Darmstadt, Techn. University, Diss., 2007.

Master-Arbeit Univ. St. Gallen, 2006.

Knochenmarks-Stromazellen sind in den letzten Jahren in den Fokus der Forschung gerückt. Es konnte gezeigt werden, dass sie durch Bereitstellung von Überlebenssignalen essenziell für die Erhaltung hämatopoetischer Nischen sind. Stromales Interleukin-7 (IL-7) konnte dabei für T Zellen als Überlebenssignal identifiziert werden. Gemeinsam ist allen Stromazellen die Expression des Oberflächenmarkers CD106/VCAM-1. Ein effizientes Protokoll erlaubte die qualitative wie quantitative Isolation von Stromazellen aus dem murinen Knochenmark mit anschließender ex vivo Microarray-Analyse. Die auf diese Weise ermittelten Kandidaten-Marker wurden auf Proteinebene via Histologie und (Hochdurchsatz-) Durchflusszytometrie validier. Dazu gehören z.B. die Marker CD1d, gas6 oder ANXA2R. CD1d wurde als guter Interimsmarker für VCAM-1+PECAM-1- Stromazellen identifiziert, wohingegen die IL-7-Produzenten in der Population von CD200int/BP 1+/CD73+/CD105- angereichert sind. Gleiches gilt für den Transkriptionsfaktor Prrx1. CD55, BP-1 and Cadherin-11 zeigten eine Expressionsmuster in Abhängigkeit des verwendeten IL-7-Reportermaus-Haplotyps. Für BP-1 und Cadherin 11 konnte die Abwesenheit von reifen Lymphozyten als Ursache des Feedbacks ausgeschlossen werden. Die Haplotypen der Reportermaus legten auch eine monoallele Expression des IL-7 nahe. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen VCAM-1+ (IL-7+/-) Stromazellen als heterogene Population, wenn es nach der Vielzahl der möglichen exprimierten Marker geht. Zwischen vielen dieser Marker gibt es aber wiederum auf Zelloberflächenebene einen großen Überlapp. Die funktionelle Relevanz dieser Oberflächenmarker-Diversität wird in weiteren Arbeiten zu klären sein, gibt aber den Stromazellen ein breites Repertoire vor, um Interaktionen mit Lymphozyten zu initiieren, modulieren und inhibieren. Abschließend ist zu erwarten, dass diese Erkenntnisse in die klinische Behandlung der Stroma-Nischen in Autoimmun-Fragestellungen einfließen. / Bone marrow stromal cells receive increasing amounts of attention lately. They have been shown to support survival of hematopoietic stem cells as well as memory lymphocytes which is of great importance when targeting the perseverance of autoimmune diseases. CD4+ memory T lymphocytes reside in the proximity of VCAM-1 expressing stromal cells which provide them with survival signals such as Interleukin-7. Herein, a protocol was developed to quantitatively obtain VCAM-1+ and VCAM-1+ IL-7+/- stromal cells via enzymatic/mechanic digestion and cytoskeleton-inhibition. Ex vivo gene expression analysis was performed from sorted, pure cells with good recovery. Candidate genes/markers were validated in (high-throughput) flow cytometry and histological analysis including subsequent semi-automated colocalization was performed. CD1d was found to be good surrogate marker for VCAM-1+PECAM-1- non-endothelial stroma while the population of CD200int/BP-1+/CD73+/CD105- stromal cells is greatly enriched in IL-7 producers which was equally true for the stromal transcription factor Prrx1. CD55, BP-1 and Cadherin-11 were found to be differentially expressed in differing IL-7 reporter mice haplotypes. The reporter mice haplotypes revealed monoallelic expression features of IL-7. All methodologies suggest that VCAM-1+ as well as IL-7+/- stromal cells are heterogeneous by marker expression yet don’t cluster extensively in flow cytometry co-stains. The functional relevance of the marker diversity described in this thesis remains to be tested but insinuates a broad repertoire for bone marrow stroma cells for new interaction pathways with lymphocyte subsets. Ultimately, this knowledge will hopefully feedback to clinical questions of autoimmunity for targeted treatment of stromal niches.

