bestimmung der Diffusionskonstante diffundierender Moleküle. Gegenüber der etablierten Bestimmung der Diffusionskonstante aus Trajektorien diffundierender Moleküle durch Berechnung der mittleren quadratischen Verschiebung bietet die Spotgrößenanalyse eine höhere statistische Genauigkeit und die Möglichkeit, Änderungen der Diffusionskonstante instantan zu detektieren.