Die beständige Autoantikörperproduktion in Patienten mit Systemischem Lupus Erythematodes (SLE) suggeriert die Existenz eines autoreaktiven humoralen Gedächtnisses; die Häufigkeit selbstreaktiver Gedächtnis-B-Zellen in SLE wurde jedoch noch nicht ermittelt. Unter normalen Umständen exprimieren neu gebildete B-Zellen im Knochenmark Autoantikörper mit hoher Frequenz, darunter auch antinukleäre Antikörper. Diese autoreaktiven B Zellen unterliegen einer strengen Überwachung an zwei Kontrollpunkten für Selbsttoleranz, einer im Knochenmark und einer in der Peripherie. Im Gegensatz dazu steht SLE mit einem Defekt in Zusammenhang, der die Etablierung von B-Zell-Toleranz an diesen beiden Kontrollpunkten verhindert und somit einer hohe Anzahl selbstreaktiver naiver B-Zellen in der Peripherie. Das Ziel dieser Studie war die Bestimmung der molekularen Eigenschaften und Reaktivitäten von IgG Gedächtnis-B-Zell-Antikörpern in SLE. Mittels einer Einzelzell-PCR basierten Methode wurden 200 monoklonale Antikörper von einzelnen IgG+ Gedächtnis-B-Zellen vier unbehandelter SLE Patienten kloniert. Die generelle Häufigkeit an polyreaktiven und HEp-2 selbstreaktiven Antikörpern in dieser Population war vergleichbar mit der in gesunden Vergleichspersonen. 15% der Antikörper aus IgG+ Gedächtnis-B-Zellen eines Patienten mit Serum-Autoantikörpertitern derselben Spezifität waren hochreaktiv und spezifisch gegen die SLE-assoziierten löslichen Kernantigene Ro52 und La; nicht jedoch in den übrigen drei Patienten oder gesunden Vergleichspersonen. Die Keimbahnkonfigurationen dieser Antikörper gegen Kernantigen waren nicht-selbstreaktiv oder polyreaktiv mit schwacher Ro52-Bindung und untermauern die Theorie, dass somatische Mutationen zur Reaktivität und Spezifität von Autoantikörpern beitragen. Die Häufigkeitsvarianz, mit der Gedächtnis-B-Zellen SLE-assoziierte Antikörper exprimieren, legt nahe, dass dies eine wichtig Variable für den Erfolg von Therapien sein kann, die diese Population beseitigen. / Persistent autoantibody production in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) suggests the existence of autoreactive humoral immunological memory, but the frequency of self-reactive memory B cells in SLE has not been determined. Under normal circumstances, autoantibodies including antinuclear antibodies (ANAs) are frequently expressed by newly generated B cells in the bone marrow, but these autoreactive B cells are tightly regulated at two checkpoints for self-tolerance, in the bone marrow and the periphery, before maturation into naïve immunocompetent B cells. In contrast, SLE is associated with a failure to establish B cell tolerance at the two checkpoints leading to high numbers of autoreactive naïve B cells in the periphery. The aim of this study was to determine the molecular features and reactivities of IgG memory B cell antibodies expressed in SLE. A single-cell PCR based strategy was applied that allowed the cloning of the Ig heavy and Ig light chain genes of a single purified B cell and the in vitro expression of 200 recombinant monoclonal antibod-ies from single IgG+ memory B cells of four untreated SLE patients. The overall frequency of polyreactive and HEp-2 self-reactive antibodies in this compartment was similar to healthy controls (HC). 15% of IgG memory B cell antibodies were highly reactive and specific for SLE-associated extractable nuclear antigens (ENAs) Ro52 and La in one patient with serum autoantibody titers of the same specificity but not in the other three patients or healthy individuals. The germline forms of the ENA antibodies were non-self-reactive or polyreactive with low binding to Ro52 supporting the idea that somatic mutations contribute to autoantibody specificity and reactivity. Heterogeneity in the frequency of memory B cells expressing SLE-associated autoantibodies suggests that this variable may be important in the outcome of therapies that ablate this compartment.

