Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4350402 bytes, checksum: bd6bf9393be337ef287514591c95188f (MD5) Previous issue date: 2011-07-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The ectomycorrhizal association is a mutualistic interaction between plant roots and soil fungi that causes morphophysiological changes in the plant root system. The nutritional benefits result from the capacity of the fungus to increase the uptake of mineral nutrients by the host plant in exchange for photoassimilates. For the ectomycorrhizal association between Scleroderma laeve and Eucalyptus grandis, there is no information on which genes are decisive for the symbiosis and how they relate to the formation of ectomycorrhizas. Transcripts of the genes ras and ef1α were dentified as differentially expressed in many symbiotic associations and are related to signal transduction pathways and protein synthesis, respectively. Thus, the objectives of this work were to establish the ectomycorrhizal association between S. laeve and E. grandis in vitro, to isolate partial sequences of the genes ras and ef1α of S. laeve, and to evaluate the functional expression of these genes during ectomycorrhizal formation. Our works demonstrates the ectomycorrhizal association between S. laeve and E. grandis in vitro for the first time. The typical structures of ectomycorrhizas, such as the mantle and the Hartig net, were observed. At three days of contact between S. laeve and E. grandis roots the beginning of mantle formation could be observed. At 15 days, the mantle was completely formed, the epidermal cells were elongated, and the Hartig net formation was in progress. At 30 days, the ectomycorrhizas presented all the typical morphological structures fully developed. To evaluate gene expression during the association, partial sequences of ras and ef1α were isolated and the transcripts evaluated at the pre-symbiotic phase and at 3, 15 and 30 days after physical contact of the fungus with the plant roots. The transcripts of the gene ef1α were expressed at all evaluated times. Transcripts of ras were only detected in the ectomycorrhizas after three, 15, and 30 days of contact. These results are fundamental for a better understanding of the ectomycorrhizal association between S. laeve and E. grandis and suggest that ras-mediated signal transduction pathways may be functional during the establishment of the symbiosis between the fungus and the host roots. / A associação ectomicorrízica é uma interação mutualista entre raízes de plantas e fungos do solo, resultando em mudanças morfofisiológicas do sistema radicular das plantas. Os benefícios nutricionais advêm da capacidade do fungo em aumentar a absorção de nutrientes minerais pelas plantas, recebendo em troca os fotoassimilados. Na associação entre Scleroderma laeve e Eucalyptus grandis ainda não se tem informações de quais genes são decisivos e estão relacionados a este processo. Transcritos dos genes ras e ef1α foram identificados durante a formação da simbiose e sendo diferencialmente expressos na associação ectomicorrízica, e estão relacionados a vias de transdução de sinal e atuando na síntese protéica, respectivamente. Assim, os objetivos deste trabalho foram estabelecer a associação ectomicorrízica in vitro entre S. laeve e E. grandis, isolar sequências parciais dos genes ras e ef1α do fungo ectomicorrízico S. laeve, e avaliar a expressão funcional destes genes durante as fases de formação das ectomicorrizas. Este trabalho comprova a associação in vitro entre S. laeve e E. grandis, sendo registrada pela primeira vez. As estruturas típicas das ectomicorrizas, como a formação do manto fúngico e da rede de Hartig foram observadas. Nos tempos avaliados, em três dias de contato já havia a formação do manto fúngico. Aos 15 dias, o manto fúngico estava completamente formado, as células da epiderme alongadas e a rede de Hartig, em formação. Aos 30 dias, as ectomicorrizas apresentavam todas as estruturas típicas desenvolvidas. Para avaliar a expressão dos genes durante a associação, sequências parciais dos genes ras e ef1α foram isolados, e os transcritos destes genes foram avaliados na fase pré-simbiótica e aos três, 15 e 30 dias após o contato físico. Os transcritos do gene ef1α foram expressos durante todos os tempos avaliados. Os transcritos do gene ras foram detectados nas ectomicorrizas após três, 15 e 30 dias. Estes resultados são fundamentais para uma melhor compreensão da associação ectomicorrízica entre S. laeve e E. grandis e sugerem que as vias de transdução de sinais mediada por ras podem ser funcionais durante o estabelecimento da simbiose entre os fungos e as raízes de plantas.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The genus Pinus is highlight in the forestry sector, especially in southern Brazil, by production of wood and cellulose. However, their seeds are vulnerable to attack by fungi causing diseases in nurseries. The present study aims to evaluate the physiological and sanitary quality of Pinus spp. seeds. from different origins; morphological and molecular identification of fungal species isolated from seeds of Pinus sp.; evaluate the pathogenic potential these fungi; and testing the efficacy of biocontrol agents for the treatment of seeds. For initial characterization of seed were evaluated germination and sanity tests. Four lots were utilized and samples were composed of 400 seeds for each test. The morphological characterization of the fungal isolates was accomplished based on specific keys to the genera Fusarium and Lasiodiplodia. For the molecular identification, ITS region and elongation factor, were sequenced. The pathogenicity test consists of the inoculation of the pine seeds by contact with a fungal culture of the pathogen, the substrate was sterilized sand, the test was kept in a growth room (25 ± 3 °C and photoperiod of 12 h) during 45 days. For biocontrol tests were used commercial products based on Trichoderma and Bacillus; and an isolated Bacillus themselves obtained from pine seeds. The in vitro control was conducted by direct confrontation betweem antagonist and pathogen. The in vivo test was carried out in conditions of vegetation for 60 days, the variables evaluated were emergence, stem diameter, fresh weight and dry seedling. The germination percentage of lots was higher 70%. The fungal genera associated with seeds were: Fusarium, Lasiodiplodia, Aspergillus, Penicillium and Trichoderma. Based on morphological and molecular characteristics identified the species F. oxysporum, F. verticillioides and Lasiodiplodia theobromae as pathogenic species to Pinus spp., causing pre and post-emergence damping-off. The antagonists show control potential of F. oxysporum, F. verticillioides and Lasiodiplodia theobromae in vitro. In vivo tests does not interfere with the development of the seedlings, until the 60 days of test. / O gênero Pinus destaca-se no setor florestal, especialmente na região Sul do Brasil, pela produção de madeira e celulose. Entretanto, suas sementes apresentam vulnerabilidade sanitária e doenças causadas por fungos são ocorrências decisivas na fase de produção de mudas nos viveiros. Diante disso, o presente estudo tem como objetivo avaliar a qualidade fisiológica e sanitária de sementes de Pinus spp. oriundas de diferentes procedências; identificar morfologicamente e molecularmente os isolados fúngicos associados as sementes; avaliar o potencial patogênico desses fungos; e testar a eficiência de agentes biocontroladores no tratamento das sementes. Para a caracterização inicial das sementes foram utilizados os testes de germinação e sanidade, avaliando-se quatro lotes e as amostras foram compostas por 400 sementes, para cada teste. A caracterização morfológica dos isolados fúngicos foi realizada com base em chaves específicas para os gêneros Fusarium e Lasiodiplodia, já para a identificação molecular, foram sequenciadas as regiões ITS e fator de elongação. O teste de patogenicidade consistiu na inoculação das sementes de Pinus via contato com a cultura fúngica do patógeno, sendo o substrato utilizado areia esterilizada com o teste mantido em sala de germinação (25 ± 3 °C e fotoperíodo de 12 h) durante 45 dias. Para os testes de biocontrole foram utilizados produtos comerciais à base de Trichoderma e Bacillus e um isolado de Bacillus obtido das próprias sementes de Pinus. O controle in vitro foi realizado pelo método de confronto pareado de culturas (antagonista x patógeno) e o teste in vivo foi desenvolvido em condições de casa de vegetação, durante 60 dias; as variáveis avaliadas foram emergência, diâmetro do colo, peso fresco e seco de mudas. O percentual de germinação dos lotes foi superior a 70%. Os gêneros fúngicos identificados nas sementes foram: Fusarium, Lasiodiplodia, Aspergillus, Penicillium e Trichoderma. Com base nas características morfológicas e moleculares identificaram-se as espécies Fusarium oxysporum, F. verticillioides e Lasiodiplodia theobromae como patogênicas a espécie em estudo, causando damping off de pré e pós-emergência. Os agentes antagonistas mostraram potencial de controle in vitro sobre F. oxysporum, F. verticillioides e L. theobromae e quando confrontados in vivo com L. theobromae não interferiram no desenvolvimento das mudas, até os 60 dias de condução do teste.