Im Fokus dieser Dissertation steht die Zerstörung des Lebensraumes von Schlangen durch anthropogene Einflüsse im Zusammenhang mit dem Auftreten von Schlangenbissen bei Menschen. Zum Schutz der Schlangen und dem Problem der Schlangenbisse wurden vier wesentliche Anforderungen erarbeitet. Mit Hilfe eines Artenverteilungsmodells wurden die ökologischen Nischen von 29 Giftschlangenarten aus Bangladesch und von zehn Kobraarten (Naja) aus Asien ermittelt. Auf lokaler Ebene wurde festgestellt, dass Überschwemmungen, Waldtypen, Ökosysteme und klimatische Parameter das Verbreitungsgebiet der Schlangenarten in Bangladesch beeinflussen. Auf regionaler Ebene sind anthropogene Faktoren wie die Zerstörung von Schlangenlebensräumen, Handel, Ausbeutung und Tötung von Schlangen wahrscheinlich die Hauptursachen für den Rückgang der Populationen der asiatischen Naja. Auf beiden Ebenen führt der Klimawandel zu einer Verkleinerung der ökologischen Nischen von Schlangenarten in Bangladesch und Asien. In Bangladesch könnten die untersuchten Arten innerhalb der nächsten 50 Jahre mehr als 90 % ihren derzeitigen Lebensraum verlieren (Asiatische Naja durchschnittlich 56 % (12 bis 100 %)). Wenn günstige Nischen nicht erhalten werden können, könnten viele Schlangenarten in einigen Ländern Asiens, darunter Bangladesch, in wenigen Jahrzehnten aussterben. Darüber hinaus wurde in der vorliegenden Studie geschätzt, dass die Zahl der jährlichen Schlangenbisse in Bangladesch mehr als doppelt so hoch sein könnte wie bisher angenommen. Da der Klimawandel zu einer geografischen Verschiebung günstiger Nischen führen kann, kann sich diese Veränderung auch auf die Häufigkeit von Schlangenbissen auswirken. Bei der Analyse von Giftvariationen und der Wirksamkeit von Antivenomen wurde festgestellt, dass isolierte Populationen deutliche intraspezifischere Giftvariationen zeigen. / Snakes are threatened by habitat degradation and anthropogenic impacts, while accidental encounters between humans and snakes may result in snakebite incidents. Thus, the conservation of snakes snakebite problem, a global public health emergency, are interconnected. I found four primary needs for a combined solution to satisfy both above causes. A species distribution model was employed to identify the ecological niches of 29 venomous snake species from Bangladesh and of ten cobra species (Naja) from Asia. At the local scale, flood events, forest types, ecosystems, and climatic parameters were found to shape the range of snake species in Bangladesh. At the regional scale, anthropogenic factors, like snake habitat destruction, trade, exploitation, and snake killings are likely to be the main causes for the decrease in populations of Asian Naja. At both levels, climate change causes shrinking and fragmenting the ecological niches of snake species in Bangladesh and Asia. In Bangladesh, the studied species may lose more than 90% of their current climatic niche within the next 50 years. In the same timeframe, Asiatic Naja may lose an average of 56% (12- 100%) of the area of suitable climatic niches. If favourable niches cannot be preserved, many snake species might go extinct from several countries in Asia in a few decades, including Bangladesh. In addition, the present study estimated that there might be more than double the amount of annual snakebite incidents in Bangladesh than previously estimated. As climate change may cause geographical shifting of favourable niches, this change may also have consequences for the frequency of snakebites, so snakebite should be considered a climate driven dynamic public health problem. While analysing venom variations and the efficacy of antivenom, I found that venom should be sampled from geographically or ecologically isolated populations of each venomous snake, because isolated populations have shown distinct intraspecific venom variations.

