Rotary molecular motors are protein complexes which convert chemical or electrochemical energy from the environment into mechanical work in the form of rotary motion. The work in this thesis examines two of these motors: the F₁ portion of F₁F_O- ATP synthase, which is responsible for ATP production in bacteria and eukaryotes, and the bacterial flagellar motor (BFM), which rotates the flagella of a bacterium, enabling locomotion. The aim of these investigations was to measure the stepping dynamics of these motors, in order to further elucidate details of the stepping mechanism, the mechanism of rotation, and the mechanochemical cycle. A back-scattering laser dark field microscope of unprecedented resolution was designed and constructed to observe the rotation of gold nanoparticles attached to fixed motors. This micro- scope is capable of sub-nanometer and 20μs resolution. The protocols and algorithms to collect and analyze high resolution rotational data developed for these experiments have yielded novel discoveries for both F₁ and the BFM. While most of the previous single-molecule work has been done on F₁ from the thermophilic Bacilus PS3 (TF₁), only mitochondrial F₁ has been well characterized by high-resolution crystal structures, and single-molecule studies of mesophilic F₁ are lacking. This thesis presents evidence that mesophilic F₁ from E. coli and wild type yeast F₁ from S. cerevisiae are governed by the same mechanism as TF₁ under laboratory conditions. Experiments with yeast F₁ mutants allow a direct comparison between single-molecule rotation studies and high resolution crystal structures. A data set of unprecedented size and resolution was acquired of high speed, low load BFM rotation, enabling the first observation of steps in the BFM under physiological conditions. Preliminary results from this analysis question previously published results of the dependence of speed on stator number at low load and provide novel hypotheses necessitating new models of BFM rotation.

La F1-ATPase des mitochondries de coeur de boeuf est inactivée par les dérivés 2',3'-dialdéhydiques de l'ATP, ADP et AMP (dialATP, dialADP, dialAMP). L'analyse de la cinétique d'inactivation enzymatique montre qu'en l'absence de Mg2+, l'inactivation résulte de la fixation d'une mole d'analogue de nucléotide par unité active de F1-ATPase. L'analogue le plus efficace est le dialADP, suivi par le dialAMP et le dialATP. L'utilisation de nucléotides radioactif montre que l'inactivation complète nécessite la fixation d'environ 11 moles de dialADP par mole de F1. Après correction pour le marquage non-sélectif, le le nombre de dialADP fixés spécifiquement est de 3 par F1. Par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS), le dialADP se fixe de manière covalente principalement sur les sous-unités alpha et beta.

L'objectif de notre thèse de doctorat est d’étudier et de décrire les propriétés chimiques et mé- caniques du moteur moléculaire F1 -ATPase. Le moteur F1 -ATPase est un moteur rotatif, d’aspect sphérique et d’environ 10 nanomètre de rayon, qui utilise l’énergie de l’hydrolyse de l’ATP comme car- burant moléculaire. Des questions fondamentales se posent sur le fonctionnement de ce moteurs et sur la quantité de travail qu’il peut fournir. Il s’agit de questions qui concernent principalement la thermodynamique des processus irréversibles. De plus, comme ce moteur est de taille nanométrique, il est fortement influencé par les fluctuations moléculaires, ce qui nécessite une approche stochastique. C’est en créant deux modéles stochastiques complémentaires de ce moteur que nous avons contribué à répondre à ces questions fondamentales. Le premier modèle discuté au chapitre 5 de la thèse, est un mod- èle continu dans le temps et l’espace, décrit par des équations de Fokker-Planck, est construit sur des résultats expérimentaux. Ce modèle tient compte d’une description explicite des fluctua- tions affectant le degré de liberté mécanique et décrit les tran- sitions entre les différents états chimiques discrets du moteur, par un processus de sauts aléatoires entre premiers voisins. Nous avons obtenus des résultats précis concernant la chimie d’hydrolyse et de synthèse de l’ATP, et pour les dépendences du moteur en les différentes variables mécaniques, à savoir, la friction et le couple de force extérieur, ainsi que la dépendence en la température. Les résultats que nous avons obtenus avec ce modèle sont en ex- cellent accord avec les observations expérimentales. Le second modèle est discret dans l’espace et continu dans le temps et est décrit dans le chapitre 6. L’analyse des résultats obtenus par simulations numériques montre que le modèle est en accord avec les observations expérimentales et il permet en outre de dériver des grandeurs thermodynamiques analytique- ment, décrites au chapitre 4, ce que le modèle continu ne permet pas. La comparaison des deux modèles révele la nature du fonction- nement du moteur, ainsi que son régime de fonctionnement loin de l’équilibre. Le second modèle a éte soumis récemment pour publication.

