Veränderungen an der Zelloberfläche werden in der Hefe S. cerevisiae über die in der Plasmamembran lokalisierten Proteine Wsc1-Wsc3, Mid2 und Mtl1 wahrgenommen und intrazellulär über eine konservierte MAPK Kaskade innerhalb des Zellintegritätswegs („CWI Wegs“) weitergeleitet. Im Rahmen dieser Arbeit sollten sowohl die Sensoren dieses Signalwegs als auch die drei bekannten Rho1 GEFs Rom1, Rom2 und Tus1 näher charakterisiert und ihr mögliches Zusammenspiel am Beginn der Signalkaskade eingehend beleuchtet werden. Die Analyse der Sensor Einzeldeletionsstämme bestätigte die Annahme, dass Wsc1 und Mid2 die größte Bedeutung für die Aktivierung des CWI Wegs zukommt. Während Wsc1 jedoch aufgrund ausgeprägter Wachstumsdefekte der Einzeldeletion in erster Linie für die Antwort auf äußere Zellwandstress-auslösende Reize erforderlich zu sein scheint, wiesen die Ergebnisse der Wachstumsanalysen auf eine Hauptfunktion von Mid2 bei der Chitinsynthese der Zellen hin. Eine wichtige in vivo Funktion kommt darüber hinaus auch dem Sensor Wsc2 zu, dessen Funktionsverlust zu einer stark verringerten Fitness der entsprechenden Zellen in direkter Konkurrenz zu einem Wildtypstamm führte. Im Gegensatz zu den anderen Sensoren scheinen Wsc3 und Mtl1 für die Aktivierung des Zellintegritätswegs, zumindest während des vegetativen Wachstums, entbehrlich zu sein. Im Einklang mit der Funktion von Mid2 bei der Chitinsynthese konnte eine gleichmäßige, weitestgehend unbewegliche punktuelle Verteilung des Sensors innerhalb der Zelle detektiert werden. Wsc1 und Wsc2 wiesen dagegen eine polare Lokalisierung an Orten des gerichteten Zellwachstums auf, welche vermutlich durch Endozytose aufrechterhalten wird. So ging eine Beeinträchtigung des Internalisierungsprozesses nicht nur mit einer gleichmäßigen Verteilung und einer erhöhten Halbwertszeit dieser beiden Plasmamembranproteine, sondern auch mit einer stark verringerten Fitness der entsprechenden Zellen einher. Obwohl die Sensoren Wsc3 und Mtl1 ebenfalls an Orten des gerichteten Zellwachstums lokalisierten, war ihre polare Verteilung weniger ausgeprägt und unabhängig von der End3 vermittelten Endozytose. Die drei Rho1 GEFs waren ebenfalls polar in der Zelle verteilt. Dennoch konnten mittels Hefe Zwei-Hybrid-Analysen und bimolekularer Fluoreszenzkomplementation lediglich Interaktionen zwischen Rom2 und den Sensoren identifiziert werden, wobei die unterschiedlichen Wechselwirkungs-Orte innerhalb der Zelle auf spezifische, nicht überlappende Funktionen der Sensoren hinweisen. Einzig bei der Pheromon induzierten Morphogenese konnte eine Interaktion des GEFs mit allen Sensoren in den „Shmoo“-Spitzen der Zellen und folglich eine vermeintliche Redundanz der Plasmamembranproteine beobachtet werden. Neben den Erkenntnissen aus den Interaktionsstudien bekräftigten auch die weiteren im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse, dass Rom1 und Tus1 eigenständige Rollen zu besitzen scheinen und somit als mögliche Wechselwirkungspartner der Sensoren höchstwahrscheinlich ausgeschlossen werden können. Schließlich wurde mithilfe der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation auch die postulierte Cluster Bildung des Sensors Wsc1 näher untersucht. Es zeigte sich, dass die Sensormoleküle direkt miteinander interagierten und vermutlich als Oligomere an Orten des polaren Wachstums detektierbar waren. Da die beobachtete Wechselwirkung durch die Mutation einzelner Cysteine der CRD nicht beeinträchtigt wurde, scheint diese Region zwar für die Cluster Bildung, aber nicht für die direkte Interaktion der Sensormoleküle erforderlich zu sein. Neben den Wsc1-Homooligomeren konnten im Rahmen dieser Arbeit zudem Wsc2 Homodimere und Wsc1/Wsc2-Heterodimere beobachtet werden, wobei die Verteilung der Sensordimere mit den Orten übereinstimmte, an welchen eine Wechselwirkung der beiden Plasmamembranproteine mit Rom2 detektiert werden konnte.

