Das molekulare Drehlager der ATP-Synthase 1. Sechs verschiedene EF1-Deletionsmutanten mit verkürzten gamma-Untereinheiten wur­den mittels PCR hergestellt. Die Deletionen befinden sich jeweils am C-terminalen Ende der Untereinheit und umfassen 3 (MM16), 6 (MM20), 9 (MM17), 12 (MM8), 15 (MM18) und 18 (MM19) Aminosäurereste. 2. Durch einen Wachstumstest auf Succinat-Agarplatten wurde festgestellt, daß die von den Plasmiden pMM16, pMM20, pMM17 und pMM8 codierten ATP-Syntha­sen in E. coli DK8 funktionell exprimiert werden können, während pMM18 und pMM19 funktionsunfähige ATP-Synthasen liefern. Die Wachstumsgeschwindig­keit der DK8-Mutanten MM16, MM20 und MM17 auf Succinatmedium wird durch die Deletionen nicht beeinflußt. Hingegen besitzt E. coli DK8 pMM8 auf diesem Medium eine um etwa 33% geringere Wachstumsgeschwindigkeit. 3. Die DK8-Klone MM16, MM20, MM17 und MM8 wurden für die Expression und Isolierung von EF1-Komplexen verwendet. MM18 und MM19 lieferten keine mit Hilfe des S+G-Proteintests nachweisbaren Mengen an EF1. Durch die Verkürzung der Untereinheit gamma kam es bei der Aufreinigung der Enzymkomplexe nicht zu ei­nem verstärkten Verlust dieser Untereinheit. Aufgereinigtes KH7-EF1 (Kontroll-EF1 ohne Verkürzung des gamma-C-Terminus) und die EF1-Komplexe der Deletions­mutanten wiesen ein ähnliches alpha/beta:gamma-Verhältnis auf. 4. Die ATP-Hydrolyseaktivitäten der EF1-Deletionsmutanten zeigten eine starke Ab­hängigkeit von der Deletionslänge. So fielen die Aktivitäten bei 35ºC von 93 u/mg (KH7-EF1) um ca. 75% auf 22 u/mg (MM8-EF1) ab. Dagegen sanken die Aktivie­rungsenergien für die ATP-Hydrolyse durch die EF1-Deletionsmutanten mit zu­nehmender Deletionslänge erheblich schwächer ab. Hier konnte für KH7-EF1 eine Aktivierungsenergie von 54 kJ/mol und für MM8-EF1 35 kJ/mol ermittelt werden. Dies entspricht einer Abnahme um ca. 35%. 5. Das durch die Rotor-Untereinheit gamma erzeugte Drehmoment zeigte nur eine geringe Abhängigkeit von der Deletionslänge. So wiesen die EF1-Komplexe der Deleti­onsmutanten gegenüber KH7-EF1 nur ein um ca. 20% verringertes Drehmoment auf. Eine starke Abhängigkeit von der Deletionslänge wies im mikrovideographi­schen Rotationstest jedoch die Ausbeute an Rotatoren bezogen auf die Beobach­tungszeit der Küvetten auf. Dabei nahm die Ausbeute von KH7-EF1 zu MM8-EF1 erheblich ab. Keine Abhängigkeit von der Deletionslänge zeigte dagegen das Ro­tations/Rotationspausen-Verhältnis innerhalb der Laufzeiten der Rotatoren, die von etwa 10 – 190 s (durchschnittlich ca. 60 s) variierten. Aufgrund der verhältnismä­ßig kurzen Laufzeiten ist eine exakte Angabe des Rotations/Rotationspausen-Ver­hältnisses jedoch nicht möglich. 6. Rotationsexperimente mit EFOF1-Komplexen, die über die C-terminale gamma-Deletion deltaS281-V286 (gamma-6) verfügten, scheiterten möglicherweise aufgrund der Instabilität der Enzymkomplexe. 7. Da die Funktion aktiver EF1-Komplexe durch die gamma-Deletionen offenbar kaum beeinflußt wird, muß davon ausgegangen werden, daß die geringere ATP-Hydroly­seaktivität der Deletionsmutanten durch ein verändertes Verhältnis von aktiven und inaktiven Enzymkomplexen hervorgerufen wird. Die Deletionen beeinflußen damit weniger die mechanische Funktion des Enzyms sondern vielmehr die Stabilität ak­tiver Enzymkomplexe. 