Gedächtnis-B-Zellen und Plasmazellen sind essentielle Komponenten der protektiven Immunität. Die Mechanismen ihrer Induktion, ihres Überlebens und der Gedächtnis-B-Zellreaktivierung sind allerding bisher nur unvollständig verstanden. Um unser Wissen diesbezüglich zu erweitern, wurden in der vorliegenden Arbeit zum einen Charakteristika von Primär- und Sekundärimmunantworten nach Immunisierung mit Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) untersucht und zum anderen das Vorkommen sowie der Phänotyp humaner Gedächtnis-B-Zellen in verschiedenen lymphatischen Geweben analysiert. Die primäre parenterale KLH Immunisierung führte auf serologischer und zellulärer Ebene zu einer Reihe unerwarteter Ergebnisse, welche u. a. das Auftreten von IgA Antikörpern und die gleichzeitige Präsenz von hoch- und wenig mutierten primären Plasmablasten beinhalteten. Die Untersuchung der Gedächtnis-B-Zellverteilung in verschiedenen lymphatischen Geweben ergab den größten Gedächtnis-B-Zellpool in der Milz. Blut-, Tonsillen-, Knochenmarks- und Milz-Gedächtnis-B-Zellen wiesen nur wenige phänotypische Unterschiede auf. Einer davon war die CD69 Expression auf tonsillären ruhenden Gedächtnis-B-Zellen, was darauf hindeutet, dass tonsilläre Gedächtnis-B-Zellen tatsächlich sessil sein könnten. Die hier erhaltenen Ergebnisse stellen neue Erkenntnisse über bisher unbeschriebene Mechanismen bei parenteralen Immunantworten wie zum Beispiel die Induktion von IgA Antikörpern sowie die potentielle Rekrutierung kreuzreaktiver Gedächtnis-B-Zellen dar. Es bleibt zu klären, wie die Reaktivierung solcher Gedächtnis-B-Zellen reguliert ist. Derartiges Wissen wäre insbesondere für Therapien von Erkrankungen des Immunsystems, wie Autoimmunität, von Bedeutung. Das potentiell patrouillierende Verhalten der Gedächtnis-B-Zellen ist ein markanter Unterschied zu den nischenabhängigen sessilen Plasmazellen und deutet weitestgehend darauf hin, dass Gedächtnis-B-Zellen nicht auf derartige Nischen angewiesen sind. / Memory B cells (mBC) and antibodies are major mediators of protective immune responses yet the mechanisms of their induction, maintenance and mBC reactivation are poorly understood. Therefore, to enhance knowledge in this regard this study comprehensively characterized a human primary and secondary B cell immune response to Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH). Secondly, mBC maintenance was investigated by a systematic analysis of mBC presence, frequency and phenotype within different lymphoid organs. Parenteral primary KLH immunization yielded unexpected results on the serological and B cellular level, including KLH-specific IgA antibody induction, the simultaneous presence of low and highly mutated circulating KLH-specific primary plasmablasts and only little clonal overlap between the primary, memory and secondary KLH-specific B cell repertoires. With respect to the organ distribution of human mBC, the spleen was identified as a major mBC reservoir. Splenic, tonsillar, bone marrow and blood mBC pools exhibited a largely comparable phenotype. Yet, we found tonsillar mBC to express CD69. Due to their resting state tonsillar mBC could therefore constitute a tissue resident cell population. The observations described allow insights into hitherto unknown potential mechanisms behind primary immune responses, i.e. prominent IgA induction by parenteral challenge and inclusion of cross-reactive mBC. The so far unclear regulatory players involved deserve future investigation, as such knowledge may be crucial for therapeutic interventions in immune system disorders. Furthermore, strikingly different to the resident plasma cells in the bone marrow, mBC appear to distribute between lymphoid organs and continuously recirculate in peripheral blood indicative of their potential permanent screening activities, suggesting that human mBC do not require one dedicated niche for their principle survival.