Die vorliegende Arbeit befasst sich mit zwei neuen methodischen Ansätzen auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie. Im ersten Teil der Arbeit wir eine Methode vorgestellt, mit der die Winkelselektivität der Fluoreszenzanregung verbessert werden kann. Die ExPAN (excitation polarization angle narrowing) genannte Technik nutzt stimulierte Emission, um den Effekt der Photoselektion zu vergrößern. ExPAN lässt sich potentiell für verschiedene Methoden einsetzen, in denen fluoreszenzmarkierte Proben untersucht werden und ist insbesondere im Kontext von Fluoreszenzanisotropie-Messungen oder der Bestimmung von molekularen Orientierungen von Interesse. Solche Methoden finden in den Biowissenschaften breite Anwendung und werden z.B. zum Studium von Rezeptor-Liganden-Interaktionen oder der Proteindynamik eingesetzt. Im Rahmen der Arbeit wird ExPAN in Kombination mit einem neuen Ansatz in der Weitfeldmikroskopie untersucht, bei der die Orientierung von Farbstoffmolekülen als Kontrastmechanismus genutzt wird. Dabei wird die Polarisationsrichtung des Anregungslichts rotiert, um Informationen über die molekulare Orientierung zu gewinnen. Aufgrund der Photoselektion weist das Fluoreszenzsignal von Molekülen mit bevorzugter Ausrichtung dadurch eine periodische Modulation auf. Es wird gezeigt, dass diese Information zur Unterscheidung von Molekülen mit abweichender Orientierung genutzt werden kann, selbst wenn sich deren Signale räumlich überlagern. Für die Versuche wurde ein modifiziertes Weitfeld-Mikroskop konstruiert und die Methode zum einen experimentell an Einzelmolekülen und zum anderen mittels Simulationen erprobt. Dabei konnten Signale von Farbstoffmolekülen mit einem Abstand von bis zu 80 nm separiert werden. Darüber hinaus wurde ein moduliertes Fluoreszenzsignal bei oberflächenmarkierten Mikropartikeln in wässriger Lösung sowie bei fixierten biologischen Proben beobachtet. Eine Verbesserung der Photoselektion durch ExPAN wird experimentell nachgewiesen und gezeigt, dass mit ExPAN auch ähnlich orientierte Moleküle unterschieden werden können. Im zweiten Teil der Arbeit wird eine Methode zur Verbesserung der Auflösung von konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen vorgestellt, die als Multidetektor-Scanning (MDS) bezeichnet wird und auf dem Prinzip der Image-Scanning-Mikroskopie (ISM) beruht. Mit ISM lässt sich die Auflösung von Fluoreszenzmikroskopen theoretisch verdoppeln. Da ISM einen Flächendetektor voraussetzt, wurden in der Vergangenheit hauptsächlich CCD oder CMOS Kameras als Detektoren eingesetzt. In dieser Arbeit werden anstelle einer Kamera mehrere Einzelphotonendetektoren verwendet und über ein Glasfaserbündel zu einem Flächendetektor kombiniert. Dadurch ist es erstmals möglich, die Methode in Verbindung mit Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM) einzusetzen. FLIM hat sich in den Biowissenschaften als wichtige Mikroskopie-Technik etabliert und wird unter anderem bei Protein-Protein-Interaktionsstudien oder zur Untersuchung des NADH-Metabolismus eingesetzt. Die Verbesserung der räumlichen Auflösung von FLIM mit MDS ist somit für eine Reihe von biologischen Fragestellungen von potentiellem Interesse. Im Rahmen der Arbeit wurde ein Multidetektor-Scanning-Mikroskop konstruiert und durch die Vermessung von fluoreszierenden Mikropartikeln charakterisiert. Eine Verbesserung der Auflösung durch MDS wird an fixierten biologischen Proben demonstriert. Dabei wurde eine Auflösung von 168 nm mit MDS sowie 146 nm mit MDS und Dekonvolution erreicht. Schließlich wird die Kombination der Methode mit Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie demonstriert.

Quantentechnologien sind im Begriff sich von Laborversuchen zu effizienten Anwendungen zu entwickeln. Die Quantenzustände einzelner Photonen spielen dabei die Rolle als Bindeglied zwischen stationären Quantensystemen. Ein hybrider Ansatz wird verfolgt, um die Wechselwirkung gezielt zwischen im Wellenleiter geleiteten Photonen und gekoppelten Quantenemittern zu erreichen. Die Dissertation untersucht zwei zentrale Aspekte solcher hybriden photonischen Quantentechnologien: die effiziente Erzeugung von Photonen und die Optimierung von photonischen Strukturen. Der erste Teil dieser Arbeit behandelt die Entwicklung einer optischen Mikrotechnology. Integrierte nano-photonische Wellenleiter aus Siliziumnitrid wurden für die Kopplung zu Quantenemittern entworfen, optimiert und optisch untersucht. Das finale Design wurde erfolgreich in Kopplungsexperimenten verwendet, bei denen 42 % der Fluoreszenz eines einzelnen Moleküls an einen Wellenleiter gekoppelt wurde. Der zweite Teil der Arbeit untersucht zwei Einzelphotonenquellen. Zunächst wurde ein neuartiger Einzelphotonenemitter basierend auf Defektzentren in Zinkoxid optisch bei tiefen Temperaturen untersucht. Es konnte im Zuge dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass die Photonen von nano-strukturiertem Zinkoxid sehr schmalbandige Emission aufweisen. Im letzten Teil, wird eine Einzelphotonenquelle bestehend aus einem organischen Molekül untersucht. Bei kryogenen Temperaturen wurden Lebenszeit-limitierte Linienbreiten auf den Molekülproben detektiert. Die Rabi-Oszillationen zwischen den Molekülzuständen konnten akkurat durch eine quantenmechanische Theorie beschrieben werden, wodurch die Vermessung der Dephasierung des Quantensystems durch die nanoskopische Umgebung präzise studiert werden konnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zur Kopplung von Einzelphotonenquellen stellen die Grundlage für weitere Anwendungen durch eine photonische Quantentechnologie dar. / Quantum technologies are on the verge to transition from laboratory experiments