L'analyse de la réponse lymphocytaire T représente une exploration de plus en plus importante pour la compréhension de la physiopathologie de maladies et le suivi de protocoles d'immunothérapie. La mise en évidence de la production de cytokines par ces cellules permet d'identifier les sous populations de lymphocytes T (LT) et d'analyser leur fonctionnalité et leur état d'activation. L'Elispot est une technique déjà largement utilisée dans le suivi de la réponse vaccinale pour la détection de cellules sécrétrices de cytokines. Bien que la séroprotection soit le critère reconnu pour déterminer l'efficacité de la vaccination antigrippale, un rôle important de la réponse lymphocytaire T a été démontré dans le contrôle de l'infection. Nos travaux ont permis de mettre en évidence que l'utilisation de vaccins totaux pour le suivi de la réponse lymphocytaire T, par l'introduction de leurs excipients, peut induire un biais dans la détection des cytokines. Le thimérosal, conservateur utilisé dans certains vaccins, provoque in vitro lors de la détection d'interféron (IFN) par Elispot l'apparition de petits spots que nous avons associés a l'activation abortive précoce des LT. Leur taille permet cependant d'éliminer automatiquement du comptage ces spots non spécifiques. Contrairement à l'Elispot dont elle est dérivée, la technique Fluorospot permet l'analyse simultanée de plusieurs cytokines et est donc plus adaptée à la détection des profils de sécrétion et de la fréquence des LT polyfonctionnels, associés à un bon pronostic dans plusieurs pathologies. Nos résultats ont permis la validation technique de ce test pour la détection des couples IFN/interleukine (IL)-10 et IFN/IL-2. Grâce au développement au laboratoire d'une lignée produisant de l'IFN et l'IL-10, nous avons montré que le Fluorospot avait une sensibilité supérieure à la cytométrie intracellulaire pour la détection de l'IFN et de l'IL-10. Il était déjà connu que l'IL-10 était difficilement détectable par cytométrie, renforçant l'intérêt du Fluorospot pour détecter les cellules Tr1. L'utilisation du Fluorospot lors du suivi de la réponse vaccinale antigrippale a également permis de démontrer une équivalence de sensibilité avec l'Elispot. Au cours du suivi de ce protocole anti-grippal, nous avons montré à l'aide du Fluorospot que la réponse LT antigrippale était surtout caractérisée par une forte production d'IL-2 et que la détection isolée d'IFN a une faible sensibilité pour la mesure des réponses LT anti-grippales. Il s'agit de la première utilisation de ce test pour le suivi d'un protocole vaccinal démontrant sa robustesse et sa faisabilité dans un contexte clinique. Nos résultats offrent donc une validation complète de la technique Fluorospot, aussi bien du point de vue technique que clinique, ouvrant des perspectives d'utilisation pour le suivi de futurs protocoles. / The detection of cellular response via its different T cell subpopulations was proved to be crucial to better understand mechanisms of pathologies and monitor protocols of immunotherapy. Unicellular cytokine measurement not only allows the assessment of their inherent role on immunological response, but also the detection of T lymphocytes (LT) secretion profile which gives information on subpopulations involved, their activation state and their functionality. Detection of the cytokine secreting cells frequency is achievable with Elispot. This test is widely used in clinical trials to monitor vaccine response to diseases such as influenza. Although seroprotection is the recognized parameter to assess anti-influenza vaccine efficiency, cellular response has been proved to play an important role in infection control. Our results highlighted that the use of the whole vaccine to monitor T cell response may induce bias in cytokine detection. Indeed, their excipients can be considered as contaminants, like Thimerosal which is used as a preservative in some vaccines. We demonstrated that it induced detection of small spots in interferon (IFN) Elispot. We proved that these spots were associated with in vitro early abortive T cell activation. However, their size enabled us to remove these unspecific spots from bona fide spots.Fluorospot test is suited for multiplex cytokine analysis. Thus it is more adapted than Elispot to detect cytokine secretion profiles and polyfunctional T cells frequency. It is worth noting that polyfunctionnal Tcells are associated with a better clinical outcome in several pathologies. Our results led to technical validation of this test for detection of two cytokines couples, IFN/interleukin (IL)-10 and IFN/IL-2. Fluorospot showed a better sensitivity than intracellular staining cytometry (ICS) in detection of IFN and IL-10 produced by a cell line transfected with the cDNA encoding these cytokines. Moreover, Fluorospot demonstrated a similar sensitivity than Elispot when used to monitor the immunological response to an anti-influenza vaccine. Furthermore, using this technique, we showed that anti-influenza T cell producing IL-2 were the dominant population of T cells. Isolated IFN producing T cells were less sensitive than the detection of IL-2 to detect specific T cell response against influenza. Therefore our results provided a full validation of Fluorospot test, for the technical part as well as for the clinical part. These conclusions open perspectives of using this method to monitor protocols in a near future.

The aim of this project is to design an algorithm that identifies the Area of Interest (AOI) in ELISpot and FluoroSpot images. ELISpot and FluoroSpot are two varieties of a biochemical test used to analyze immune responses by quantifying the amount of cytokine secreted by cells. ELISpot and FluoroSpot images show a well that contains the cytokinesecreting cells which appear as scattered spots. Prior to counting the number of spots, it is required to detect the area in which to count the spots, i.e. the area delimited by the contour of the well. We propose to use the Circle Hough Transform together with filtering and the Laplacian of Gaussian edge detector in order to accurately detect such area. Furthermore we develop an outlier removal method that contributes to increase the robustness of the proposed detection method. Finally we compare our algorithm with another algorithm already in use. A Swedish biotech company called Mabtech has implemented an AOI identifier in the same field. Our proposed algorithm proves to be more robust and provides consistent results for all the images in the dataset.

In dieser Promotionsarbeit wird der Quad-Color FluoroSpot (QCF) vorgestellt, welcher die Bestimmung der Frequenz von DENV-Serotyp-spezifischen und DENV- Serotyp-kreuzreaktiven B-Zellen auf Einzelzellbasis ermöglicht. Das vorgestellte Verfahren erlaubt die umfassende Analyse der spezifischen B-Zellantwort, so wie sie sich während einer primären oder sekundären DENV-Infektion bzw. nach einer Dengueimpfung entwickelt. Außerdem ermöglicht der QCF die Beurteilung, ob die DENV-Serotypspezifität bzw. -kreuzreaktivität von B-Zellen als Surrogatmarker für Immunschutz bei DENV-Infizierten bzw. in Studien, welche Dengueimpfstoff- kandidaten testen, relevant ist. Außerdem kann das Verfahren durch die Anpassung des verwendeten Antigens auch zur Beurteilung der B-Zellantwort, so wie sie sich nach einer Infektion mit anderen Erregern wie HIV oder Influenzavirus entwickelt, Anwendung finden. / Dengue is a major public health problem globally. It is caused by four antigenically distinct serotypes of dengue virus (DENV1-4), and although serotype-specific and strongly neutralizing cross-reactive immune responses against the four DENV serotypes are thought to be protective, subneutralizing Abs can contribute to increased disease severity upon secondary infection with a different DENV serotype. Understanding the breadth of the immune response in natural DENV infections and in vaccinees is crucial for determining the correlates of protection or disease severity. Transformation of B cell populations to generate mAbs and ELISPOT assays have been used to determine B cell and Ab specificity to DENV; however, both methods have technical limitations. We therefore modified the conventional ELISPOT to develop a Quad-Color FluoroSpot to provide a means of examining B cell/Ab serotype specificity and cross-reactivity on a single-cell basis. Abs secreted by B cells are captured by an Fc-specific Ab on a filter plate. Subsequently, standardized concentrations of all four DENV serotypes are added to allow equal stoichiometry for Ag binding. After washing, the spots, representing individual B cells, are visualized using four fluorescently labeled DENV serotype-specific detection mAbs. This method can be used to better understand the breadth and magnitude of B cell responses following primary and secondary DENV infection or vaccination and their role as immune correlates of protection from subsequent DENV infections. Furthermore, the Quad-Color FluoroSpot assay can be applied to other diseases caused by multiple pathogen serotypes in which determining the serotype or subtype-specific B cell response is important.