Das molekulare Drehlager der ATP-Synthase 1. Sechs verschiedene EF1-Deletionsmutanten mit verkürzten gamma-Untereinheiten wur­den mittels PCR hergestellt. Die Deletionen befinden sich jeweils am C-terminalen Ende der Untereinheit und umfassen 3 (MM16), 6 (MM20), 9 (MM17), 12 (MM8), 15 (MM18) und 18 (MM19) Aminosäurereste. 2. Durch einen Wachstumstest auf Succinat-Agarplatten wurde festgestellt, daß die von den Plasmiden pMM16, pMM20, pMM17 und pMM8 codierten ATP-Syntha­sen in E. coli DK8 funktionell exprimiert werden können, während pMM18 und pMM19 funktionsunfähige ATP-Synthasen liefern. Die Wachstumsgeschwindig­keit der DK8-Mutanten MM16, MM20 und MM17 auf Succinatmedium wird durch die Deletionen nicht beeinflußt. Hingegen besitzt E. coli DK8 pMM8 auf diesem Medium eine um etwa 33% geringere Wachstumsgeschwindigkeit. 3. Die DK8-Klone MM16, MM20, MM17 und MM8 wurden für die Expression und Isolierung von EF1-Komplexen verwendet. MM18 und MM19 lieferten keine mit Hilfe des S+G-Proteintests nachweisbaren Mengen an EF1. Durch die Verkürzung der Untereinheit gamma kam es bei der Aufreinigung der Enzymkomplexe nicht zu ei­nem verstärkten Verlust dieser Untereinheit. Aufgereinigtes KH7-EF1 (Kontroll-EF1 ohne Verkürzung des gamma-C-Terminus) und die EF1-Komplexe der Deletions­mutanten wiesen ein ähnliches alpha/beta:gamma-Verhältnis auf. 4. Die ATP-Hydrolyseaktivitäten der EF1-Deletionsmutanten zeigten eine starke Ab­hängigkeit von der Deletionslänge. So fielen die Aktivitäten bei 35ºC von 93 u/mg (KH7-EF1) um ca. 75% auf 22 u/mg (MM8-EF1) ab. Dagegen sanken die Aktivie­rungsenergien für die ATP-Hydrolyse durch die EF1-Deletionsmutanten mit zu­nehmender Deletionslänge erheblich schwächer ab. Hier konnte für KH7-EF1 eine Aktivierungsenergie von 54 kJ/mol und für MM8-EF1 35 kJ/mol ermittelt werden. Dies entspricht einer Abnahme um ca. 35%. 5. Das durch die Rotor-Untereinheit gamma erzeugte Drehmoment zeigte nur eine geringe Abhängigkeit von der Deletionslänge. So wiesen die EF1-Komplexe der Deleti­onsmutanten gegenüber KH7-EF1 nur ein um ca. 20% verringertes Drehmoment auf. Eine starke Abhängigkeit von der Deletionslänge wies im mikrovideographi­schen Rotationstest jedoch die Ausbeute an Rotatoren bezogen auf die Beobach­tungszeit der Küvetten auf. Dabei nahm die Ausbeute von KH7-EF1 zu MM8-EF1 erheblich ab. Keine Abhängigkeit von der Deletionslänge zeigte dagegen das Ro­tations/Rotationspausen-Verhältnis innerhalb der Laufzeiten der Rotatoren, die von etwa 10 – 190 s (durchschnittlich ca. 60 s) variierten. Aufgrund der verhältnismä­ßig kurzen Laufzeiten ist eine exakte Angabe des Rotations/Rotationspausen-Ver­hältnisses jedoch nicht möglich. 6. Rotationsexperimente mit EFOF1-Komplexen, die über die C-terminale gamma-Deletion deltaS281-V286 (gamma-6) verfügten, scheiterten möglicherweise aufgrund der Instabilität der Enzymkomplexe. 7. Da die Funktion aktiver EF1-Komplexe durch die gamma-Deletionen offenbar kaum beeinflußt wird, muß davon ausgegangen werden, daß die geringere ATP-Hydroly­seaktivität der Deletionsmutanten durch ein verändertes Verhältnis von aktiven und inaktiven Enzymkomplexen hervorgerufen wird. Die Deletionen beeinflußen damit weniger die mechanische Funktion des Enzyms sondern vielmehr die Stabilität ak­tiver Enzymkomplexe. 8. Mit der Mutante MM10 wurde ein EF1-Komplex erzeugt, der eine Verknüpfung der Rotoruntereinheit gamma mit einer Statoruntereinheit alpha über die Cysteine alphaC280 und gammaC285 ermöglichte. Eine Verknüpfung der beiden Untereinheiten konnte durch Oxidation mit 100 µM DTNB in etwa 30 min zu >90% erreicht werden. Eine Öff­nung der Disulfidbrücke durch Reduktion mit 20 mM DTT erforderte Inkubations­zeiten von bis zu etwa 600 min (Ausbeute >90%). Die Bildung einer Disulfidbrü­cke zwischen alphaC280 und gammaC285 hatte weder einen Einfluß auf die ATP-Hydroly­seaktivität des Enzyms noch auf die Aktivierungsenergie der ATP-Hydrolyse durch MM10-EF1. 