Das molekulare Drehlager der ATP-Synthase 1. Sechs verschiedene EF1-Deletionsmutanten mit verkürzten gamma-Untereinheiten wur­den mittels PCR hergestellt. Die Deletionen befinden sich jeweils am C-terminalen Ende der Untereinheit und umfassen 3 (MM16), 6 (MM20), 9 (MM17), 12 (MM8), 15 (MM18) und 18 (MM19) Aminosäurereste. 2. Durch einen Wachstumstest auf Succinat-Agarplatten wurde festgestellt, daß die von den Plasmiden pMM16, pMM20, pMM17 und pMM8 codierten ATP-Syntha­sen in E. coli DK8 funktionell exprimiert werden können, während pMM18 und pMM19 funktionsunfähige ATP-Synthasen liefern. Die Wachstumsgeschwindig­keit der DK8-Mutanten MM16, MM20 und MM17 auf Succinatmedium wird durch die Deletionen nicht beeinflußt. Hingegen besitzt E. coli DK8 pMM8 auf diesem Medium eine um etwa 33% geringere Wachstumsgeschwindigkeit. 3. Die DK8-Klone MM16, MM20, MM17 und MM8 wurden für die Expression und Isolierung von EF1-Komplexen verwendet. MM18 und MM19 lieferten keine mit Hilfe des S+G-Proteintests nachweisbaren Mengen an EF1. Durch die Verkürzung der Untereinheit gamma kam es bei der Aufreinigung der Enzymkomplexe nicht zu ei­nem verstärkten Verlust dieser Untereinheit. Aufgereinigtes KH7-EF1 (Kontroll-EF1 ohne Verkürzung des gamma-C-Terminus) und die EF1-Komplexe der Deletions­mutanten wiesen ein ähnliches alpha/beta:gamma-Verhältnis auf. 4. Die ATP-Hydrolyseaktivitäten der EF1-Deletionsmutanten zeigten eine starke Ab­hängigkeit von der Deletionslänge. So fielen die Aktivitäten bei 35ºC von 93 u/mg (KH7-EF1) um ca. 75% auf 22 u/mg (MM8-EF1) ab. Dagegen sanken die Aktivie­rungsenergien für die ATP-Hydrolyse durch die EF1-Deletionsmutanten mit zu­nehmender Deletionslänge erheblich schwächer ab. Hier konnte für KH7-EF1 eine Aktivierungsenergie von 54 kJ/mol und für MM8-EF1 35 kJ/mol ermittelt werden. Dies entspricht einer Abnahme um ca. 35%. 5. Das durch die Rotor-Untereinheit gamma erzeugte Drehmoment zeigte nur eine geringe Abhängigkeit von der Deletionslänge. So wiesen die EF1-Komplexe der Deleti­onsmutanten gegenüber KH7-EF1 nur ein um ca. 20% verringertes Drehmoment auf. Eine starke Abhängigkeit von der Deletionslänge wies im mikrovideographi­schen Rotationstest jedoch die Ausbeute an Rotatoren bezogen auf die Beobach­tungszeit der Küvetten auf. Dabei nahm die Ausbeute von KH7-EF1 zu MM8-EF1 erheblich ab. Keine Abhängigkeit von der Deletionslänge zeigte dagegen das Ro­tations/Rotationspausen-Verhältnis innerhalb der Laufzeiten der Rotatoren, die von etwa 10 – 190 s (durchschnittlich ca. 60 s) variierten. Aufgrund der verhältnismä­ßig kurzen Laufzeiten ist eine exakte Angabe des Rotations/Rotationspausen-Ver­hältnisses jedoch nicht möglich. 6. Rotationsexperimente mit EFOF1-Komplexen, die über die C-terminale gamma-Deletion deltaS281-V286 (gamma-6) verfügten, scheiterten möglicherweise aufgrund der Instabilität der Enzymkomplexe. 7. Da die Funktion aktiver EF1-Komplexe durch die gamma-Deletionen offenbar kaum beeinflußt wird, muß davon ausgegangen werden, daß die geringere ATP-Hydroly­seaktivität der Deletionsmutanten durch ein verändertes Verhältnis von aktiven und inaktiven Enzymkomplexen hervorgerufen wird. Die Deletionen beeinflußen damit weniger die mechanische Funktion des Enzyms sondern vielmehr die Stabilität ak­tiver Enzymkomplexe. 8. Mit der Mutante MM10 wurde ein EF1-Komplex erzeugt, der eine Verknüpfung der Rotoruntereinheit gamma mit einer Statoruntereinheit alpha über die Cysteine alphaC280 und gammaC285 ermöglichte. Eine Verknüpfung der beiden Untereinheiten konnte durch Oxidation mit 100 µM DTNB in etwa 30 min zu >90% erreicht werden. Eine Öff­nung der Disulfidbrücke durch Reduktion mit 20 mM DTT erforderte Inkubations­zeiten von bis zu etwa 600 min (Ausbeute >90%). Die Bildung einer Disulfidbrü­cke zwischen alphaC280 und gammaC285 hatte weder einen Einfluß auf die ATP-Hydroly­seaktivität des Enzyms noch auf die Aktivierungsenergie der ATP-Hydrolyse durch MM10-EF1. 9. MM10-EF1 ließ sich im ATP-Hydrolyse-Aktivitätstest über einen Zeitraum von 5 min durch Zugabe von 1 mM AMP-PNP nahezu vollständig hemmen (ca. 96%), während sich mit 1 mM AMP-PNP + 1 mM ADP, 1 mM NaN3 und 1 mM NaN3 + 1 mM ADP nur Inhibierungsgrade von 77-88% erreichen ließen. 