The Golgi apparatus is the main crossroad of the intracellular trafficking network in all eukaryotic cells and plays a crucial role in the distribution of cellular material. To ensure the proper sorting and delivery of cargo proteins to their destination while maintaining Golgi homeostasis the coordination of all transport events to and from this organelle is required. Although a cascade of activation events has already been reported for Golgi Ypt/Rab proteins that function in the exocytic pathway, their connection to incoming vesicles from endosomal compartments or to the different Arf mediated vesicle formation machineries has still to be established. In addition, the role of lipids and the interplay between lipid and protein regulators at the Golgi are largely missing. In the present study, we used several approaches to unravel the crosstalk between known regulators of Golgi trafficking and to identify new proteins involved in this process. As starting point, we considered the results from four different screens before focusing on the role of Arf exchange factors. We report two new physical interactors of the late Golgi Arf-GEF Sec7p: the lipid kinase Pik1p and the cyclic nucleotide phosphodiesterase Cpd1p. In addition, our studies on the function of Sec7p revealed additional feature of this protein and it’s relationship to the other yeast Golgi Arf-GEFs. Arf proteins and their regulators play an important role in the formation of vesicles at the exit from the Golgi apparatus. There are three Golgi-localized Arf-GEFs in S.cerevisiae, Sec7p and the redundant Gea1p/Gea2p. While it has been established that Sec7p function does not overlap with the Gea’s, the specific role of these proteins remains unclear. We show that Sec7p colocalizes poorly with the Gea’s, indicating that these proteins activate Arf on different Golgi sub-compartments. In addition, our data suggest that Sec7p mainly promotes the formation of post-Golgi transport vesicles supporting forward transport from the late Golgi while the Gea’s primarily regulate COPI-mediated retrograde traffic. This observation is consistent with published data from mammalian cells and suggests that the spatial and temporal regulation of Arf is conserved from yeast to mammals. Both Arf regulation and phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) metabolism are important factors for Golgi function. Here, we show that the yeast PI4-kinase, Pik1p binds specifically to Sec7p but not Gea1p or Gea2p. Taken together, the physical interaction, the colocalization and similar transport phenotypes of the respective mutants suggests a functional link between Pik1p and Sec7p but not the Gea’s. In addition, Pik1p binds to the catalytic domain of Sec7p and could directly influence the activity of the GEF. We propose that this interaction coordinates Arf activation with PI4P production to generate a highly specific dual recognition system for the recruitment of specific effectors to the late Golgi. Besides its catalytic domain, Sec7p shares several conserved regions with other members of the BIG/GBF Arf-GEF subfamilies, including the N-terminal DCB (Dimerization/Cyclophilin Binding) domain. We show that a single point mutation in the DCB domain of Sec7p efficiently inhibits Arf activation without affecting membrane recruitment of the GEF and could interfere with a possible dimerization of the protein. We identified Cpd1p as an allele specific dosage suppressor of the Sec7p DCB domain mutation. Cpd1p and Sec7p physically interact and both proteins localize independently to the late Golgi. Increased Golgi level of Cpd1p compensates for the loss of interaction due to the mutation in the DCB domain of Sec7p. The catalytic activity of Cpd1p is important for the rescue, indicating an intriguing connection between the Arf activation cycle and ADP-ribose derivates. We also find that Cpd1p interacts with several other proteins involved in Golgi- and post-Golgi transport events. Hence, Cpd1p is a new regulator of vesicular traffic at the Golgi that could act as a scaffolding factor for Sec7p and other transport proteins.