abstract: The F1Fo ATP synthase is required for energy conversion in almost all living organisms. The F1 complex is a molecular motor that uses ATP hydrolysis to drive rotation of the γ–subunit. It has not been previously possible to resolve the speed and position of the γ–subunit of the F1–ATPase as it rotates during a power stroke. The single molecule experiments presented here measured light scattered from 45X91 nm gold nanorods attached to the γ–subunit that provide an unprecedented 5 μs resolution of rotational position as a function of time. The product of velocity and drag, which were both measured directly, resulted in an average torque of 63±8 pN nm for the Escherichia coli F1-ATPase that was determined to be independent of the load. The rotational velocity had an initial (I) acceleration phase 15° from the end of the catalytic dwell, a slow (S) acceleration phase during ATP binding/ADP release (15°–60°), and a fast (F) acceleration phase (60°–90°) containing an interim deceleration (ID) phase (75°–82°). High ADP concentrations decreased the velocity of the S phase proportional to 'ADP-release' dwells, and the F phase proportional to the free energy derived from the [ADP][Pi]/[ATP] chemical equilibrium. The decreased affinity for ITP increased ITP-binding dwells by 10%, but decreased velocity by 40% during the S phase. This is the first direct evidence that nucleotide binding contributes to F1–ATPase torque. Mutations that affect specific phases of rotation were identified, some in regions of F1 previously considered not to contribute to rotation. Mutations βD372V and γK9I increased the F phase velocity, and γK9I increased the depth of the ID phase. The conversion between S and F phases was specifically affected by γQ269L. While βT273D, βD305E, and αR283Q decreased the velocity of all phases, decreases in velocity due to βD302T, γR268L and γT82A were confined to the I and S phases. The correlations between the structural locations of these mutations and the phases of rotation they affect provide new insight into the molecular basis for F1–ATPase γ-subunit rotation. / Dissertation/Thesis / Ph.D. Molecular and Cellular Biology 2012

Das molekulare Drehlager der ATP-Synthase 1. Sechs verschiedene EF1-Deletionsmutanten mit verkürzten gamma-Untereinheiten wur­den mittels PCR hergestellt. Die Deletionen befinden sich jeweils am C-terminalen Ende der Untereinheit und umfassen 3 (MM16), 6 (MM20), 9 (MM17), 12 (MM8), 15 (MM18) und 18 (MM19) Aminosäurereste. 2. Durch einen Wachstumstest auf Succinat-Agarplatten wurde festgestellt, daß die von den Plasmiden pMM16, pMM20, pMM17 und pMM8 codierten ATP-Syntha­sen in E. coli DK8 funktionell exprimiert werden können, während pMM18 und pMM19 funktionsunfähige ATP-Synthasen liefern. Die Wachstumsgeschwindig­keit der DK8-Mutanten MM16, MM20 und MM17 auf Succinatmedium wird durch die Deletionen nicht beeinflußt. Hingegen besitzt E. coli DK8 pMM8 auf diesem Medium eine um etwa 33% geringere Wachstumsgeschwindigkeit. 3. Die DK8-Klone MM16, MM20, MM17 und MM8 wurden für die Expression und Isolierung von EF1-Komplexen verwendet. MM18 und MM19 lieferten keine mit Hilfe des S+G-Proteintests nachweisbaren Mengen an EF1. Durch die Verkürzung der Untereinheit gamma kam es bei der Aufreinigung der Enzymkomplexe nicht zu ei­nem verstärkten Verlust dieser Untereinheit. Aufgereinigtes KH7-EF1 (Kontroll-EF1 ohne Verkürzung des gamma-C-Terminus) und die EF1-Komplexe der Deletions­mutanten wiesen ein ähnliches alpha/beta:gamma-Verhältnis auf. 4. Die ATP-Hydrolyseaktivitäten der EF1-Deletionsmutanten zeigten eine starke Ab­hängigkeit von der Deletionslänge. So fielen die Aktivitäten bei 35ºC von 93 u/mg (KH7-EF1) um ca. 75% auf 22 u/mg (MM8-EF1) ab. Dagegen sanken die Aktivie­rungsenergien für die ATP-Hydrolyse durch die EF1-Deletionsmutanten mit zu­nehmender Deletionslänge erheblich schwächer ab. Hier konnte für KH7-EF1 eine Aktivierungsenergie von 54 kJ/mol und für MM8-EF1 35 kJ/mol ermittelt werden. Dies entspricht einer Abnahme um ca. 35%. 