8. Mit der Mutante MM10 wurde ein EF1-Komplex erzeugt, der eine Verknüpfung der Rotoruntereinheit gamma mit einer Statoruntereinheit alpha über die Cysteine alphaC280 und gammaC285 ermöglichte. Eine Verknüpfung der beiden Untereinheiten konnte durch Oxidation mit 100 µM DTNB in etwa 30 min zu >90% erreicht werden. Eine Öff­nung der Disulfidbrücke durch Reduktion mit 20 mM DTT erforderte Inkubations­zeiten von bis zu etwa 600 min (Ausbeute >90%). Die Bildung einer Disulfidbrü­cke zwischen alphaC280 und gammaC285 hatte weder einen Einfluß auf die ATP-Hydroly­seaktivität des Enzyms noch auf die Aktivierungsenergie der ATP-Hydrolyse durch MM10-EF1. 9. MM10-EF1 ließ sich im ATP-Hydrolyse-Aktivitätstest über einen Zeitraum von 5 min durch Zugabe von 1 mM AMP-PNP nahezu vollständig hemmen (ca. 96%), während sich mit 1 mM AMP-PNP + 1 mM ADP, 1 mM NaN3 und 1 mM NaN3 + 1 mM ADP nur Inhibierungsgrade von 77-88% erreichen ließen. 10. Durch einen biochemischen Rotationstest konnte die freie Drehbarkeit des C-termi­nalen Bereichs von gamma im alpha3beta3-Hexagon des EF1-Komplexes nachgewiesen werden. Die Drehbarkeit ließ sich auch durch Zugabe von Inhibitoren des Enzym­komplexes im untersuchten Zeitbereich von Stunden nicht blockieren. Dadurch kann nicht bewiesen werden, daß die rotatorische Mobilität des C-terminalen gamma-Be­reichs ausschließlich auf eine katalytisch bedingte gamma-Rotation zurückzuführen ist. Eine weitere Ursache für die rotatorische Mobilität könnte in einer hohen struktu­rellen Flexibilität des gesamten Lagerbereichs von EF1 bestehen. Der Rotationstest zeigt jedoch, daß die durch molekulardynamische Berechnungen nahegelegte Fi­xierung des C-terminalen gamma-Bereichs bei der gamma-Rotation für die Funktion des EF1-Komplexes offenbar keine Rolle spielt. Ein weiterer biochemischer Rotationstest zum Nachweis der Inhibierung der gamma Ro­tationsbewegung durch kompetetive Inhibitoren über einen Zeitraum von etwa 18 h scheiterte offenbar aufgrund der experimentellen Auslegung des Versuchs.

1. Aufgrund der Resultate mit der Mutante MM10, die trotz Disulfidbrücke noch unverminderte Aktivität und Rotation zeigte, wurde der Frage nachgegangen, ob der EF1-Komplex in der Lage ist, die Rotation durch einen Bruch der alpha-helikalen Struktur von gamma oder durch Rotation um eine Einfachbindung der Disulfidbrücke aufrechtzuerhalten. Quervernetzungen vom Hexagon mit gamma in der Mitte und am unteren Ende konnten das Enzym blockieren. Von den vier betrachteten Mutanten KG11, MM26, MM25 und MM24 fiel der MM26 bereits nach der Isolierung raus. Der MM25 wies nicht mehr als 70% Quervernetzung auf. Bei dem KG11 und dem MM24 konnte jedoch eine 99%-ige Quervernetzung nachgewiesen werden. Mit diesen zwei Cystein-Doppelmutanten wurden weitere Quervernetzungen gefunden, die ebenso wie der MM10 aktiv nach Oxidation sind, aber tiefer im Enzym liegen und die ATP-Hydrolyse trotz Blockade durch Quervernetzung aufrecht erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass eine Rotation um die Einzelbindungen innerhalb der Disulfidbrücke unwahrscheinlich ist, und daher die Aktivität des quervernetzten Enzyms nur durch eine Aufwindung der gamma-Helix erklärt werden kann. 2. Die Voraussetzung für ein EFOF1-Kostrukt zum optischen Nachweis der Relativrotation unter Synthesebedingungen war der Einbau von zwei verschiedenen Tags zur spezifischen Bindung. Von den vier Mutanten SE3, SE4, SW7 und WH1 zeigten die beiden SE-Mutanten keine Stabilität bei der Isolierung im Bezug auf die Kopplung zwischen FO- und F1-Teil. Mit dem SW7-EFOF1 wurde eine Mutante gefunden, die mit einer guten Aktivitäts- und Rotationsausbeute nach einer Aufreinigung mittels Streptactin-Affinitätchromatographie durch ihre Stabilität als Ausgangspunkt für das Rotationsexperiment unter ATP-Synthese dienen kann. Der WH1, dessen atp-Operon dem des SW7 gleicht, brachte trotz seines veränderten Vektorursprungs keine Verbesserung.