Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-03T12:48:10Z No. of bitstreams: 1 2015_EduardoFerreiraPereira.pdf: 3187364 bytes, checksum: 50b7a71b45f3b71d8af9c22fc9653768 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-05-26T17:53:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_EduardoFerreiraPereira.pdf: 3187364 bytes, checksum: 50b7a71b45f3b71d8af9c22fc9653768 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-26T17:53:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_EduardoFerreiraPereira.pdf: 3187364 bytes, checksum: 50b7a71b45f3b71d8af9c22fc9653768 (MD5) / O Brometo de Etídio (BE) é um composto fluorescente que tem seu rendimento quântico muito aumentado quando intercalado à moléculas de DNA e RNA e, por isto, é usado para detecção destas espécies em procedimentos de eletroferese em gel. Devido a estas características, esta substância é considerada perigosa, pois pode causar danos ao material genético humano sendo classificado como um agente mutagênico /tóxico. Para realização do seu descarte é necessário um processo de inertização, sendo um dos mais aplicados o proposto por Lunn e Sansone em que são utilizados o ácido hipofosfórico e o nitríto de sódio para oxidação da substância. Porém, esta é uma reação de longa duração e a sua finalização deve ser atestada com o uso da detecção por fluorescência. Considerando este aspecto, o principal objetivo do trabalho foi construir e avaliar um sistema automatizado de baixo custo com detecção fluorimétrica, empregando-se um LED (máximo de emissão em 535 nm) para monitorar a degradação do BE. Este instrumento é controlado por microcontroladores (PIC 16F877A e PIC 16F628) que são responsáveis pelos controles dos processos de fluxo das amostras e do fluido carreador e por adquirir e processar o sinal do sistema de detecção, composto de dois fotodiodos e como filtros para, emissão do BE, foram utilizados plásticos de coloração alaranjada. O Fluorímetro proposto foi avaliado tanto em batelada quanto em um sistema de fluxo e apresentou limites de detecção de 0,33 mg L-1 no sistema de fluxo com abordagem stoped-flow e 0,04 mg L-1 em batelada (utilizando cubeta). As medidas realizadas com o instrumento foram comparadas ao de um fluorímetro comercial de bancada e em todas as comparações não foram observadas diferenças significativas ao nível de 95% de confiança. Foram realizados testes para verificar se o sistema de decisão do instrumento proposto era confiável para indicar automaticamente o final da degradação sendo observada uma taxa de 100% de acerto para as amostras testadas com concentrações acima do limite máximo permitido e abaixo deste limite (5 mg L-1). Alternativamente, avaliou-se a possibilidade de uso de um sistema de detecção de BE utilizando um LED como fonte de excitação e medidas das componentes RGB de imagens a partir de um aplicativo e da câmera de um aparelho celular. Para esta abordagem foi encontrado um limite de detecção de 0,91 mg L-1 utilizando apenas componente R. Comparando-se os resultados obtidos para amostras fortificadas com BE realizadas com o fluorímetro proposto e com a detecção via celular com os resultados obtidos com um espectrofluorímetro comercial, não foram observadas diferenças significativas ao nível de 95 % de confiança. O Fluorímetro de LED proposto se mostrou eficiente e teve um rendimento satisfatório a um baixo custo (cerca de US$ 200) podendo ser aplicado para a detecção de BE no procedimento de descarte ou na detecção destes em amostras residuais. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Ethidium Bromide (BE) is a fluorescent compound which has a significant enhancement of quantum yield when intercalated with RNA and DNA molecules and, due to such effect, it is applied for detection of these species in gel electrophoresis. For that reason, BE is considered dangerous, producing damages to human genetic material and classified as a mutagenic/toxic agent. In order to discard BE residues, is necessary a prior process to turn the substance inert and one of the most applied protocols is the proposed by Lunn and Sansone, where hipofosforic acid and sodium nitrite are used to oxidize the BE. However, this reaction requires a long time period and its finalization must be attested by fluorescence measurements. Considering this, the main objective of this work was to fabricate and evaluate a low cost automated system with fluorometric detection, using a LED (maximum emission in 535 nm) to to monitor BE degradation. The proposed instrument is controlled by microcontrollers (PIC 16F877A and PIC 16F628) that controls the sample and carrier flows and performs the acquisition and processing of the analytical signal from the detector, comprising two photodiodes covered by two pieces of transparent orange plastic. The proposed fluorometer was tested with the use of batch or flow based strategies. Using a stopped-flow system, the limit of detection of 0.33 mg L-1 was achieved and for the batch determination the detection limit was 0.04 mg L-1. The determinations performed with the proposed LED fluorometer were compared to the determinations performed with a commercial spectrofluorometer with no significant differences at 95 % confidence level. Tests were also conducted to verify if the decision system of the proposed instrument was reliable to automatically indicate the end of degradation, being checked 100 % of accuracy for the tested samples with BE concentrations beyond and below the limit of concentration of 5 mg L-1. Alternatively, the detection of BE using a green LED as excitation source and measurements of RGB pattern from photographic images acquired by a cell phone was evaluated. For this approach, the detection limit of 0.91 mg L-1 was stimated using only the Red component of RGB. By comparing the results acquired with the proposed fluorometer/cell phone detection with the data obtained with a commercial spectrofluorometer for BE fortified samples, no significant differences were observed at the 95 % confidence level. The proposed LED Fluorometer was efficient and had a satisfactory performance at a low cost (US$ 200) and can be applied to the detection of BE in the disposal procedure or detecting in residual samples.

Orientador: José Anchieta Gomes Neto / Banca: Marisa Spirandeli Crespi / Banca: Jorge Luiz Raposo Júnior / Resumo: Foi desenvolvido um equipamento de baixo custo, portátil e multifuncional que integra num único dispositivo quatro técnicas analíticas: fotometria, turbidimetria, nefelometria e fluorimetria. Os principais componentes do equipamento proposto são: diodo emissor de luz (LED) como fontes de radiação; resistor dependente de luz (LDR) como fotodetector; multímetro digital como dispositivo de leitura; um bloco cilíndrico de Nylon preto. Para avaliar o desempenho do equipamento, fez-se a determinação de fósforo (fotometria) e de enxofre (turbidimetria) em fertilizante, de enxofre em material vegetal (nefelometria) e de quinina em água tônica (fluorimetria). As determinações também foram feitas em um equipamento comercial para fins comparativos. Para a determinação de fósforo pelo método do fosfovanadomolibdato, a faixa de trabalho foi de 0,07 a 6,52 mg L-1 (r= 0,9944) e o limite de detecção foi de 0,06 mg L-1. Para a determinação turbidimétrica de sulfato pelo método da precipitação de sulfato de bário, a calibração foi de 2,5 a 100 mg L-1 (r= 0,9982), sendo o limite de detecção 0,23 mg L-1. Na determinação nefelométrica de sulfato, a faixa linear foi de 0,2 a 1,8 mg L-1 (r= 0,9948) e o limite de detecção de 0,10 mg L-1. Na determinação fluorimétrica de quinina, a faixa linear foi de 0,16 a 8,0 mg L-1 (r= 0,9982) e limite de detecção de 0,011 mg L-1. Os resultados obtidos foram comparados com aqueles fornecidos por equipamentos comerciais e resultados concordantes foram observados ao nível de 95% de confiança. Materiais de referência foram analisados pelo equipamento proposto e os resultados para fósforo e enxofre foram concordantes com os respectivos valores certificados ao nível de 95% de confiança. Além do potencial analítico, o equipamento proposto apresenta utilidade como ferramenta didática. O aprendizado do conteúdo de métodos ópticos de análise pode ser estimulado quando há melhor... / Abstract: A new portable, low cost and multifunctional equipment comprising four analytical techniques (photometry, turbidimetry, nephelometry and fluorimetry) in one single device was developed The main components of the developed device are light emitting diode (LED) as radiation source, light-dependent resistor (LDR) as photodetector, digital multimeter as reading device, and a black plastic container. The performance of the device was checked by determining phosphorus in fertilizer (photometry), sulfur in fertilizer (turbidimetry), sulfur in vegetable samples (nephelometry) and quinine in tonic water (fluorimetry). All determinations were also made in commercial equipments for comparison purposes. The phosphovanadomolibdate method was employed for phosphorus determination within the 0.07 - 6.52 mg L-1 concentration range ((r= 0.9944), and the detection limit was 0.06 mg L-1. The precipitation of barium sulfate was employed for turbidimetric and nephelometric determination of sulfate. For the turbidimetric technique, the calibration range was in the 2.5 - 100 mg L-1 (r= 0.9982), and the detection limit was 0.23 mg L-1. For nephelometry, calibration within 0.2 - 1.8 mg L-1 (r= 0.9948) resulted in detection limit of 0.10 mg L-1. The fluorimetric determination of quinine in the 0.16 - 8.0 mg L-1 linear working range (r= 0.9982) resulted in 0.011 mg L-1 detection limit. Results found by the proposed device were in agreement with those obtained by commercial equipments at 95% confidence level. Standard reference materials were also analyzed, and results for P and S were in agreement with certified values. Besides analytical capabilities, the proposed device may be useful for teaching. The learning goals of some optical techniques may be easier using easy-to-make instruments. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-17Bitstream added on 2014-12-02T11:21:04Z : No. of bitstreams: 1 000775320.pdf: 1787970 bytes, checksum: f55fdff75708b286b90a8cbdd7ba34d9 (MD5) / Foi desenvolvido um equipamento de baixo custo, portátil e multifuncional que integra num único dispositivo quatro técnicas analíticas: fotometria, turbidimetria, nefelometria e fluorimetria. Os principais componentes do equipamento proposto são: diodo emissor de luz (LED) como fontes de radiação; resistor dependente de luz (LDR) como fotodetector; multímetro digital como dispositivo de leitura; um bloco cilíndrico de Nylon preto. Para avaliar o desempenho do equipamento, fez-se a determinação de fósforo (fotometria) e de enxofre (turbidimetria) em fertilizante, de enxofre em material vegetal (nefelometria) e de quinina em água tônica (fluorimetria). As determinações também foram feitas em um equipamento comercial para fins comparativos. Para a determinação de fósforo pelo método do fosfovanadomolibdato, a faixa de trabalho foi de 0,07 a 6,52 mg L-1 (r= 0,9944) e o limite de detecção foi de 0,06 mg L-1. Para a determinação turbidimétrica de sulfato pelo método da precipitação de sulfato de bário, a calibração foi de 2,5 a 100 mg L-1 (r= 0,9982), sendo o limite de detecção 0,23 mg L-1. Na determinação nefelométrica de sulfato, a faixa linear foi de 0,2 a 1,8 mg L-1 (r= 0,9948) e o limite de detecção de 0,10 mg L-1. Na determinação fluorimétrica de quinina, a faixa linear foi de 0,16 a 8,0 mg L-1 (r= 0,9982) e limite de detecção de 0,011 mg L-1. Os resultados obtidos foram comparados com aqueles fornecidos por equipamentos comerciais e resultados concordantes foram observados ao nível de 95% de confiança. Materiais de referência foram analisados pelo equipamento proposto e os resultados para fósforo e enxofre foram concordantes com os respectivos valores certificados ao nível de 95% de confiança. Além do potencial analítico, o equipamento proposto apresenta utilidade como ferramenta didática. O aprendizado do conteúdo de métodos ópticos de análise pode ser estimulado quando há melhor... / A new portable, low cost and multifunctional equipment comprising four analytical techniques (photometry, turbidimetry, nephelometry and fluorimetry) in one single device was developed The main components of the developed device are light emitting diode (LED) as radiation source, light-dependent resistor (LDR) as photodetector, digital multimeter as reading device, and a black plastic container. The performance of the device was checked by determining phosphorus in fertilizer (photometry), sulfur in fertilizer (turbidimetry), sulfur in vegetable samples (nephelometry) and quinine in tonic water (fluorimetry). All determinations were also made in commercial equipments for comparison purposes. The phosphovanadomolibdate method was employed for phosphorus determination within the 0.07 – 6.52 mg L-1 concentration range ((r= 0.9944), and the detection limit was 0.06 mg L-1. The precipitation of barium sulfate was employed for turbidimetric and nephelometric determination of sulfate. For the turbidimetric technique, the calibration range was in the 2.5 - 100 mg L-1 (r= 0.9982), and the detection limit was 0.23 mg L-1. For nephelometry, calibration within 0.2 – 1.8 mg L-1 (r= 0.9948) resulted in detection limit of 0.10 mg L-1. The fluorimetric determination of quinine in the 0.16 – 8.0 mg L-1 linear working range (r= 0.9982) resulted in 0.011 mg L-1 detection limit. Results found by the proposed device were in agreement with those obtained by commercial equipments at 95% confidence level. Standard reference materials were also analyzed, and results for P and S were in agreement with certified values. Besides analytical capabilities, the proposed device may be useful for teaching. The learning goals of some optical techniques may be easier using easy-to-make instruments.

En aquest treball s'exposen dues línies de recerca centrades en el procés de producció d'una lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) en Pichia pastoris: la utilització de diferents tècniques de monitoratge i l'aplicació d'estratègies de cultiu que permetin millorar la producció de la ROL en una soca Mut+ d'aquest sistema d'expressió. En els cultius discontinus alimentats amb P. pastoris cal disposar d'una mesura en línia i en temps real de la concentració de substrat, el metanol. Per això es va desenvolupar un analitzador d'injecció seqüencial. Es va comprovar que aquest té una freqüència d'anàlisi òptima per a cultius amb la soca Muts però baixa per a la soca Mut+. Amb aquesta última soca, es van utilitzar i comparar dos mesuradors comercials en fase gas. Es va avaluar també la fluorimetria com a tècnica de monitoratge per a la determinació de tres variables clau: la biomassa, el substrat (glicerol/metanol) i la proteïna recombinant.Inicialment es va fer un seguiment de l'evolució de la biomassa a partir del senyal de fluorescència off-line del triptòfan. Es pot predir la biomassa correctament però es van evidenciar diferents desavantatges: la necessitat de dilució de les mostres i d'un sistema de presa de mostra específic. Per això es va decidir aplicar i avaluar la fluorimetria multivariable in situ. Amb la utilització d'una sonda fluorimètrica in situ, combinada amb mètodes quimiomètrics de tractament de dades multivariables, es va aconseguir predir la biomassa i el substrat a partir de la determinació del senyal de diversos fluoròfors. No es va aconseguir una bona predicció de la producció de ROL. Per millorar el seguiment de la proteïna, es va fusionar a la GFP. Es van detectar dos inconvenients: els nivells de producció disminuïen respecte a la producció de ROL únicament i la riboflavina, que Pichia excreta al medi, interferia amb el senyal de fluorescència del mutant de GFP escollit. Tant amb la filtració de la mostra abans de la determinació del senyal de GFP com si s'hagués escollit un mutant de GFP amb emissió més allunyada de la riboflavina es podria haver evitat aquest inconvenient i fer un seguiment de la ROL excretada. Es pot seguir la ROL intracel·lular.Quant a la producció de la ROL, es va estudiar l'efecte del nivell de metanol residual en cultius discontinus alimentats amb la soca Mut+. Existeix una concentració òptima entorn els 2.5 g·l-1 de metanol al medi. A concentracions superiors es va apreciar inhibició per substrat. Es va observar un fenomen de limitació per transferència d'oxigen al final del cultiu i una important disminució de la viabilitat cel·lular.Per això, es van avaluar estratègies de cultiu alternatives. Primer es va aplicar una estratègia de metanol limitant (MLFB) per evitar la limitació d'oxigen al final d'un cultiu a 2.5 g·l-1 de metanol residual (MNLFB). Es va millorar la productivitat un 40%. En segon lloc, es va aplicar una estratègia de temperatura limitant per avaluar el seu efecte sobre la producció. No es van millorar els resultats. Finalment, es va aplicar una estratègia MNLFB a 2.5 g·l-1 de metanol però amb un medi amb una menor osmolaritat i una fase final amb limitació de temperatura per evitar la limitació d'oxigen. Es va aconseguir reduir la mortalitat cel·lular però la productivitat disminuïa respecte el cultiu on s'aplica una fase de MLFB al final de la inducció. Tot i això, es va obtenir un producte final un 30% més pur en quant a activitat lipolítica respecte la proteïna total. Posteriorment es va procedir a escalar la producció en planta pilot. Es va observar limitació en la transferència d'oxigen en fases inicials de la inducció. Això va originar l'aparició d'un subproducte, associat a una reducció en la producció de ROL extracel·lular. En millorar la transferència d'oxigen es va minimitzar aquesta limitació i va millorar la producció. No es van aconseguir els mateixos nivells de productivitat que a escala laboratori però es continua treballant en la millora de la transferència de matèria per assolir-los. / In this work two research lines, applied to the production of a Rhizopus oryzae lipase (ROL) in Pichia pastoris, are shown: the application of different monitoring and cultivation techniques to improve ROL production in a P. pastoris Mut+ strain.During P. pastoris fed-batch cultures, methanol needs to be on line measured and monitored in real time. For this purpose, a sequential injection analyzer was developed. Although it presented a suitable analysis frequency for a Muts strain it was too low for a Mut+ strain. When the later was used, two different methanol commercial sensors in the outlet gas steams were utilized and compared. Fluorometry was also evaluated as a monitoring technique for three key variables: biomass, substrate (glycerol/methanol) and recombinant protein. Initially, biomass was followed by the off-line determination of tryptophan's fluorescence. Biomass was correctly predicted with this system but different disadvantages appeared: the need of a sample dilution procedure and a specific sampling device. Therefore, multivariable in situ fluorometry was subsequently evaluated. By means of an in situ multivariable fluorimetric probe, combined with chemometric methods to data processing, biomass and substrate prediction was properly achieved. ROL production could not be satisfactorily estimated.To improve ROL monitoring, it was fusioned to the green fluorescent protein (GFP). Two main disadvantages were found: production levels were lower when compared to solely ROL expression and riboflavin, naturally excreted by the yeast, interfered to GFP's signal. This problem could be solved with sample filtration prior to GFP's measurement and also if a different GFP mutant had been chosen with emission signal further to riboflavin's.With respect to ROL production, the effect of methanol concentration was studied in Mut+ fed-batch cultures. There is an optimal methanol concentration about 2.5 g·l-1. Substrate inhibition was observed at higher methanol levels. Oxygen transfer limitation at the end of the induction phase and an important cell viability decrease were also found. Therefore, alternative culture techniques were evaluated. First a methanol limited fed-batch phase (MLFB) was applied when oxygen limitations appeared at the end of a 2.5 g·l-1 methanol fed-batch phase (MNLFB). Productivity increased up to 40% with this strategy. Secondly, a temperature limited fed-batch was applied. No better results were obtained compared to the reference MNLFB culture. Finally, a 2.5 g·l-1 methanol fed-batch was applied with a lower salt content medium and a final temperature limited phase when oxygen limitation appeared. Cell death was reduced but productivity decreased with respect to the reference MNLFB culture. However, a 30% purer lipase was obtained in terms of lipase activity to total protein.Thereafter, the scaling of the production process in a pilot plant was evaluated. Oxygen limitation was found in the early induction phase. This caused a byproduct secretion associated to a ROL production decrease. When oxygen transfer was enhanced, byproduct secretion was reduced and ROL production improved. Similar laboratory scale productivities were not achieved but oxygen mass transfer is being further enhanced to reach the objective levels.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química / Made available in DSpace on 2012-10-22T19:16:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 233926.pdf: 2391303 bytes, checksum: 6f228aab91d9ad1d4906ec949bb6bdc1 (MD5) / O intenso uso dos metais pesados aliados as suas toxicidades, fazem com que novos métodos de análise sejam importantes. No presente trabalho estuda-se um método para determinação de Zn2+ e Cd2+ com diferentes surfactantes (CTABr, SDS, TRITON X-100, Lauril e Palmitil sulfobetaína) por espectrofluorimetria. O método proposto emprega a sonda fluorescente 8-hidroxiquinolina (8-HQ). O realce da fluorescência da 8-HQ pelos íons metálicos Zn2+ e Cd2+, mostra que é possível analisar metais em soluções de composição conhecida. Com base nos resultados verificou-se que a técnica de espectroscopia de fluorescência em meio micelar mostra-se eficiente e de fácil aplicabilidade. A utilização do meio micelar é importante, pois permite a solubilização do complexo formado entre 8-HQ com Zn2+ e Cd2+, o qual logo precipita na ausência de surfactante. Nas condições experimentais de análise ([8-HQ] = 2,0 x 10-4 mol.L-1 e [Me2+] na faixa de 0 até 6,0 x 10-5 mol.L-1), os resultados indicam que o surfactante CTABr é o que atua de forma mais favorável na solubilização do complexo, tanto no caso do Zn2+ quanto Cd2+, e nenhuma precipitação foi observada até 24 horas depois. Os resultados dos testes de viscosidade mostram que adição de Zn2+ afeta a viscosidade macroscópica das soluções de CTABr, fato que pode estar relacionado com a estabilidade do complexo em solução. No caso do CTABr pode-se calcular que o LD é equivalente a 2,39 nano moles de Zn2+ e no caso do Cd2+ 2,74 nano moles. Em ambos casos, em sistemas cromatográficos onde as amostras são injetadas em micro litros, e/ou pré-tratadas em coluna de pré-concentração, o método pode atingir pico moles de metais.