5. Das durch die Rotor-Untereinheit gamma erzeugte Drehmoment zeigte nur eine geringe Abhängigkeit von der Deletionslänge. So wiesen die EF1-Komplexe der Deleti­onsmutanten gegenüber KH7-EF1 nur ein um ca. 20% verringertes Drehmoment auf. Eine starke Abhängigkeit von der Deletionslänge wies im mikrovideographi­schen Rotationstest jedoch die Ausbeute an Rotatoren bezogen auf die Beobach­tungszeit der Küvetten auf. Dabei nahm die Ausbeute von KH7-EF1 zu MM8-EF1 erheblich ab. Keine Abhängigkeit von der Deletionslänge zeigte dagegen das Ro­tations/Rotationspausen-Verhältnis innerhalb der Laufzeiten der Rotatoren, die von etwa 10 – 190 s (durchschnittlich ca. 60 s) variierten. Aufgrund der verhältnismä­ßig kurzen Laufzeiten ist eine exakte Angabe des Rotations/Rotationspausen-Ver­hältnisses jedoch nicht möglich. 6. Rotationsexperimente mit EFOF1-Komplexen, die über die C-terminale gamma-Deletion deltaS281-V286 (gamma-6) verfügten, scheiterten möglicherweise aufgrund der Instabilität der Enzymkomplexe. 7. Da die Funktion aktiver EF1-Komplexe durch die gamma-Deletionen offenbar kaum beeinflußt wird, muß davon ausgegangen werden, daß die geringere ATP-Hydroly­seaktivität der Deletionsmutanten durch ein verändertes Verhältnis von aktiven und inaktiven Enzymkomplexen hervorgerufen wird. Die Deletionen beeinflußen damit weniger die mechanische Funktion des Enzyms sondern vielmehr die Stabilität ak­tiver Enzymkomplexe. 8. Mit der Mutante MM10 wurde ein EF1-Komplex erzeugt, der eine Verknüpfung der Rotoruntereinheit gamma mit einer Statoruntereinheit alpha über die Cysteine alphaC280 und gammaC285 ermöglichte. Eine Verknüpfung der beiden Untereinheiten konnte durch Oxidation mit 100 µM DTNB in etwa 30 min zu >90% erreicht werden. Eine Öff­nung der Disulfidbrücke durch Reduktion mit 20 mM DTT erforderte Inkubations­zeiten von bis zu etwa 600 min (Ausbeute >90%). Die Bildung einer Disulfidbrü­cke zwischen alphaC280 und gammaC285 hatte weder einen Einfluß auf die ATP-Hydroly­seaktivität des Enzyms noch auf die Aktivierungsenergie der ATP-Hydrolyse durch MM10-EF1. 9. MM10-EF1 ließ sich im ATP-Hydrolyse-Aktivitätstest über einen Zeitraum von 5 min durch Zugabe von 1 mM AMP-PNP nahezu vollständig hemmen (ca. 96%), während sich mit 1 mM AMP-PNP + 1 mM ADP, 1 mM NaN3 und 1 mM NaN3 + 1 mM ADP nur Inhibierungsgrade von 77-88% erreichen ließen. 10. Durch einen biochemischen Rotationstest konnte die freie Drehbarkeit des C-termi­nalen Bereichs von gamma im alpha3beta3-Hexagon des EF1-Komplexes nachgewiesen werden. Die Drehbarkeit ließ sich auch durch Zugabe von Inhibitoren des Enzym­komplexes im untersuchten Zeitbereich von Stunden nicht blockieren. Dadurch kann nicht bewiesen werden, daß die rotatorische Mobilität des C-terminalen gamma-Be­reichs ausschließlich auf eine katalytisch bedingte gamma-Rotation zurückzuführen ist. Eine weitere Ursache für die rotatorische Mobilität könnte in einer hohen struktu­rellen Flexibilität des gesamten Lagerbereichs von EF1 bestehen. Der Rotationstest zeigt jedoch, daß die durch molekulardynamische Berechnungen nahegelegte Fi­xierung des C-terminalen gamma-Bereichs bei der gamma-Rotation für die Funktion des EF1-Komplexes offenbar keine Rolle spielt. Ein weiterer biochemischer Rotationstest zum Nachweis der Inhibierung der gamma Ro­tationsbewegung durch kompetetive Inhibitoren über einen Zeitraum von etwa 18 h scheiterte offenbar aufgrund der experimentellen Auslegung des Versuchs.