10. Durch einen biochemischen Rotationstest konnte die freie Drehbarkeit des C-termi­nalen Bereichs von gamma im alpha3beta3-Hexagon des EF1-Komplexes nachgewiesen werden. Die Drehbarkeit ließ sich auch durch Zugabe von Inhibitoren des Enzym­komplexes im untersuchten Zeitbereich von Stunden nicht blockieren. Dadurch kann nicht bewiesen werden, daß die rotatorische Mobilität des C-terminalen gamma-Be­reichs ausschließlich auf eine katalytisch bedingte gamma-Rotation zurückzuführen ist. Eine weitere Ursache für die rotatorische Mobilität könnte in einer hohen struktu­rellen Flexibilität des gesamten Lagerbereichs von EF1 bestehen. Der Rotationstest zeigt jedoch, daß die durch molekulardynamische Berechnungen nahegelegte Fi­xierung des C-terminalen gamma-Bereichs bei der gamma-Rotation für die Funktion des EF1-Komplexes offenbar keine Rolle spielt. Ein weiterer biochemischer Rotationstest zum Nachweis der Inhibierung der gamma Ro­tationsbewegung durch kompetetive Inhibitoren über einen Zeitraum von etwa 18 h scheiterte offenbar aufgrund der experimentellen Auslegung des Versuchs.

Actin is one of the most abundant and highly conserved proteins in eukaryotic cells. The globular protein assembles into long filaments, which form a variety of different networks within the cytoskeleton. The dynamic reorganization of these networks - which is pivotal for cell motility, cell adhesion, and cell division - is based on cycles of polymerization (assembly) and depolymerization (disassembly) of actin filaments. Actin binds ATP and within the filament, actin-bound ATP is hydrolyzed into ADP on a time scale of a few minutes. As ADP-actin dissociates faster from the filament ends than ATP-actin, the filament becomes less stable as it grows older. Recent single filament experiments, where abrupt dynamical changes during filament depolymerization have been observed, suggest the opposite behavior, however, namely that the actin filaments become increasingly stable with time. Several mechanisms for this stabilization have been proposed, ranging from structural transitions of the whole filament to surface attachment of the filament ends. The key issue of this thesis is to elucidate the unexpected interruptions of depolymerization by a combination of experimental and theoretical studies. In new depolymerization experiments on single filaments, we confirm that filaments cease to shrink in an abrupt manner and determine the time from the initiation of depolymerization until the occurrence of the first interruption. This duration differs from filament to filament and represents a stochastic variable. We consider various hypothetical mechanisms that may cause the observed interruptions. These mechanisms cannot be distinguished directly, but they give rise to distinct distributions of the time until the first interruption, which we compute by modeling the underlying stochastic processes. A comparison with the measured distribution reveals that the sudden truncation of the shrinkage process neither arises from blocking of the ends nor from a collective transition of the whole filament. Instead, we predict a local transition process occurring at random sites within the filament. The combination of additional experimental findings and our theoretical approach confirms the notion of a local transition mechanism and identifies the transition as the photo-induced formation of an actin dimer within the filaments. Unlabeled actin filaments do not exhibit pauses, which implies that, in vivo, older filaments become destabilized by ATP hydrolysis. This destabilization can be identified with an acceleration of the depolymerization prior to the interruption. In the final part of this thesis, we theoretically analyze this acceleration to infer the mechanism of ATP hydrolysis. We show that the rate of ATP hydrolysis is constant within the filament, corresponding to a random as opposed to a vectorial hydrolysis mechanism. / Aktin ist eines der am häufigsten vorkommenden und am stärksten konservierten Proteine in eukaryotischen Zellen. Dieses globuläre Protein bildet lange Filamente, die zu einer großen Vielfalt von Netzwerken innerhalb des Zellskeletts führen. Die dynamische Reorganisation dieser Netzwerke, die entscheidend für Zellbewegung, Zelladhäsion, und Zellteilung ist, basiert auf der Polymerisation (dem Aufbau) und der Depolymerisation (dem Abbau) von Aktinfilamenten. Aktin bindet ATP, welches innerhalb des Filaments auf einer Zeitskala von einigen Minuten in ADP hydrolysiert wird. Da ADP-Aktin schneller vom Filamentende dissoziiert als ATP-Aktin, sollte ein Filament mit der Zeit instabiler werden. Neuere Experimente, in denen abrupte dynamische Änderungen während der Filamentdepolymerisation beobachtet wurden, deuten jedoch auf ein gegenteiliges Verhalten hin: Die Aktinfilamente werden mit der Zeit zunehmend stabiler. Mehrere Mechanismen für diese Stabilisierung wurden bereits vorgeschlagen, von strukturellen Übergängen des gesamten Filaments bis zu Wechselwirkungen der Filamentenden mit dem experimentellen Aufbau. Das zentrale Thema der vorliegenden Dissertation ist die Aufklärung der unerwarteten Unterbrechungen der Depolymerisation. Dies geschieht durch eine Kombination von experimentellen und theoretischen Untersuchungen. Mit Hilfe neuer Depolymerisationexperimente mit einzelnen Filamenten bestätigen wir zunächst, dass die Filamente plötzlich aufhören zu schrumpfen und bestimmen die Zeit, die von der Einleitung der Depolymerisation bis zum Auftreten der ersten Unterbrechung vergeht. Diese Zeit unterscheidet sich von Filament zu Filament und stellt eine stochastische Größe dar. Wir untersuchen daraufhin verschiedene hypothetische Mechanismen, welche die beobachteten Unterbrechungen verursachen könnten. Die Mechanismen können experimentell nicht direkt unterschieden werden, haben jedoch verschiedene Verteilungen für die Zeit bis zur ersten Unterbrechung zur Folge. Wir berechnen die jeweiligen Verteilungen, indem wir die zugrundeliegenden stochastischen Prozesse modellieren. Ein Vergleich mit der gemessenen Verteilung zeigt, dass der plötzliche Abbruch des Depolymerisationsprozesses weder auf eine Blockade der Enden, noch auf einen kollektiven strukturellen Übergang des gesamten Filaments zurückzuführen ist. An Stelle dessen postulieren wir einen lokalen Übergangsprozess, der an zufälligen Stellen innerhalb des Filaments auftritt. Die Kombination von weiteren experimentellen Ergebnissen und unserem theoretischen Ansatz bestätigt die Vorstellung eines lokalen Übergangsmechanismus und identifiziert den Übergang als die photo-induzierte Bildung eines Aktindimers innerhalb des Filaments. Nicht fluoreszenzmarkierte Aktinfilamente zeigen keine Unterbrechungen, woraus folgt, dass ältere Filamente in vivo durch die ATP-Hydrolyse destabilisiert werden. Die Destabilisierung zeigt sich durch die Beschleunigung der Depolymerisation vor der Unterbrechung. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit untersuchen wir diese Beschleunigung mit theoretischen Methoden, um auf den Mechanismus der ATP-Hydrolyse zu schließen. Wir zeigen, dass die Hydrolyserate von ATP innerhalb des Filaments konstant ist, was dem sogenannten zufälligen Hydrolysemechanismus entspricht und im Gegensatz zum sogenannten vektoriellen Mechanismus steht.

1. Aufgrund der Resultate mit der Mutante MM10, die trotz Disulfidbrücke noch unverminderte Aktivität und Rotation zeigte, wurde der Frage nachgegangen, ob der EF1-Komplex in der Lage ist, die Rotation durch einen Bruch der alpha-helikalen Struktur von gamma oder durch Rotation um eine Einfachbindung der Disulfidbrücke aufrechtzuerhalten. Quervernetzungen vom Hexagon mit gamma in der Mitte und am unteren Ende konnten das Enzym blockieren. Von den vier betrachteten Mutanten KG11, MM26, MM25 und MM24 fiel der MM26 bereits nach der Isolierung raus. Der MM25 wies nicht mehr als 70% Quervernetzung auf. Bei dem KG11 und dem MM24 konnte jedoch eine 99%-ige Quervernetzung nachgewiesen werden. Mit diesen zwei Cystein-Doppelmutanten wurden weitere Quervernetzungen gefunden, die ebenso wie der MM10 aktiv nach Oxidation sind, aber tiefer im Enzym liegen und die ATP-Hydrolyse trotz Blockade durch Quervernetzung aufrecht erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass eine Rotation um die Einzelbindungen innerhalb der Disulfidbrücke unwahrscheinlich ist, und daher die Aktivität des quervernetzten Enzyms nur durch eine Aufwindung der gamma-Helix erklärt werden kann. 2. Die Voraussetzung für ein EFOF1-Kostrukt zum optischen Nachweis der Relativrotation unter Synthesebedingungen war der Einbau von zwei verschiedenen Tags zur spezifischen Bindung. Von den vier Mutanten SE3, SE4, SW7 und WH1 zeigten die beiden SE-Mutanten keine Stabilität bei der Isolierung im Bezug auf die Kopplung zwischen FO- und F1-Teil. Mit dem SW7-EFOF1 wurde eine Mutante gefunden, die mit einer guten Aktivitäts- und Rotationsausbeute nach einer Aufreinigung mittels Streptactin-Affinitätchromatographie durch ihre Stabilität als Ausgangspunkt für das Rotationsexperiment unter ATP-Synthese dienen kann. Der WH1, dessen atp-Operon dem des SW7 gleicht, brachte trotz seines veränderten Vektorursprungs keine Verbesserung.