Cells grow in environments that can change suddenly. To cope with unpredictable perturbations, they have evolved mechanisms to adjust their metabolism according to the various types of environmental stress. Cells experiencing starvation, for example, have low energy levels and are forced to lower their metabolism and enter a protective quiescent state to survive until nutrients become available again. Recently, it has been shown that starved yeast cells experience a marked acidification of the cytoplasm, due to a passive influx of protons. This pH drop causes multiple rearrangements in the cytoplasm: increased crowding, reduced mobility of intracellular components and formation of stress-induced non-membrane bound compartments of specific metabolic enzymes. Cytoplasm rearrangements are required for cell survival and can be reversed upon replenishment of energy. However, there is little understanding of how cytoplasmic components reorganize in stressed quiescent cells. Using high-pressure freezing, correlative light and electron microscopy (CLEM) and electron tomography, coupled to high-resolution 3D-reconstruction techniques, I investigate the structural modi cations that happen in situ in yeast cells undergoing quiescence. I observe that the cytoplasm becomes increasingly crowded, due to a massive rearrangement of membranous structures, including accumulation of intracellular vesicles and pronounced invaginations in the plasma membrane. This is proved by quantification of the difference in ribosome densities between stressed and not stressed cells. The increased crowding, coupled to cytoplasm acidification, leads to the formation of non-membrane bound enzyme compartments, that appear as foci and elongated structures of fluorescently tagged enzymes. I prove that the fluorescent structures correspond to bundles of filaments. Among many essential enzymes, known to form mesoscale structure in stressed yeast, I demonstrate that the eukaryotic translation initiation factor 2B (eIF2B) forms bundles of filaments in situ, and the evolutionary conserved glutamine synthetase (Gln1) self-assembles into filaments in vitro. The present study on the energy depleted cytoplasm and the structural analysis of filament-forming enzymes provides insights into an unexplored survival strategy that is used by yeast, as well as other organisms, to cope with extreme environmental conditions and stress.:1 Introduction 1 Stress, survival and quiescence 2 1.1 Cytoplasm and cellular compartments 2 1.2 Membraneless compartmentalization in the cell 3 1.3 Stress-induced non-membrane bound assemblies 4 The quiescent sleeping yeast 6 1.4 The yeast S.cerevisiae as model organism 7 1.5 Growth and metabolism of yeast 9 1.5.1 Yeast eukaryotic translation initiation factor 2B: eIF2B 11 1.5.2 Yeast glutamine synthetase: Gln1 12 3D electron microscopy 14 Aims of the Thesis 18 2 Materials and methods 21 Room temperature electron microscopy (EM) 21 2.1 Yeast strains, media and energy depletion 21 2.2 High-pressure freezing of yeast cells 22 2.2.1 EM sample preparation for untagged eIF2B yeast strains 22 2.2.2 EM sample preparation for GFP-tagged eIF2B yeast strains 23 2.3 Electron tomography 23 2.4 Subtomogram averaging 24 2.5 Fiji script for automated ribosome counting 25 2.6 Immunofluorescence of eIF2B in yeast 26 2.7 Western-blot on yeast ribosomes 27 Single particle procedures 30 2.8 Protein purification protocols 30 2.8.1 Baculovirus-insect cell expression and purification of eIF2B 30 2.8.2 Gradient of fixation for fragile complexes 31 2.8.3 Yeast expression and purification of Gln1 33 2.9 Negative staining 34 2.9.1 Image acquisition and analysis—eIF2B 35 2.9.2 Image acquisition and analysis—Gln1 36 Cryo-electronmicroscopy(cryo-EM) 37 2.10 Plunge freezing 37 2.11 Image acquisition and 3D reconstruction 37 3 Results Visualizing yeast’s cytoplasmic reorganization 39 3.1 Quiescence is accompanied by reorganization of the cytoplasm 40 3.2 Ribosome density proves cytoplasmic crowding in starved cells 42 3.3 eIF2B organizes in bundles of filaments in energy-depleted cells 45 3.4 eIF2B filaments are polymers of the eIF2B complex 47 3.5 Filaments are found in wild-type energy-depleted cells 49 Structural analysis of filament forming enzymes 51 3.6 Purification of eIF2B complexes 51 3.7 Single particle analysis of eIF2B 53 3.8 Purification of Gln1 complexes 55 3.9 Single particle analysis of Gln1 56 3.10 Gln1 forms filaments in vitro 58 4 Discussion and Outlook 59 4.1 Yeast cytoplasm reorganizes in response of stress 59 4.2 Ribosomes density is a measure of increased macromolecular crowding 60 4.3 eIF2B forms filaments as a survival strategy 62 4.4 Molecular analysis of filament forming enzymes 64 4.5 Outlook 65 Appendix 67 Bibliography 83

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Ganzzellsensoren sind potentielle Kandidaten für den Einsatz in der Umwelttechnik zur Detektion von Schwermetallen, organischen Lösungsmitteln oder Xenobiotika. Ebenso können mit ihrer Hilfe andauernde Prozesse, wie z.B. in der Biogasentwicklung, überwacht werden. Etablierte, auf Genexpression basierende Ausleseverfahren besitzen unterschiedliche Nachteile, die den Einsatz bisher weitestgehend auf das Labor beschränken. In der vorliegenden Arbeit wurden dazu drei alternative Auslesemöglichkeiten evaluiert, die durch kostengünstige Messverfahren und einem einfachen experimentellen Aufbau realisiert werden können. Die gezielte Morphologieänderung von Sensorhefen, die analytinduzierte Aggregation von Zellen und die analytabhängige Anlagerung von Goldnanopartikeln an Sensorhefen. Während sich die zwei erstgenannten Verfahren derzeit noch in Entwicklungszustand befinden, konnte durch die Anlagerung von Goldnanopartikeln an Sensorhefen der Wirkstoff Diclofenac erfolgreich detektiert werden. Die dazu notwendige Inkubationsdauer der Sensorhefen mit Diclofenac als auch das Detektionslimit wurde im Vergleich zu veröffentlichten Daten um je eine Größenordnung verringert.

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Ziel dieser Arbeit war es, den zentralen Kohlenstoffwechsel mit besonderem Fokus auf Regulation zu untersuchen, insbesondere durch die Auftrennung von zwei Regulationsebenen: metabolische Regulation, assoziiert mit direkten Wech- selwirkungen zwischen Metaboliten und Enzymen, sowie hierarchische Regulation, assoziiert mit Änderungen in Enzymmengenänderungen durch die Regulation von de novo Enzymproduktion. Unsere Untersuchungen basieren größtenteils auf drei Datensätzen aus glukoselimitierten Chemostatkulturen von S. cerevisiae. Im Kap. 2 wurden Extrazelluläre Bedingungen im Makroskopischen unter- sucht. Das wichtigsten Ergebnis dieser the- oretischen Analyse ist die Charakterisierung des Selektionsdruckes in einem Chemostatkultur. Im Kap. 4 wurde eine Analyse auf Systemebene des zentralen Kohlenstoffwech- sels durchgeführt. Unter Verwendung der Metaboliten- und der Flußdaten wurde ein kinetisches Modell konstruiert, welches wesentliche Teile des zentralen Kohlen- stoffwechsels umfaßt. Die meisten kinetischen Ausdrücke und Parameterwerte wurden aus einem bestehenden kinetischen Modells (Teusink-Modell) übernom- men. / In this work, we aimed to elucidate central carbon metabolism focusing on the aspect of regulation, especially by separating two regulatory levels: metabolic regulation, associated with direct interactions of metabolites and enzymes, and hierarchic regulation, associated with enzyme level change via regulation of de novo enzyme production. Our investigations were largely based on the analysis of three datasets from glucose limited continuous cultures of S. cerevisiae. Extracellular conditions on the macroscopic scale were investigated in Chapter 2. This was inspired by the perceived lack of clarity regarding an important aspect: concentration of glucose, the limiting nutrient and main carbon source in these cultures. The main outcome of this theoretical analysis was characterisation of the selection pressure in a chemostat culture, as selecting for cells which produce the growth rate, defined by the pre-set dilution rate, with lower external concentration of the limiting nutrient. Flux regulation on the scale of individual enzymes was investigated for selected reactions in Chapter 3. This analysis was based on the attempt to reproduce flux changes through these reactions, using enzyme kinetic expressions with inputs from the three aforementioned datasets. The notion of hierarchic and metabolic regulation was introduced and modified. System-level analysis of central carbon metabolism was undertaken in Chap- ter 4. Using the information on metabolite levels and flux, a kinetic model representing significant parts of central carbon metabolism was constructed. To get feasible flux distributions, constrained metabolic flux balance analysis was performed, using a stoichiometric network, constructed to be consistent with the model’s stoichiometry. Fitting the model resulted in two sets of parameters corresponding to steady states reproducing, the nominal data values of the anaerobic and the fully aerobic conditions.

Wenn Hefe in einer kontinuierlichen Kultur wächst, kommt es zu einer spontanen Synchronisation der Zellen resultierend in einer stabilen respiratorischen Oszillation. Sowohl weite Teile des Transkriptoms als auch des Metaboloms oszillieren in klaren Phasenbeziehungen zu dieser respiratorischen Aktivität. In dieser Arbeit wird das Phänomen sowohl von theoretischer als auch experimenteller Seite untersucht. Es wird die Dynamik des Lipidoms analysiert und gezeigt, dass dieses ebenfalls oszillatorisches Verhalten aufweist. Dabei gibt es eine Gruppe an Lipiden, die ihre höchsten Konzentrationen in der Phase hoher Sauerstoffaufnahme zeigt und eine andere Gruppe in der Phase niedriger Sauerstoffaufnahme. Zudem werden vier Szenarien betrachtet, die in biochemischen Netzwerken zu Oszillationen führen können. Es wäre möglich, dass es sich um einen rein mechanistischen Effekt ohne eine unmittelbare Funktion - beruhend auf einer negativen Rückkopplung und einer intrinsischen Zeitverzögerung - handelt. Weiterhin könnten diese Oszillationen die sich ändernen physiologischen Anforderungen eines Prozesses, der in einer gegebenen Ordnung abzulaufen hat, widerspiegeln. Unter Verwendung von Minimalsystemen und in-silico Evolution wird gezeigt, dass Oszillationen zu einem Fitnessvorteil auf Einzelzellebene führen können. Dieser beruht zum einen darauf, dass Oszillationen eine zeitliche Trennung der Produktion toxischer Nebenprodukte von der Produktion der durch sie geschädigten Komponenten ermöglicht. Zum anderen erlaubt oszillatorisches Verhalten das Ablaufen von Reaktionen in dem für sie jeweils günstigsten Reaktionsmilieu. Basierend auf den experimentell bestimmten Austauschraten für Glucose, O2 und CO2 wird mittels FBA untersucht, wie sich die optimalen Syntheseraten von Biomasse und die Vorläufer selbiger über den Zyklus hinweg ändern. Die Ergebnisse deuten auf eine Trennung von Biosynthese und Stressantwort hin, was eine mögliche Funktion dieser Zyklen darstellen könnte. / When grown in continuous culture, budding yeast tend to autosynchronize resulting in a stable respiratory oscillation. Thereby, respiration toggles between high and low oxygen uptake rates. In parallel with this toggling, most facets of cellular physiology oscillate with distinct phase relationships e.g the transcriptome and metabolome. In this work, the phenomenon is examined from a theoretical as well as an experimental point of view. It can be shown that also the lipidome is oscillatory whereby one group of lipids peaks in the phase of high oxygen uptake and the second group of lipids in the phase of low oxygen uptake. Furthermore, four scenarios are presented that might lead to oscillatory dynamics in biochemical networks: Oscillation might occur due to a negative feedback and an intrinsic time delay without bearing a certain function. They could further reflect the changing physiological requirements of a process that has to be performed in a certain order. Using generic models and in-silico evolution, it can be shown that oscillations can also be beneficial on a single cell level since they allow a temporal separation of the production of a toxic by-product and the synthesis of its target and also that reactions can occur in their respective favored reaction milieu. Using measured exchange rates for glucose, O2 and CO2 as constraints for FBA, it is examined how the optimal synthesis rates for biomass and its precursors vary over a cycle. The results suggest that there is a temporal separation of processes related to biosynthesis and stress response which might reflect a possible function of the yeast metabolic cycle.