Klassenwechsel (CSR, class switch recombination) bezeichnet eine B-Zellen spezifische, somatische Rekombination. Sie ersetzt den konstanten Abschnitt der immunoglobulin schweren Kette (Igh), wenn die Zelle auf ein Antikörper trifft oder durch in vitro Aktivierung. Dadurch wechseln B-Zellen die exprimierten IgM Antikörpermoleküle zu anderen Isotypen (IgG, IgE oder IgA), welche die selbe Antikörperaffinität besitzen, aber eine andere Effektorfunktion. Dieser Vorgang ist elementar im Aufbau einer effektiven Immunantwort, da Defekte bei der CSR zu erhöhten IgM-Leveln führen und primären Anitkörperdefizit. Diese wurden bereits mit Autoimmunität, Autoinflamations-Syndrome und erhöhte Anfälligkeit für Infektionen und Krebs in Verbindung gebracht. CSR ist ein komplexer, physiologischer, vielgliedriger Prozess, welcher die Bildung und Reparatur von Doppelstrangbrüchen durch verschiedene molekulare Mechanismen leitet und welcher noch nicht vollständig verstanden ist. Das Ziel dieser Studie war daher die Identifikation neuer CSR-Faktoren und die Charakterisierung ihrer Rolle(n) innerhalb dieser Reaktion. Dafür wurde eine CH12-Lymphoma B-Zelllinie mit einem robusten Funktionsverlust der CSR erstellt. Diese wurden in vitro aktiviert um Antikörperisotypdifferenzierung zu IgA mit hoher Effizienz vorzunehmen. Ein Ergebnis dieser Arbeit ist die Identifikation von ZMYND8 als Notwendig für den CSR. Dieser Faktor bindet und reguliert die Transkription der regulatorischen 3´ Region, welcher ein super-enhancer am 3´ Ende der Igh Region ist, und die Antikörperisotypdifferenzierung reguliert. Davon unabhängig wurde PDAP1 als neuer Faktor für effiziente CSR identifiziert. Abschließend tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zum weiteren Verständniss der Regulierung der Antikörperisotypdifferenzierung sowie der Aktivität von B-Zellen während der Immunantwort. / Class Switch Recombination (CSR) is a B-cell specific somatic recombination reaction that replaces the constant region of the immunoglobulin heavy chain (Igh) locus upon antigen encountering or in vitro cell activation. As a consequence, B cells switch from expressing IgM antibody molecules to another isotype (IgG, IgE or IgA), which harbor the same antigen affinity but different effector function. This process is essential for the establishment of an effective immune response since defects in CSR lead to increased serum IgM levels and primary antibody deficiencies, which are associated with autoimmunity, auto-inflammatory syndromes, increased sensitivity to infections and cancer. CSR is a complex physiological multistep process that involves the formation and repair of double strand breaks through different molecular mechanisms that have not been fully elucidated yet. Therefore, the aim of this study was to identify novel CSR factors, and characterize their role(s) in the reaction. To do so, a robust functional loss of CSR screen was set-up and performed in the CH12 lymphoma B cell line. These cells can be activated in vitro to undergo antibody isotype differentiation to IgA with high efficiency. As a result of this screen, the chromatin reader ZMYND8 was found to be required for CSR. Specifically, this factor binds and modulates the transcriptional activity of the 3’ regulatory region, which is a super-enhancer located at the 3’ end of the Igh locus that controls antibody isotype differentiation. Furthermore, PDAP1 was independently identified as a novel factor necessary for efficient CSR. Conclusively, the results of this thesis contributed to further understand the processes regulating antibody isotype differentiation and B cell activity during an immune response.

Apoptoseresistenz ist einer der Gründe für ein Versagen von Chemotherapie bei vielen Krebserkrankungen, darunter das Burkitt Lymphom. Um die molekularen Mechanismen der Apoptoseresistenz aufzuklären, wurde die Apoptoseinduktion in 15 Burkitt-Lymphom-Zelllinien nach Behandlung mit den Spindelgiften Taxol (Paclitaxel), Nocodazol und Vincristin untersucht. Interessanterweise entwickelten Zellen, die sich als resistent gegenüber Taxol- und Nocodazol-induzierter Apoptose erwiesen, nach Behandlung eine Polyploidie (>4N DNA), was eine inverse Relation von Apoptose und Polyploidie aufzeigt. In den sensitiven Zelllinien war die Taxol- und Nocodazol-induzierte Apoptose von Caspase-Aktivierung, Bid-Spaltung und Herunterregulation von Mcl-1 begleitet. Im Gegensatz zu den sensitiven Zelllinien wiesen die meisten apoptoseresistenten Zellen einen Verlust von Bax und Bak auf und waren durch einen anhaltenden mitotischen Arrest mit Auftreten eines >4N DNA-Gehalts nach Behandlung charakterisiert. Um weitere Einblicke in den Mechanismus der Spindelgift-induzierten Apoptose zu erhalten, wurde die Rolle der mitotische Kinase PLK1 (polo-like kinase) näher untersucht. Eine dominant-negative PLK1-Mutante induziert Apoptose. Allerdings zeigte eine zusätzliche Behandlung mit Spindelgiften keinen synergistischen Effekt, was darauf schließen lässt, dass sowohl Inhibierung von PLK1 als auch Mikrotubuli-destabilisierende Agenzien den gleichen Stress-Signalweg aktivieren. Andererseits unterstützte Überexpression von Wildtyp-PLK1 in Taxol behandelten Zellen die Zellzyklus-Progression. Dies deutet auf eine Verbindung zwischen Zelltodresistenz und genetischer Instabilität (Aneuplodie) hin. Inhibition von Apoptose in sensitiven