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8492_1.pdf: 1402042 bytes, checksum: b8f221ce546d7c25fd4f01c95011a7de (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Phthirusa pyrifolia é uma planta hemiparasita conhecida como Erva-depassarinho e muito utilizada na medicina popular. Visando conhecer melhor as substâncias contidas nas folhas desta planta, o presente trabalho teve como objetivos, a Purificação e Caracterização parcial de uma lectina, bem como Aplicações Biomédicas envolvendo esta proteína. As folhas da planta foram coletadas no campus da Universidade Federal de Pernambuco, lavadas, secas, trituradas e o Extrato Bruto (EB) a 10% (p/v) em solução de 0,15M NaCl foi obtido por agitação a 4ºC durante 4h, seguido de filtração e centrifugação. No período de dois anos, novos extratos foram obtidos para avaliação do ciclo sazonal na Atividade Hemaglutinante Específica (AHE) da lectina. Este ensaio evidenciou que o EB obtido no mês de março apresentou maior AHE, sendo submetido, então, à precipitação salina com sulfato de amônio. Do fracionamento salino resultou a F20-40%, com maior AHE. Inicialmente, uma alíquota da F20-40% foi cromatografada por afinidade em Sephadex G-100 utilizando 0,3M glicose como eluente. Em seguida os picos que apresentaram Atividade Hemaglutinante (AH) foram reunidos, dialisados, liofilizados e aplicados em cromatografia de troca iônica de CMcellulose. A amostra adsorvida na coluna foi eluída com solução 0,5M Tris-HCl, pH 8,5. O pico que apresentou AH foi dialisado, liofilizado, submetido à SDS-PAGE e a banda de protéica visualizada foi denominada PpyLL. O gel eletroforético na ausência do agente redutor mostrou a lectina com uma banda de 15,6 kDa e em presença de agente redutor, duas bandas com massas moleculares de 15,6 kDa e 7,8 kDa. PpyLL é uma glicoproteína ácida com pH ótimo 7,5, termoestável até 70ºC, apresenta afinidade por eritrócitos humanos tipo O+ e não foi inibida por açúcares simples, mas por frutose- 1,6-bifosfato e pelas glicoproteínas caseína, azocaseína e albumina de soro bovino. A Fluorimetria mostrou que a 70ºC, a lectina apresentou uma alta intensidade de fluorescência do aminoácido Triptófano, alterando assim a sua conformação. No Teste de Avaliação da atividade antimicrobiana, a PpyLL mostrou atividade contra as bactérias Staplylococcus epidermidis, Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis e Klebsiella pneumoniaee, e contra os fungos Fusarium lateritium e Rhizoctonia solani. A nova lectina obtida através de um protocolo de purificação envolvendo cromatografias de afinidade e troca iônica apresenta características de grande relevância, as quais permitem a sua aplicação em processos biotecnológicos

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-07T13:30:22Z No. of bitstreams: 1 Tese_MarceleNevesRocha.pdf: 3850783 bytes, checksum: e18bb3542328e15691057c221725ec86 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-07T13:30:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_MarceleNevesRocha.pdf: 3850783 bytes, checksum: e18bb3542328e15691057c221725ec86 (MD5) Previous issue date: 2013 / As Leishmanioses são doenças negligenciadas. O tratamento dos pacientes é a principal medida de controle, porém a quimioterapia das Leishmanioses apresenta dificuldades incluindo: toxicidade dos medicamentos disponíveis, via de administração parenteral e resistência natural de algumas cepas. O método de teste de drogas clássico in vitro baseado na contagem microscópica de macrófagos infectados apresenta limitações por ser laborioso, não automatizado e sujeito a variações do observador. Deste modo, a busca por novos métodos de triagem de drogas faz-se necessário. O estabelecimento de métodos semi-automatizados contribuiria para aumentar a eficiência da busca de novas drogas contra Leishmania. Neste trabalho, a cepa de Leishmania amazonensis (PH8) foi transfectada com a proteína vermelha fluorescente (RFP). Os parasitos transfectados foram avaliados segundo parâmetros celulares e de susceptibilidade aos fármacos leishmanicidas tradicionais e derivados do propranolol. Os parasitos selvagens (WT) e transfectados (RFP) foram analisados pela Citometria de Fluxo e Microscopia de Fluorescência sendo facilmente discriminados por estas técnicas. Em geral, não foram observadas diferenças na susceptibilidade entre as cepas WT e RFP frente às moléculas testadas. Os parasitos RFPs foram submetidos ao teste de drogas com posterior leitura no fluorímetro para a padronização do método fluorimétrico. O método fluorimétrico se mostrou bastante reprodutível em relação ao método clássico. Entretanto, durante a padronização do método, mudanças na concentração das drogas foram necessárias bem como a determinação de um ponto de corte nos valores de IC50. Este trabalho também avaliou a atividade leishmanicida dos derivados das poliaminas e complexos metálicos de lapachol utilizando-se o método clássico. Não só os derivados do propranolol, mas também os das poliaminas e lapachol se mostraram tóxicos paracélulas de Hepatoma humano (HepG2). Este trabalho possibilitou pela primeira vez a utilização de parasitos RFPs como modelo de um teste de drogas semi-automatizado. / The leishmaniasis are neglected diseases. Patient treatment is the main control measure, however leishmanisasis chemotherapy faces several problems including: drug toxicity, the administration rout and natural drug resistance. Also, the classical in vitro drug testing method, which is based on microscopically counting the number of infected macrophages is rather limited, laborious cannot be automated and is subjected to variations due to observer. For this reason, the search for new methods and establishment of semi-automated methos id necessary to improve the efficiency of new drugs discovery. In this present work, Leishmania amazonensis strain PH8 was transfected with the red fluorescent protein (RFP). Transfected parasites were evaluated for their cellular parameters and susceptibility against traditional drugs and novel propranolol derivates. Wild type (WT) and transfected (RFP) parasites were analyzed by flow citometry and fluorescent microscopy. Overall we did not observe any difference in drug susceptibility between WT and RFP parasites. RFP parasite were then submitted drug susceptibility test and analyzed by fluorimeter. The fluorimetric method showed a comparable reproducibility to the standard method. However, during experimentation, some adjustments on drug concentrations were necessary to determine IC50 threshold values. Additionally, in this work, weevaluated the activity of polyamine derivates and (metalic lapachol complexes) against leishmania by the classical method. Propranolol derivates, polymaine and metalic lapachol complexes were shown to be citotoxic as shown by HepG2 cell cultures. This work was the first to show the use of RFP parasites as a model for drug screening in a semi-automated method.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-29Bitstream added on 2014-06-13T19:07:53Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_ms_me_prud.pdf: 1897420 bytes, checksum: 1aede604709494154b2f75d18806c9fc (MD5) / O conhecimento da distribuição espacial da concentração de componentes da água é de fundamental importância para inferir a respeito dos processos ecológicos que ocorrem num sistema hídrico sendo, entretanto, de difícil obtenção. Dentre as variáveis que merecem atenção no monitoramento de ambientes aquáticos, destaca-se a clorofila a, a qual é uma substância presente em algas responsáveis pela fotossíntese, organismos que constituem a base da cadeia alimentar nesses ambientes. Por se tratar de um pigmento fotossintetizante, a clorofila a apresenta a propriedade de interagir com a radiação eletromagnética, e dessa interação resultam diferentes processos, identificáveis por meio de sensores remotos. Assim sendo, a presente pesquisa se propôs a desenvolver um método de inferência da concentração de clorofila a utilizando Redes Neurais Artificiais (RNA). Utilizou-se como dados de entrada para a inferência combinações de bandas espectrais de uma imagem World View-2 e valores de concentração de clorofila a obtidos com um fluorômetro de campo, o qual possibilitou uma amostragem densa na área de estudos. A imagem multiespectral foi corrigida radiometricamente, eliminando efeitos de instrumentação e atmosféricos. Ainda, efetuou-se uma suavização espectral em cada uma das bandas e foi avaliado se esse tratamento na imagem possibilitaria... / The knowledge of the spatial distribution of water components concentrations is of fundamental importance to infer about the ecological processes that occur in an aquatic system, however, is difficult to obtain it. Among the variables that deserve attention in the monitoring of aquatic environments, cite the chlorophyll a, which is a substance of photosynthetic algae, organisms that are the basis of the food chain in these environments. Because it is a photosynthetic pigment, chlorophyll a has the property to interact with electromagnetic radiation, and it results in different processes, identifiable through remote sensing. Thus, this research intended to develop a chlorophyll a concentration inference method using Artificial Neural Networks (ANN). As input for the inference, it was used combinations of World View-2 spectral bands and chlorophyll a concentration values obtained with a field fluorometer, which allowed a dense sampling in the study area. The multispectral imagery was radiometrically corrected, eliminating the instrumentation and atmospheric effects. Still, it was performed a spectral smoothing in each of the spectral bands and evaluated whether this treatment would give... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Eduardo Barros de Almeida Silva (eduardo.philippe@ufpe.br) on 2015-04-17T12:11:54Z No. of bitstreams: 2 Tese Dewson Pereira.pdf: 2434638 bytes, checksum: 7654476b56a86b806d79d80bc97a8fbd (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T12:11:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Dewson Pereira.pdf: 2434638 bytes, checksum: 7654476b56a86b806d79d80bc97a8fbd (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-04-29 / Lectinas são proteínas de origem não imune que se ligam de forma reversível e não covalente a carboidratos e glicoconjugados. A espécie Indigofera suffruticosa Mill., encontrada na região do Semi-Árido Pernambucano, é utilizada popularmente como antiespasmódico, sedativo, diurético e purgativo. O objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar e avaliar o potencial biológico de uma proteína de I. suffruticosa. Uma proteína de folhas de I. suffruticosa foi obtida por cromatografia de afinidade em coluna de quitina e demonstrou ser uma glicoproteína ácida com massa molecular de 35 kDa e 3,6 % de carboidratos neutros. Esta proteína apresentou maior atividade hemaglutinante específica para eritrócitos humanos do tipo A e foi inibida por glicoproteínas e monossacarídeos, demonstrando ser uma lectina que foi denominada IsuLL. Sua atividade hemaglutinante foi estável na faixa de pH entre 6,5 a 7,0, termoresistente e não foi alterada por cations divalentes. A espectroscopia de infravermelho revelou que IsuLL possui um maior percentual de estruturas do tipo folhas . Espectroscopia de fluorescência intrínseca e extrínseca da estrutura molecular de IsuLL demonstrou a presença de resíduos triptófano e tirosina expostos na superfície da molécula e regiões hidrofóbicas parcialmente internalizadas. A estrutura de IsuLL revelou alta estabilidade térmica (T=200 ºC), avaliada pela curva de Termogravimetria. Esta lectina demonstrou atividade antioxidante (52 %) pela redução do radical DPPH . IsuLL foi tóxica para larvas de Artemia salina com CL50 de 207.87±2 μg/mL, indicando toxicidade ambiental moderada e não reduziu, significativamente, a proliferação celular das linhagens humanas de nasofaringe (HeLa) e leucêmicas (KG1). IsuLL inibiu o crescimento de Candida albicans (MIC=64 μg mL-1), C. tropicalis (MIC=16 μg.ml-1) e C. krusei (MIC=8 μg mL-1) e Staphylococcus aureus (MIC=15 μg mL-1). O estudo do efeito de IsuLL sobre S. aureus revelou modificação na parede celular, utilizando técnicas de Microscopia Eletrônica de Transmissão, captação do cristal violeta e liberação de material genético. A associação de IsuLL com antibióticos (ampicilina e cifoxitina) foi sinérgica contra S. aureus. Os resultados indicam que IsuLL, isolada de folhas de I. suffruticosa, é uma nova lectina de estrutura estável com atividade antimicrobiana e antioxidante, de potencial aplicação biotecnológica.

O rio Paraíba do Sul, após formar o reservatório do Funil, abastece cidades ribeirinhas e a cidade do Rio de Janeiro. A INB, uma empresa da área nuclear, está localizada na margem norte deste reservatório. Neste trabalho, Ag, Al, As, Ba, Cd, Co, Cr, Fe, Mn, Ni e Pb foram determinados por ICP OES em água e sedimentos em pontos a montante e a jusante do Funil e neste. Urânio, usando fluorimetria, também foi determinado em amostras coletadas a montante e a jusante do ponto de descarga de efluentes da INB, no ribeirão da Água Branca. O estudo não mostrou evidências que a INB está provocando impacto ambiental nesse ribeirão. As, Ni e Pb em todos os pontos de amostragem e Al, Cr e Fe na maioria desses pontos apresentaram concentrações em água acima do máximo permitido pela CONAMA 357. A maioria dos elementos apresentou concentrações nas amostras de água a montante do reservatório do Funil superiores às verficadas a jusante, para ambas as estações chuvosa e seca. Os sedimentos estão impactados por As, Cd, Cr e Pb em quase todos os pontos estudados. / The Paraiba do Sul River after forming the Funil Reservoir serves as the major source of potable water for downstream cities and for the city of Rio de Janeiro. INB, a company of the nuclear area, is located in the north margin of this reservoir. In the present study, Ag, Al, As, Ba, Cd, Co, Cr, Fe, Mn, Ni and Pb were determined by ICP OES in water and sediments samples at points upstream and downstream from Funil and in this one. Uranium, using fluorimetry, was also determined in samples collected upstream and downstream from the INB effluent discharge point at the Água Branca Creek. The study did not show evidences that INB is provoking environmental impact in this creek. As, Ni and Pb in all the sampling points and Al, C and Fe in most of those points exceeded the CONAMA 357 standards for water. Most of the elements presented concentration in the water samples at the points upstream from Funil reservoir higher than those downstream, for both rainy and dry seasons. Sediments are impacted by As, Cd, Cr and Pb in almost all the studied points.