Aufgrund der vielfältigen metabolischen Prozesse und Funktionen von Mitochondrien finden durch beide mitochondriale Membranen zahlreiche Transportprozesse statt. Es wird weitgehend angenommen, dass der Transfer von metabolischen Intermediaten durch die äußere Membran von den zahlreichen Porinporen gewährleistet wird. Im Gegensatz dazu sind in der inneren Membran spezifische Transportproteine für die Translokationsprozesse verantwortlich. Neben dem gut untersuchten Porinmolekül (Por1p) gibt es in der Hefe S. cerevisiae unter respiratorischen Bedingungen zwei weitere abundante, aber funktionell unbekannte Proteine in der äußeren Membran von Mitochondrien - Om14p und Om45p -, deren molekular-biologische Charakterisierung Gegenstand dieser Arbeit war. Mit drei unabhängigen Methoden (2D BN - SDS-PAGE, Co-IP und TAP) konnte gezeigt werden, dass die beiden Proteine Om14p und Om45p zusammen mit Por1p einen Proteinkomplex in der äußeren Membran ausbilden, wobei Por1p eine von Om14p und Om45p unabhängige Porenstruktur ausbildet. Bei Bedarf, möglicherweise über Phosphorylierungen signalisiert, binden Om14p und Om45p an diese Struktur, wobei Om45p dabei der direkten Interaktion von Om14p mit Por1p bedarf. Die Identifikation von Interaktionspartnern des Fusionsproteins Om14p-TAP durch Einsatz einer präparativen TAP mit anschließender massenspektrometrischer Analyse sowie die Untersuchungen der Effekte von OM14- und/oder OM45- Gendeletionen auf das mitochondriale Proteom mit einem 2D DIGE-Verfahren führten zur Aufstellung von funktionalen Zusammenhängen des Proteinpaares Om14p/Om45p. Mit Wachstumsuntersuchungen von Deletionsmutanten in Gegenwart von in den Mitochondrien toxisch wirkenden Substanzen sowie durch ein in dieser Arbeit entwickeltes Testverfahren zur Bestimmung des mitochondrialen ATP-Flusses, konnten die funktionalen Hypothesen für die Proteine Om14p und Om45p initial verifiziert werden. Zusammengefasst unterstützen die Daten dieser Arbeit die Idee von einem hochgradig flexiblen System der Mitochondrien, zur Gewährleistung von effizienten Transportvorgängen durch beide Membranen. Eine koordinierte Bindung der Porinpore an die spezifischen Transporter der inneren Membran wird wahrscheinlich durch die Aktivität des Proteinpaares Om14p/Om45p vermittelt. In diesem Zusammenhang könnten beide Proteine als eine Art Lizenzierungsfaktor fungieren und die Positionierung der Porinpore an die entsprechenden Proteine der inneren Membran erzeugen. Dadurch würde ein effektives System für den Austausch von metabolischen Intermediaten und Substraten der mitochondrialen Atmungskette entstehen. Ebenfalls durch diese Arbeit nicht auszuschließen ist die Vorstellung, dass die Proteine Om14p und Om45p einen Einfluss auf die spezifischen Transportproteine der inneren Membran oder die Porinpore der äußeren Membran ausüben. Phosphatrest-Übertragungen, die zu Konformationsänderungen oder Porenöffnungen führen könnten, sind beispielsweise vorstellbar. Die Stoffwechseladaption einer Zelle bei einem diauxic shift ist durch einen verstärkten mitochondrialen Import von Metaboliten, Co-Faktoren und Proteinen sowie häufigerer mitochondrialer Teilungsprozesse charakterisiert. Om14p und Om45p sind bei einem Wechsel zu nicht-fermentativen Bedingungen verstärkt präsent. Diese beiden Proteine könnten der Hefe einen entscheidenden Vorteil bei der Synchronisierung der genannten Prozesse liefern, indem sie eine verbesserte Erreichbarkeit bzw. eine Veränderung der Selektivität von bereitgestellten Kanälen bzw. Transportproteinen in beiden mitochondrialen Membranen bewirken.