9. MM10-EF1 ließ sich im ATP-Hydrolyse-Aktivitätstest über einen Zeitraum von 5 min durch Zugabe von 1 mM AMP-PNP nahezu vollständig hemmen (ca. 96%), während sich mit 1 mM AMP-PNP + 1 mM ADP, 1 mM NaN3 und 1 mM NaN3 + 1 mM ADP nur Inhibierungsgrade von 77-88% erreichen ließen. 10. Durch einen biochemischen Rotationstest konnte die freie Drehbarkeit des C-termi­nalen Bereichs von gamma im alpha3beta3-Hexagon des EF1-Komplexes nachgewiesen werden. Die Drehbarkeit ließ sich auch durch Zugabe von Inhibitoren des Enzym­komplexes im untersuchten Zeitbereich von Stunden nicht blockieren. Dadurch kann nicht bewiesen werden, daß die rotatorische Mobilität des C-terminalen gamma-Be­reichs ausschließlich auf eine katalytisch bedingte gamma-Rotation zurückzuführen ist. Eine weitere Ursache für die rotatorische Mobilität könnte in einer hohen struktu­rellen Flexibilität des gesamten Lagerbereichs von EF1 bestehen. Der Rotationstest zeigt jedoch, daß die durch molekulardynamische Berechnungen nahegelegte Fi­xierung des C-terminalen gamma-Bereichs bei der gamma-Rotation für die Funktion des EF1-Komplexes offenbar keine Rolle spielt. Ein weiterer biochemischer Rotationstest zum Nachweis der Inhibierung der gamma Ro­tationsbewegung durch kompetetive Inhibitoren über einen Zeitraum von etwa 18 h scheiterte offenbar aufgrund der experimentellen Auslegung des Versuchs.

O T3 aumenta a poliadenilação e estabilidade do GH mRNA. O citoesqueleto (Cy) participa da estabilidade e tradução de mRNAs, pois fatores, como o EF 1a, ligam alguns transcritos a ele, aumentando sua estabilidade e tradução. Cy também participa dos processos secretores celulares. Observamos que no hipotiroidismo (Tx), há um desarranjo do Cy nos somatotrofos que é revertido pela administração aguda de T3. Neste estudo avaliamos a ligação do EF 1a e do GH mRNA ao Cy e, deste aos polissomos, na hipófise, e a expressão do IGF-I mRNA hepático, em ratos controle e Tx tratados com T3 ou salina, e sacrificados após 30 min. Observamos redução da F-actina, da ligação do EF 1a e GH mRNA a ela, do GH mRNA nos polissomos, e da expressão de IGF-I mRNA hepático, nos ratos Tx, o que indicou redução da síntese e secreção do GH. A administração de T3 estimulou esses processos, aumentando a estabilidade, tradução do GH mRNA e a secreção de GH, o que ocorreu em paralelo ao rearranjo do Cy, indicando uma ação não genômica do T3. / T3 increases GH mRNA poly-A tail and stability. Cytoskeleton (Cy) plays a part on mRNA stability and translation, since factors, like EF 1a, can bind some transcripts to it, improving stability and translation efficiency. Cy is also involved in cellular secretory process. We showed that somatotropes Cy is disrupted in hypothyroidism (Tx), and rearranged by acute T3 treatment. In this study we investigated the binding of EF 1a and GH mRNA to Cy and of GH mRNA to polysomes in pituitary, as well as the liver IGF-I mRNA content, in control and Tx rats treated with T3 or saline, and killed 30 min thereafter. We observed that Tx reduced F-actin content, EF 1a and GH mRNA binding to it, GH mRNA recruitment to polysomes, in pituitary, and IGF-I mRNA expression in liver, which indicates that GH synthesis and secretion are impaired. Acute T3 treatment stimulated all these process, indicating that stability, translation of GH mRNA and GH secretion were restored. These events occurred in parallel to the Cy rearrangement, which strongly indicates a non genomic effect of T3.

O T3 aumenta a poliadenilação e estabilidade do GH mRNA. O citoesqueleto (Cy) participa da estabilidade e tradução de mRNAs, pois fatores, como o EF 1a, ligam alguns transcritos a ele, aumentando sua estabilidade e tradução. Cy também participa dos processos secretores celulares. Observamos que no hipotiroidismo (Tx), há um desarranjo do Cy nos somatotrofos que é revertido pela administração aguda de T3. Neste estudo avaliamos a ligação do EF 1a e do GH mRNA ao Cy e, deste aos polissomos, na hipófise, e a expressão do IGF-I mRNA hepático, em ratos controle e Tx tratados com T3 ou salina, e sacrificados após 30 min. Observamos redução da F-actina, da ligação do EF 1a e GH mRNA a ela, do GH mRNA nos polissomos, e da expressão de IGF-I mRNA hepático, nos ratos Tx, o que indicou redução da síntese e secreção do GH. A administração de T3 estimulou esses processos, aumentando a estabilidade, tradução do GH mRNA e a secreção de GH, o que ocorreu em paralelo ao rearranjo do Cy, indicando uma ação não genômica do T3. / T3 increases GH mRNA poly-A tail and stability. Cytoskeleton (Cy) plays a part on mRNA stability and translation, since factors, like EF 1a, can bind some transcripts to it, improving stability and translation efficiency. Cy is also involved in cellular secretory process. We showed that somatotropes Cy is disrupted in hypothyroidism (Tx), and rearranged by acute T3 treatment. In this study we investigated the binding of EF 1a and GH mRNA to Cy and of GH mRNA to polysomes in pituitary, as well as the liver IGF-I mRNA content, in control and Tx rats treated with T3 or saline, and killed 30 min thereafter. We observed that Tx reduced F-actin content, EF 1a and GH mRNA binding to it, GH mRNA recruitment to polysomes, in pituitary, and IGF-I mRNA expression in liver, which indicates that GH synthesis and secretion are impaired. Acute T3 treatment stimulated all these process, indicating that stability, translation of GH mRNA and GH secretion were restored. These events occurred in parallel to the Cy rearrangement, which strongly indicates a non genomic effect of T3.

In dieser Arbeit werden die Synthese eines 286-Reste-langen Proteins, der γ-Untereinheit der ATP-Synthase, seine Rückfaltung und Rekonstitution zum aktiven Proteinkomplex gezeigt.

1. Aufgrund der Resultate mit der Mutante MM10, die trotz Disulfidbrücke noch unverminderte Aktivität und Rotation zeigte, wurde der Frage nachgegangen, ob der EF1-Komplex in der Lage ist, die Rotation durch einen Bruch der alpha-helikalen Struktur von gamma oder durch Rotation um eine Einfachbindung der Disulfidbrücke aufrechtzuerhalten. Quervernetzungen vom Hexagon mit gamma in der Mitte und am unteren Ende konnten das Enzym blockieren. Von den vier betrachteten Mutanten KG11, MM26, MM25 und MM24 fiel der MM26 bereits nach der Isolierung raus. Der MM25 wies nicht mehr als 70% Quervernetzung auf. Bei dem KG11 und dem MM24 konnte jedoch eine 99%-ige Quervernetzung nachgewiesen werden. Mit diesen zwei Cystein-Doppelmutanten wurden weitere Quervernetzungen gefunden, die ebenso wie der MM10 aktiv nach Oxidation sind, aber tiefer im Enzym liegen und die ATP-Hydrolyse trotz Blockade durch Quervernetzung aufrecht erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass eine Rotation um die Einzelbindungen innerhalb der Disulfidbrücke unwahrscheinlich ist, und daher die Aktivität des quervernetzten Enzyms nur durch eine Aufwindung der gamma-Helix erklärt werden kann. 2. Die Voraussetzung für ein EFOF1-Kostrukt zum optischen Nachweis der Relativrotation unter Synthesebedingungen war der Einbau von zwei verschiedenen Tags zur spezifischen Bindung. Von den vier Mutanten SE3, SE4, SW7 und WH1 zeigten die beiden SE-Mutanten keine Stabilität bei der Isolierung im Bezug auf die Kopplung zwischen FO- und F1-Teil. Mit dem SW7-EFOF1 wurde eine Mutante gefunden, die mit einer guten Aktivitäts- und Rotationsausbeute nach einer Aufreinigung mittels Streptactin-Affinitätchromatographie durch ihre Stabilität als Ausgangspunkt für das Rotationsexperiment unter ATP-Synthese dienen kann. Der WH1, dessen atp-Operon dem des SW7 gleicht, brachte trotz seines veränderten Vektorursprungs keine Verbesserung.