Zelllinien durch Caspase-Inhibierung förderte Polypoidie, welche die inverse Relation bestätigte. Medikamente, welche die Caspase-Aktivierung unabhängig von Bax und Bak induzieren, könnten eine weitere Möglichkeit zur Behandlung von resistenten Burkitt-Lymphomen darstellen. / Apoptosis resistance is the major cause of chemotherapy failure in most kinds of cancers, including Burkitt lymphomas (BL). To elucidate molecular mechanisms regulating the development of apoptosis resistance, a panel of 15 BL cell lines was investigated for apoptosis induction upon treatment with microtubule inhibitors taxol, nocodazole and vincristine. Significant differences were observed in the extent of apoptosis induction among BL cell lines examined. Interestingly, cell lines exhibiting resistance to taxol- or nocodazole-induced apoptosis, showed development of polyploidy (>4N) and vice versa, displaying an inverse relationship between apoptosis and polyploidy induction. Further, in sensitive cell lines taxol-induced apoptosis was accompanied by caspase activation, Bid cleavage and Mcl-1 down-regulation. In contrast, most apoptosis resistant cell lines exhibited a loss of Bax and Bak expression and showed prolonged mitotic arrest with >4N DNA content upon treatment. To gain mechanistic insights into microtubule inhibitor-induced cell death, the role of the mitotic kinase PLK1 was addressed. Dominant negative PLK1 mutant induced apoptosis, however, failed to show synergism in induction of apoptosis in combination with microtubule inhibitors. This indicates that PLK1 inhibition and spindle toxins might trigger a similar mitotic stress pathway. Conversely, overexpression of wildtype PLK1 promoted cell cycle progression in cells treated with taxol. Remarkably, inhibition of apoptosis in sensitive cell lines by caspase inhibition promoted polyploidy confirming the inverse relationship between apoptosis and polyploidization. Considering targets to induce Bax/Bak independent caspase activation would be of great importance to avoid undesirable events leading to chromosomal imbalances in treating resistant cancers.

Ein zentrales Merkmal der humoralen Antwort ist die im Laufe der Zeit ansteigende Affinität der Antikörper gegenüber dem Antigen, ein Phänomen, das man generell als Affinitätsreifung bezeichnet. Die Affinitätsreifung von Antikörpern ist an die transiente Ausbildung von Keimzentren gebunden, die man nach Immunisierung mit einem T-Zell-abhängigen Antigen in sekundär lymphatischen Geweben wie der Milz beobachtet. Innerhalb der Keimzentren durchlaufen B-Zellen einen mikro-evolutionären Prozess, in dessen Verlauf es zu einer Diversifizierung der von den B-Zellen kodierten B-Zell-Rezeptoren durch somatische Hypermutation und anschließender Selektion derjenigen B-Zellen mit den besten Bindungseigenschaften gegenüber dem Antigen kommt. In den letzten Jahren waren große Fortschritte hinsichtlich der Aufklärung der molekularen Mechanismen die zur Diversifizierung der B-Zell-Rezeptoren beitragen zu verzeichnen, wohingegen die Dynamik, der Mechanismus und die treibenden Kräfte der Selektion bisher weitgehend unverstanden sind. In Kürze zusammengefasst trägt die vorliegende Arbeit durch folgende Erkenntnisse zum Verständnis der Evolution von B-Zellen in Keimzentren bei: (1) nicht-synchronisiertes Wachstumsverhalten von Keimzentren, (2) mehrstufige Selektionsstrategie (Verknüpfung von lokaler und globaler Selektion durch Rezirkulation von ausgewanderten Keimzentrums-B-Zellen), (3) zentrale Rolle von Makrophagen für die Homöostase von Keimzentren und die Verhinderung von Autoimmunität, (4) bisher angenommene molekulare Signaturen sind unzulänglich, um positiv und negativ selektierte B-Zellen zu unterscheiden und (5) das Überleben bzw. positive Selektion von Keimzentrums-B-Zellen ist von der Abwesenheit überschüssiger, nachteiliger Mutationen in den CDRs abhängig. / Central to the humoral immune response is the commonly observed improvement of antibody affinity over time, a phenomenon referred to as affinity maturation. Affinity maturation takes place in so-called germinal centers (GC) that are transiently formed in secondary lymphoid tissues (e.g. spleen) following immunization with T cell-dependent antigens. Within GC, B lymphocytes are subjected to a micro-evolutionary process that includes multiple rounds of diversification of their B cell receptors (BCRs) by somatic hypermutation (SHM) and subsequent selection of those B cells showing improved binding characteristics towards the antigen. However, despite recent advances in defining the mechanisms contributing to diversification of B lymphocytes within GC, the dynamics, mechanisms and forces of their selection are poorly understood. The current thesis provides new insights into the evolution of B cells within GC by proposing: (1) non-synchronized GC formation and growth, (2) a multilevel selection strategy (intercalation of local and global selection by recirculation of GC emigrant B cells), (3)a central role for macrophages in retaining germinal center B cell homeostasis and preventing autoimmunity, (4) the failure of commonly supposed molecular signatures to demarcate positively and negatively selected B cells and (5) the survival fate of GC B cells is particularly driven by absence of excess mutations within CDRs that have an adverse effect with respect to antigen binding.

Die systemische Autoimmunerkrankung Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) ist durch die Produktion von autoreaktiven Antikörpern charakterisiert. In wie weit veränderte B-Zellrezeptor (BZR) Signalwege oder Co-Rezeptoren in diesem Prozess involviert sind, ist noch nicht ausreichend im humanen SLE untersucht worden. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit eine detaillierte Analyse des inhibitorischen Co-Rezeptors CD22, der Kinase Syk und Akt in B-Zellen des peripheren Blutes von SLE Patienten durchgeführt. SLE Patienten zeigten eine Dysbalance in BZR abhängigen Signalwegen, welche eine B-Zellsubpopulationen unabhängige Reduktion der p-Syk/p-Akt Ratio versursacht. Diese Verschiebung könnte zu einer defekten negativen Selektion und somit zur Bildung von autoreaktiven Zellen führen, die wiederum durch Überlebensvorteile persistieren könnten. Zusätzlich wurde im peripheren Blut von SLE Patienten eine bislang nicht bekannte CD27 Syk++ B-Zellpopulation nachgewiesen. Diese wies, trotz des fehlenden Gedächtnismarkers CD27, Gedächtnismerkmale auf und könnte für die bekannte erhöhte Plasmazell-induktion in SLE Patienten verantwortlich sein. Somit konnte Syk als intrazellulärer Marker einer Gedächtnispopulation identifiziert werden. Des Weiterem stellt die Wiederherstellung der Balance von Syk- und Akt Phosphorylierung nach BZR Aktivierung einen erfolgsversprechenden Therapieansatz bei SLE Patienten dar, um die Entstehung und das Überleben von autoreaktiven B- und Plasmazellen besser kontrollieren zu können. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is a severe systemic autoimmune disease in which loss of tolerance to nucleic acids results into the production of autoreactive antibodies (Ab) Therefore, B cells might play a key role in the pathogenesis of this disease. However, abnormalities of BCR associated co receptors and downstream kinases with potential implications in selection processes are rare for human SLE. Thus, a comprehensive analysis of the inhibitory BCR co-receptor CD22, the spleen tyrosine kinase (Syk) and the pro-survival serine kinase Akt has been undertaken to gain new insights into potential BCR signaling disturbances in this autoimmune disease. This data indicate that B cells from SLE patients display an intrinsically disturbed balance of BCR related signaling pathways, resulting in a B cell subset independent reduced p-Syk/p-Akt ratio. This may lead to a diminished BCR dependent negative selection and enhanced survival of SLE B cells, permitting the emergence of autoreactive B and plasma cells. Furthermore, SLE patients exhibit an increased frequency of a novel CD27-Syk++ B cell subset with memory features, enhanced tonic BCR signaling and the capacity to differentiate in auto-Ab secreting cells. The current study provides evidence that the use of intracellular markers, such as Syk, could permit a more precise delineation of CD27- memory B cell subsets in autoimmune diseases since the conventional used memory marker CD27 has some limitations. In addition, the balance between the BCR associated kinases Syk and Akt might be a promising therapeutic target to reduce the occurrence of autoreactive B and plasma cells.

Apoptose spielt eine wichtige Rolle bei der Generierung eines funktionellen Lymphozytenrepertoirs. Während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose werden potentiell autoreaktive Zellen eliminiert. Da die molekularen Mechanismen der B-Zell Apoptose weitgehend unbekannt sind, sollten in dieser Arbeit assoziierte Proteine und Gene identifiziert werden. Durch Subklonierung wurde eine Burkitt Lymphom B Zellinie BL60-2 generiert, die sensitiv auf den anti-IgM Stimulus ist. Für den Vergleich apoptotischer und nicht apoptotischer Zellen wurde eine Methode entwickelt in der apoptotische, Phosphatidylserin (PS) positive Zellen, über eine magnetische Separation mit einer Reinheit von bis zu 95 Prozent von nicht apoptotischen Zellen angereichert werden konnten. Mittels der hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese wurden die aufgereinigten Fraktionen apoptotischer und nicht apoptotischer Zellen analysiert und die Proteinmuster verglichen. Anhand massenspektrometrischer Analysen und Edman Abbau konnten bisher folgende differentiell erscheinende Proteinspots identifiziert werden: Lamin B1, b-Aktin, neutrales Calponin, Nucleolin, D4-GDI, hnRNP A1, hnRNP C1/C2, hnRNP K, LSP1, HHR23B, das FUSE-binding Protein, dUTPase, P0, HP1 a. Die Proteine D4-GDI, hnRNPA1 und der Transkriptionsfaktor SP1 werden spezifisch während der anti-IgM induzierten Apoptose gespalten. Der zeitliche Verlauf wurde in einer eindimensionalen Western Blot Analyse bestimmt. Das diese Spaltungen ein Resultat der Aktivierung der Proteasen der Caspase 3 Familie sind, konnte durch Inhibitor Studien mit dem Tetrapeptid z-DEVD-fmk bewiesen werden. Die Spaltung des Transkriptionsfaktors SP1 wurde ebenfalls in in vitro untersucht. Rekombinante Caspase 3 und 7 generieren die gleichen Spaltprodukte, die zuvor in vivo nach anti-IgM induzierter Apoptose detektiert wurden, Caspase 6 hingegen generiert nur ein Fragment. Die spezifische Spaltung des Transkriptionsfaktors beinflußt die DNA Bindungsaktivität, was in einem elektro mobility shift assay gezeigt werden konnte. Die Intensität des SP1/DNA-Komplexes nimmt nach Apoptose-Induktion stark ab, hingegen nimmt die Intensität eines kleineren Komplexes stark zu, was auf die Bindung eines der Spaltprodukte schließen ließ, das möglicherweise transkriptionell inaktiv ist und damit einen wichtigen Apoptose Effektor darstellt. Die Proteasen der Caspase 3 Familie konnten erstmalig als zentrale Regulatoren während der anti-IgM induzierten Apoptose identifiziert werden. Durch die Hemmung mit dem Inhibitor z-DEVD-fmk konnte die Apoptose, sowie charakteristische morphologische Veränderungen, wie die Kernfragmentierung und PS auf die Zelloberfläche gehemmt werden und als Caspase 3 abhängige Veränderungen bestimmt werden. Über verschiedene Methoden der differentiellen Hybridisierung von neu hergestellten l-Zap cDNA-Phagenbanken von nicht stimulierten und anti-IgM stimulierten Burkitt Lymphom Zellen sowie der subtraktiven Klonierung sollten Gene identifiziert werden, die während der anti-IgM induzierten Apoptose differentiell exprimiert werden. Apoptose spezifische Sequenzen wurden angereichert, kloniert und sequenziert. / Apoptosis or programmed cell death is essential in the process controlling lymphocyte growth and selection. During anti-IgM induced B cell apoptosis autoreactive cells are eliminated. Since the molecular mechanisms underlying the process of B cell apoptosis are still not well understood the goal of this study was to identify proteins and genes in apoptosis. Subcloning lead to the selection of a human Burkitt lymphoma B cell line clone (BL60-2) which is highly sensitive towards the anti-IgM stimulus. In order to compare apoptotic and non apoptotic cells a novel method was established, which allows separation of apoptotic, Phosphatidylserine (PS) positive cells from non apoptotic, PS negative cells by magnetic cell sorting. This method generates fractions of apoptotic and non apoptotic cells with a purity of up to 95 %. Cell lysates from those fractions were analyzed using high-resolution two-dimensional gel electrophoresis and the protein patterns were compared. Using mass spectrometry and Edman sequencing the following differentially appearing proteins were identified: Lamin B1, b-Actin, neutral Calponin, Nucleolin, D4-GDI, hnRNP A1, hnRNP C1/C2, hnRNP K, LSP1, HHR23B, FUSE-binding protein, dUTPase, P0, HP1 a. The specific cleavage of the D4-GDI, hnRNPA1 and the transcription factor SP1 which occurs after anti-IgM induced apoptosis was detected by western blot analysis. It was determined by inhibition studies with the tetrapeptide inhibitor z-DEVD-fmk that the cleavage is a result of the Caspase 3 family. Cleavage of the transcription factor SP1 was also investigated by in vitro cleavage assays. The activity of recombinant caspase 3 and 7 generate the same cleavage products as observed in vivo after anti-IgM induction. The specific cleavage of the transcription factor influences it´s DNA binding activity as observed by the decrease of the full lenght protein-DNA complex. The increase of a smaller protein-DNA complex was apparent, which may represent the binding of at least one cleavage product. In this work proteases of the Caspase 3 family could be identified as central regulators during anti-IgM induced apoptosis. Anti-IgM induced apoptosis can be completly inhibited by inhibition of Caspase 3 proteases. Characteristic morphological changes, nuclear fragmentation and PS translocation to the outer membrane leaflet of the cells could be determined as a consequence of the Caspase 3 activation during the process of apoptosis. By differential hybridisation of newly generated l-Zap c-DNA librarys from unstimulated and anti-IgM stimulated B cells as well as with subtractive cDNA librays, it should be feasable to identify newly transcribed genes. Apoptosis specific sequences were enriched, cloned and sequenced.

Die kontinuierliche Rezirkulation von Immunzellen durch periphere und sekundäre lymphatische Organe (SLOs) ist Bestandteil der Immunüberwachung und wichtig für die Aufrechterhaltung und Funktionsbereitschaft des Immunsystems. Der homöostatische Chemokinrezeptor CCR7 vermittelt dabei nicht nur die Rezirkulation von Lymphozyten durch SLOs, sondern scheint auch an der homöostatischen Rezirkulation von Lymphozyten durch nicht-lymphoide periphere Gewebe beteiligt zu sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mithilfe von CCR7-defizienten Mäusen die funktionale Bedeutung von CCR7 für die homöostatische Rezirkulation von Lymphozyten durch das Peritoneum untersucht und nachgewiesen, dass CCR7 der dominante Chemokinrezeptor ist, der unter physiologischen Bedingungen die Transitzeit von Lymphozyten durch das Peritoneum festlegt. Die gestörte Rezirkulation von Lymphozyten begünstigte außerdem die Entstehung von tertiären lymphoiden Organen (TLOs) in der Magenschleimhaut von CCR7-defizienten Mäusen. Untersuchungen zur zellulären und molekularen Grundlage dieser und weiterer pathomorphologischer Veränderungen in der Magenschleimhaut von CCR7-defizienten Mäusen verdeutlichten die Funktion von CCR7 für die Etablierung von zentraler und peripherer Toleranz gegenüber gastrischen Antigenen. Fehlt CCR7, dann entwickelten Mäuse eine spontane Autoimmungastritis, welche durch gastritogene CD4+ T-Zellen verursacht wurde, deren Aktivierung auch unabhängig von Lymphknoten und TLOs erfolgte. Die Entstehung von TLOs wird auch bei einer durch Helicobacter pylori ausgelösten chronischen Gastritis beobachtet. Die Expression des homöostatischen Chemokinrezeptors CXCR5 und seines Liganden CXCL13 ist mit der Entwicklung dieser TLOs korreliert worden. Unter Verwendung eines Mausmodells für H. pylori-induzierte chronische Gastritis konnte gezeigt werden, dass CXCR5 die Ausbildung von TLOs vermittelt und eine Rolle für die Induktion von H. pylori-spezifischen T-Zell- sowie humoralen Immunantworten spielt. / Homeostatic recirculation of immune cells through peripheral and secondary lympoid organs (SLOs) is required for immune surveillance and the maintenance and functionality of the immune system. The homeostatic chemokine receptor CCR7 controls not only lymphoid cell trafficking to and within SLOs, but also seems to be involved in the homeostatic recirculation of lymphocytes through non-lymphoid peripheral tissues. Within the scope of this work we investigated the functional relevance of CCR7 for the homeostatic recirculation of lymphocytes through the peritoneal cavity and could show, that CCR7 is the dominant chemokine receptor which defines the transit time of lymphocytes in the peritoneal cavity under physiological conditions. Impaired recirculation of lymphocytes also promoted the development of tertiary lymphoid organs (TLOs) in the gastric mucosa of CCR7-deficient mice. Analysis of the cellular and molecular mechanisms underlying these and other pathomorphological alterations in the gastric mucosa of CCR7-deficient mice provided further evidence regarding the function of CCR7 for the establishment of central and peripheral tolerance towards gastric antigens. Mice that lack CCR7 spontaneously developed autoimmune gastritis, which was caused by gastritogenic CD4+ T-cells. Such autoreactive T cell responses were also initiated in the absence of lymph nodes and TLOs in CCR7/LT-alpha double-deficient mice. Development of TLOs is also observed during chronic gastritis induced by Helicobacter pylori. The expression of the homeostatic chemokine receptor CXCR5 and its ligand CXCL13 has been correlated with the development of these TLOs. Using a mouse model for H. pylori-induced chronic gastritis, we could show that CXCR5 is responsible for the development of TLOs and also plays a role for the induction of H. pylori-specific T and B cell responses.

Multi-Antigen-Komplexe wurden in der Vakzinologie als effizientes Modell genutzt, um eine breite Impfstoffabdeckung gegen mehrere Stämme desselben Pathogens zu erzielen. Hier werden die Ergebnisse zur menschlichen B-Zell-Reaktion auf einen Multi-Antigen-Komplex (Bexsero) in drei Impfstoffen (Vax1, Vax2 und Vax3) dargestellt. Bexsero ist ein Impfstoff, der aus vier Antigenen (fHbp-GNA2091, NHBA-GNA1030, NadA und OMV (NZ98-254)) für Neisseria meningitidis (Nm) B besteht. Bei allen drei Impfstoffen konnten außerordentlich diverse Immunglobuline (Ig) beobachtet werden, die als Reaktion auf Bexsero mit einzigartigen Ig-Genselektionsmustern erzeugt wurden. Die Daten zeigen auch Igs, die eine Reihe von Spezifitäten aufweisen (Bexsero-spezifisch-reaktive Igs (nur Vax3) oder polyreaktive Igs (Vax2, Vax3 und Vax4)) und Affinitäten (hochbindende, mäßig bindende, schwach bindende und nicht reaktive Igs). Es wurde keine eindeutige Korrelation zwischen spezifischen Ig-Genmerkmalen und Ig-Reaktivitätseigenschaften beobachtet, obwohl Igs von allen Impfstoffen kollektiv unterschiedliche Affinitäten innerhalb/zwischen Cluster-Igs und zwischen Nicht-Clustern von Bexsero aufweisen, was potenzielle Vorteile für einen breiten Schutz mit sich bringt. Ig-Gen-Merkmale und Antigen-Reaktivitätseigenschaften von Igs, die gegen NHBA (22 Igs), fHbp (2 Igs) und NadA (2 Igs) erzeugt wurden, sind ebenfalls gezeigt. Diese Ig zeigten schwache Bindungsaffinitäten, wenn sie an endogen exprimierten Antigenen auf Nm mc58 getestet wurden, möglicherweise aufgrund eines ungeordneten N-Terminus von NHBA. Es wurde eine Anreicherung von hochmutierten polyreaktiven Ig beobachtet. Es werden unterschiedliche Immunoselektivitätsgrade für die verschiedenen Antigene beobachtet, was auf eine Antigenimmunodominanz sowie auf Hinweise auf eine Epitopmaskierung hindeutet. Mit einem kontrollierbaren System von 4 Antigenen eröffnen die Daten die Möglichkeit die menschliche B-Zell-Reaktion auf Multi-Antigen-Komplexe zu verstehen und zeigen, dass ein umfassendes Verständnis über die feinen zellulären und humoralen Einzelheiten der Immunantworten des Impfstoffs während klinischer Studien erforderlich ist. / Multi-antigen complexes have been exploited in vaccinology as an efficient model, to achieve broad vaccine coverage against multiple strains of the same pathogen. Here, the findings on the human B cell response to a multi-antigen complex (Bexsero) in three vaccinees (Vax1, Vax2 and Vax3) are shown. Bexsero is a vaccine comprising of four antigens (fHbp-GNA2091, NHBA-GNA1030, NadA and OMV (NZ98-254)) for Neisseria meningitidis (Nm) B. Immensely diverse (isotype distribution, IgVH and IgJH gene usage, CDR3 length distribution and clonal selection) immunoglobulins (Igs) generated in response to Bexsero with unique Ig gene selection patterns in all three vaccinees was observed. The data also shows Igs that exhibit a range of specificities {Bexsero-specific-reactive Igs (Vax3 Only) or polyreactive Igs (Vax2, Vax3 and Vax4)} and affinities (highly binding, moderately binding, weakly binding and unreactive Igs). No unique correlation between specific Ig gene features and Ig reactivity properties was observed, albeit Igs from all vaccinees collectively exhibit varied affinities within/between cluster Igs, and amongst non-clusters to Bexsero, with potential advantages for broad protection. Ig gene features and antigen-reactivity properties of Igs generated against NHBA (22 Igs), fHbp (2 Igs) and NadA (2 Igs) are also shown. These Igs exhibited weak binding affinities when tested on endogenously expressed antigens on Nm mc58, potentially due to disordered N-terminal of NHBA. Enrichment of highly mutated polyreactive Igs was observed. Varying degrees of immunoselectivity to the different antigens, suggesting antigen immunodominance as well as evidence of epitope masking are observed. With a controllable system of 4 antigens, the data opens a potential window to understanding the human B cell response to multi-antigen complexes and evinces the need for expansive understanding of the fine cellular and humoral details of vaccine immune responses during clinical trials.

Gedächtnis-B-Zellen und Plasmazellen sind essentielle Komponenten der protektiven Immunität. Die Mechanismen ihrer Induktion, ihres Überlebens und der Gedächtnis-B-Zellreaktivierung sind allerding bisher nur unvollständig verstanden. Um unser Wissen diesbezüglich zu erweitern, wurden in der vorliegenden Arbeit zum einen Charakteristika von Primär- und Sekundärimmunantworten nach Immunisierung mit Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) untersucht und zum anderen das Vorkommen sowie der Phänotyp humaner Gedächtnis-B-Zellen in verschiedenen lymphatischen Geweben analysiert. Die primäre parenterale KLH Immunisierung führte auf serologischer und zellulärer Ebene zu einer Reihe unerwarteter Ergebnisse, welche u. a. das Auftreten von IgA Antikörpern und die gleichzeitige Präsenz von hoch- und wenig mutierten primären Plasmablasten beinhalteten. Die Untersuchung der Gedächtnis-B-Zellverteilung in verschiedenen lymphatischen Geweben ergab den größten Gedächtnis-B-Zellpool in der Milz. Blut-, Tonsillen-, Knochenmarks- und Milz-Gedächtnis-B-Zellen wiesen nur wenige phänotypische Unterschiede auf. Einer davon war die CD69 Expression auf tonsillären ruhenden Gedächtnis-B-Zellen, was darauf hindeutet, dass tonsilläre Gedächtnis-B-Zellen tatsächlich sessil sein könnten. Die hier erhaltenen Ergebnisse stellen neue Erkenntnisse über bisher unbeschriebene Mechanismen bei parenteralen Immunantworten wie zum Beispiel die Induktion von IgA Antikörpern sowie die potentielle Rekrutierung kreuzreaktiver Gedächtnis-B-Zellen dar. Es bleibt zu klären, wie die Reaktivierung solcher Gedächtnis-B-Zellen reguliert ist. Derartiges Wissen wäre insbesondere für Therapien von Erkrankungen des Immunsystems, wie Autoimmunität, von Bedeutung. Das potentiell patrouillierende Verhalten der Gedächtnis-B-Zellen ist ein markanter Unterschied zu den nischenabhängigen sessilen Plasmazellen und deutet weitestgehend darauf hin, dass Gedächtnis-B-Zellen nicht auf derartige Nischen angewiesen sind. / Memory B cells (mBC) and antibodies are major mediators of protective immune responses yet the mechanisms of their induction, maintenance and mBC reactivation are poorly understood. Therefore, to enhance knowledge in this regard this study comprehensively characterized a human primary and secondary B cell immune response to Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH). Secondly, mBC maintenance was investigated by a systematic analysis of mBC presence, frequency and phenotype within different lymphoid organs. Parenteral primary KLH immunization yielded unexpected results on the serological and B cellular level, including KLH-specific IgA antibody induction, the simultaneous presence of low and highly mutated circulating KLH-specific primary plasmablasts and only little clonal overlap between the primary, memory and secondary KLH-specific B cell repertoires. With respect to the organ distribution of human mBC, the spleen was identified as a major mBC reservoir. Splenic, tonsillar, bone marrow and blood mBC pools exhibited a largely comparable phenotype. Yet, we found tonsillar mBC to express CD69. Due to their resting state tonsillar mBC could therefore constitute a tissue resident cell population. The observations described allow insights into hitherto unknown potential mechanisms behind primary immune responses, i.e. prominent IgA induction by parenteral challenge and inclusion of cross-reactive mBC. The so far unclear regulatory players involved deserve future investigation, as such knowledge may be crucial for therapeutic interventions in immune system disorders. Furthermore, strikingly different to the resident plasma cells in the bone marrow, mBC appear to distribute between lymphoid organs and continuously recirculate in peripheral blood indicative of their potential permanent screening activities, suggesting that human mBC do not require one dedicated niche for their principle survival.

Plasmazellen gehören zu den Effektorzellen des adaptiven Immunsystems. Langlebige Plasmazellen tragen durch kontinuierliche Sekretion protektiver Antikörper wesentlich zum humoralen Gedächtnis bei und überleben hauptsächlich in spezialisierten Nischen des Knochenmarks. Bislang ist jedoch kein Marker bekannt, mit dessen Hilfe langlebige Plasmazellen eindeutig identifiziert werden können. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der molekularbiologischen, phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von reifen Plasmazellen im gesunden humanen Knochenmark, die sich durch die differentielle Expression von CD19 unterscheiden. Dabei konnte festgestellt werden, dass CD19negative Plasmazellen durch eine vergleichsweise geringere Expression von CD45 und HLADR einen höheren Reifegrad aufweisen als CD19positive Plasmazellen. Zudem lässt die vermehrte Expression von CD28, Mcl1, Bcl2 sowie die schwächere Expression u.a. von CD95 darauf schließen, dass CD19negative Plasmazellen im Knochenmark eine bessere Überlebenskapazität besitzen als CD19positive Plasmazellen. Da beide Plasmazellpopulationen ähnliche Antigen-Spezifitäten aufweisen, Plasmazellen im Knochenmark von Säuglingen ausschließlich CD19 exprimieren und nach sekundärer Vakzinierung im Blut detektierbare Plasmablasten und Plasmazellen ebenfalls CD19 auf ihrer Oberfläche exprimieren, weist die Gesamtheit der Daten darauf hin, dass sich CD19negative Plasmazellen im Kindesalter in situ aus reifen CD19positiven Plasmazellen im Knochenmark entwickeln. Die CD19negative Plasmazellpopulation leistet durch hohe Halbwertszeit und Stabilität einen konstanten Beitrag zur Aufrechterhaltung des humoralen Gedächtnisses. Die CD19positive Plasmazellpopulation stellt hingegen eine flexible Komponente dar, die eine Anpassung der humoralen Immunität und des humoralen Gedächtnisses an aktuelle Herausforderungen auch im Erwachsenenalter ermöglicht. / Plasma cells are effector cells of the adaptive immune system. Humoral memory is sustained by long-lived plasma cells that continuously secrete protective antibodies and mostly reside in specialized niches in the bone marrow. So far, no marker is known that could distinguish long-lived plasma cells from short-lived ones. The present work addresses the biomolecular, phenotypical and functional characterization of mature plasma cells in healthy human bone marrow that differ in their expression of the surface marker CD19. CD19negative plasma cells showed higher maturity than CD19positive plasma cells as they expressed lesser amounts of CD45 and HLADR. Moreover, higher expression of CD28, Mcl1 and Bcl2 and lesser expression of CD95 argues for a better survival capacity of CD19negative plasma cells. Both plasma cell populations showed similar antigen specificities. All plasmablasts and plasma cells detectable in blood after secondary vaccination expressed CD19, as well as all plasma cells isolated from infant bone marrow. These results indicate that CD19negative plasma cells mainly develop during childhood by further differentiation of mature CD19positive plasma cells in situ in the bone marrow. CD19negative plasma cells represent a long-lived and stable component of the adaptive immune system and humoral memory, whereas the CD19positive plasma cell population displays a flexible element allowing for adaption of humoral immunity to new challenges throughout a lifetime.