to efficient integrated applications. The quantum states of photons are the connecting link between individual stationary quantum systems. A hybrid approach is employed to tailor the interaction of routed photons with optically coupled quantum systems. The thesis investigates two core aspects of a hybrid photonic quantum technology: efficient single photon generation and optimized photonic micro-structures, suitable to form a hybrid system. In the first part of this work, nano-photonic integrated structures were optimized for efficient coupling to quantum emitters. Optical waveguides based on silicon nitride (SiN) were designed, fabricated, and optically characterized. The final design was successfully employed in coupling experiments, where up to 42% of the fluorescence from a single molecule was coupled to a waveguide. In the second part of this thesis two single photon sources are investigated towards their implementation into a hybrid photonic system. First, a novel single photon source based on a defect center in zinc oxide was optically investigated at room-temperature and cryogenic temperature. Spectrally narrow zero-phonon lines of the fluorescence from nano-structured zinc oxide were measured for the first time during this work. A second emitter system, based on an organic dye molecule was investigated in the final part of this research. At cryogenic temperatures, single molecules showed lifetime-limited linewidths of <50MHz. A resonant laser source drives Rabi oscillations, which are accurately described by the quantum mechanical theory of a two-level system. The system's decoherence was mapped, illustrating the quantum sensing capabilities of the system. The results presented in this thesis on coupling efficiencies and single emitter performance provide the necessary background of the elements composing a future hybrid technology.

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Knochenmarks-Stromazellen sind in den letzten Jahren in den Fokus der Forschung gerückt. Es konnte gezeigt werden, dass sie durch Bereitstellung von Überlebenssignalen essenziell für die Erhaltung hämatopoetischer Nischen sind. Stromales Interleukin-7 (IL-7) konnte dabei für T Zellen als Überlebenssignal identifiziert werden. Gemeinsam ist allen Stromazellen die Expression des Oberflächenmarkers CD106/VCAM-1. Ein effizientes Protokoll erlaubte die qualitative wie quantitative Isolation von Stromazellen aus dem murinen Knochenmark mit anschließender ex vivo Microarray-Analyse. Die auf diese Weise ermittelten Kandidaten-Marker wurden auf Proteinebene via Histologie und (Hochdurchsatz-) Durchflusszytometrie validier. Dazu gehören z.B. die Marker CD1d, gas6 oder ANXA2R. CD1d wurde als guter Interimsmarker für VCAM-1+PECAM-1- Stromazellen identifiziert, wohingegen die IL-7-Produzenten in der Population von CD200int/BP 1+/CD73+/CD105- angereichert sind. Gleiches gilt für den Transkriptionsfaktor Prrx1. CD55, BP-1 and Cadherin-11 zeigten eine Expressionsmuster in Abhängigkeit des verwendeten IL-7-Reportermaus-Haplotyps. Für BP-1 und Cadherin 11 konnte die Abwesenheit von reifen Lymphozyten als Ursache des Feedbacks ausgeschlossen werden. Die Haplotypen der Reportermaus legten auch eine monoallele Expression des IL-7 nahe. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen VCAM-1+ (IL-7+/-) Stromazellen als heterogene Population, wenn es nach der Vielzahl der möglichen exprimierten Marker geht. Zwischen vielen dieser Marker gibt es aber wiederum auf Zelloberflächenebene einen großen Überlapp. Die funktionelle Relevanz dieser Oberflächenmarker-Diversität wird in weiteren Arbeiten zu klären sein, gibt aber den Stromazellen ein breites Repertoire vor, um Interaktionen mit Lymphozyten zu initiieren, modulieren und inhibieren. Abschließend ist zu erwarten, dass diese Erkenntnisse in die klinische Behandlung der Stroma-Nischen in Autoimmun-Fragestellungen einfließen. / Bone marrow stromal cells receive increasing amounts of attention lately. They have been shown to support survival of hematopoietic stem cells as well as memory lymphocytes which is of great importance when targeting the perseverance of autoimmune diseases. CD4+ memory T lymphocytes reside in the proximity of VCAM-1 expressing stromal cells which provide them with survival signals such as Interleukin-7. Herein, a protocol was developed to quantitatively obtain VCAM-1+ and VCAM-1+ IL-7+/- stromal cells via enzymatic/mechanic digestion and cytoskeleton-inhibition. Ex vivo gene expression analysis was performed from sorted, pure cells with good recovery. Candidate genes/markers were validated in (high-throughput) flow cytometry and histological analysis including subsequent semi-automated colocalization was performed. CD1d was found to be good surrogate marker for VCAM-1+PECAM-1- non-endothelial stroma while the population of CD200int/BP-1+/CD73+/CD105- stromal cells is greatly enriched in IL-7 producers which was equally true for the stromal transcription factor Prrx1. CD55, BP-1 and Cadherin-11 were found to be differentially expressed in differing IL-7 reporter mice haplotypes. The reporter mice haplotypes revealed monoallelic expression features of IL-7. All methodologies suggest that VCAM-1+ as well as IL-7+/- stromal cells are heterogeneous by marker expression yet don’t cluster extensively in flow cytometry co-stains. The functional relevance of the marker diversity described in this thesis remains to be tested but insinuates a broad repertoire for bone marrow stroma cells for new interaction pathways with lymphocyte subsets. Ultimately, this knowledge will hopefully feedback to clinical questions of autoimmunity for targeted treatment of stromal niches.