We have studied the inhibitory effect of natural and structurally modified polyphenols on Escherichia coli ATP synthase to test (I) if the beneficial dietary effects of polyphenols are related to their inhibitory actions on ATP synthase, (II) if inhibitory effects of polyphenolic compound could be augmented through structural modifications, and (III) if they can act as antimicrobial agent through their actions on ATP synthesis. X-ray crystal structures of polyphenol binding sites suggested that polyphenols bind at a distinct polyphenol binding pocket, at the interface of α,β,γ-subunits. We found that both natural and modified polyphenols inhibit E. coli ATP synthase to varying degrees and structural modifications resulted in augmented inhibition. Inhibition was reversible in all cases. Both natural and modulated compounds inhibited E. coli cell growth to varying degrees. We conclude that dietary benefits of polyphenols may be in part due to the inhibition of ATP synthase.

L'objectif de notre thèse de <p>doctorat est d’étudier et de décrire les propriétés chimiques et mé- <p>caniques du moteur moléculaire F1 -ATPase. Le moteur F1 -ATPase <p>est un moteur rotatif, d’aspect sphérique et d’environ 10 nanomètre <p>de rayon, qui utilise l’énergie de l’hydrolyse de l’ATP comme car- <p>burant moléculaire. <p>Des questions fondamentales se posent sur le fonctionnement de <p>ce moteurs et sur la quantité de travail qu’il peut fournir. Il s’agit <p>de questions qui concernent principalement la thermodynamique <p>des processus irréversibles. De plus, comme ce moteur est de <p>taille nanométrique, il est fortement influencé par les fluctuations <p>moléculaires, ce qui nécessite une approche stochastique. <p>C’est en créant deux modéles stochastiques complémentaires de <p>ce moteur que nous avons contribué à répondre à ces questions <p>fondamentales. <p>Le premier modèle discuté au chapitre 5 de la thèse, est un mod- <p>èle continu dans le temps et l’espace, décrit par des équations de <p>Fokker-Planck, est construit sur des résultats expérimentaux. <p>Ce modèle tient compte d’une description explicite des fluctua- <p>tions affectant le degré de liberté mécanique et décrit les tran- <p>sitions entre les différents états chimiques discrets du moteur, <p>par un processus de sauts aléatoires entre premiers voisins. Nous <p>avons obtenus des résultats précis concernant la chimie d’hydrolyse <p>et de synthèse de l’ATP, et pour les dépendences du moteur en les <p>différentes variables mécaniques, à savoir, la friction et le couple <p>de force extérieur, ainsi que la dépendence en la température. <p>Les résultats que nous avons obtenus avec ce modèle sont en ex- <p>cellent accord avec les observations expérimentales. <p>Le second modèle est discret dans l’espace et continu dans le <p>temps et est décrit dans le chapitre 6. L’analyse des résultats <p>obtenus par simulations numériques montre que le modèle est <p>en accord avec les observations expérimentales et il permet en <p>outre de dériver des grandeurs thermodynamiques analytique- <p>ment, décrites au chapitre 4, ce que le modèle continu ne permet <p>pas. <p>La comparaison des deux modèles révele la nature du fonction- <p>nement du moteur, ainsi que son régime de fonctionnement loin <p>de l’équilibre. Le second modèle a éte soumis récemment pour <p>publication. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished