Background: Foamy viruses (FVs) have developed a unique budding strategy within the retrovirus family. FV release requires co-expression and a highly specific interaction between capsid (Gag) and glycoprotein (Env), which cannot be complemented by heterologous Env proteins. The interaction domain in FV Env has been mapped in greater detail and resides mainly in the N-terminal tip of the cytoplasmic domain of the Env leader peptide subunit. In contrast, the corresponding domain within Gag is less well defined. Previous investigations suggest that it is located within the N-terminal part of the protein. Results: Here we characterized additional Gag interaction determinants of the prototype FV (PFV) isolate using a combination of particle release, GST pull-down and single cycle infectivity analysis assays. Our results demonstrate that a minimal PFV Gag protein comprising the N-terminal 129 aa was released into the supernatant, whereas proteins lacking this domain failed to do so. Fine mapping of domains within the N-terminus of PFV Gag revealed that the N-terminal 10 aa of PFV Gag were dispensable for viral replication. In contrast, larger deletions or structurally deleterious point mutations in C-terminally adjacent sequences predicted to harbor a helical region abolished particle egress and Gag – Env protein interaction. Pull-down assays, using proteins of mammalian and prokaryotic origin, support the previous hypothesis of a direct interaction of both PFV proteins without requirement for cellular cofactors and suggest a potential direct contact of Env through this N-terminal Gag domain. Furthermore, analysis of point mutants within this domain in context of PFV vector particles indicates additional particle release-independent functions for this structure in viral replication by directly affecting virion infectivity. Conclusions: Thus, our results demonstrate not only a critical function of an N-terminal PFV Gag motif for the essential capsid - glycoprotein interaction required for virus budding but also point out additional functions that affect virion infectivity.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22333号 / 医博第4574号 / 新制||医||1041(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 朝長 啓造, 教授 萩原 正敏, 教授 齊藤 博英 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Die Spumaretrovirinae, mit ihrer einzigen Gattung der Foamyviren (FV), nehmen aufgrund einer recht ungewöhnlichen Replikationsstrategie und Ähnlichkeiten mit den Hepadnaviren eine Sonderstellung innerhalb der Familie der Retroviren ein. Eine Besonderheit der FV ist, daß sie für die Partikelfreisetzung, im Gegensatz zu den Orthoretroviren, die beiden strukturellen Proteine Gag und Env benötigen. Das Gag- Protein trägt alle für den Kapsidzusammenbau nötigen strukturellen Komponenten, kann jedoch durch eine fehlende Membranbindungsdomäne nicht mit Zellmembranen assoziieren. Der Membrantransport der bereits im Zytoplasma zusammen gebauten FV Kapside wird vermutlich durch das FV Env-Protein vermittelt. Das FV Hüllprotein ist jedoch auch alleine zur Freisetzung von Kapsidlosen, Hüllprotein-haltigen subviralen Partikeln (SVP) fähig. Da eine Envunabhängige Freisetzung virus-ähnlicher Partikel durch ein FV Gag-Protein mit künstlichem Membrananker möglich ist, scheint das FV Gag-Protein auch essentielle strukturelle Elemente für die Partikelfreisetzung zu enthalten. In den letzten Jahren wurden große Fortschritte in der Erforschung der Freisetzung von membranumhüllten Viren und den daran beteiligten viralen Determinanten und zellulären Mechanismen gemacht. Wobei den meist in den viralen Kapsidproteinen vorkommenden Late (L)-Domänen und deren Interaktion mit dem zellulären Proteinsortierungsweg in Multivesikuläre Körperchen (MVB) eine besondere Bedeutung zu kommt. Über die FV virale und subvirale Partikelfreisetzung und die dabei involvierten strukturellen viralen Domänen und zellulären Proteinen war jedoch bisher wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch Mutationsanalysen von drei potentiellen L-Domän Sequenzmotiven im Prototyp FV (PFV) Gag-Protein ein, innerhalb der Primaten FV konserviertes, PSAP Konsensusmotiv als funktionelle L-Domäne charakterisiert werden. Dessen Mutation führte zu klassischen L-Domän Defekten mit verringerter Partikelfreisetzung, sowie einer elektronenmikroskopisch sichtbaren Arretierung der Virusknospung und seine Funktion war durch homo- und heterologe L-Domän Motive anderer Retroviren teilweise oder vollständig ersetzbar. Ein PPPI Motiv in PFV Gag, mit Ähnlichkeit zur L-Domän PPXY Konsensussequenz, schien jedoch keinen Einfluß auf die FV Freisetzung zu besitzen. Die Charakterisierung eines in allen FV Gag-Proteinen konservierten YXXL Motivs ließ eher auf eine wichtige Rolle beim korrekten Kapsidzusammenbau, als auf eine klassische LDomän Funktion schließen. Eine korrekte Kapsidmorphogenese schien entscheidend für die reverse Transkription des Virusgenoms zu sein. Durch Koexpression verschiedener dominant-negativer Mutanten des zellulären ESCRT-Proteinssortierungsweges konnte gezeigt werden, daß die virale Partikelfreisetzung von PFV augenscheinlich dem generellen Model der Freisetzung vieler membranumhüllter Viren über das VPS-System folgt. Eine spezifische Interaktion des PFV Gag PSAP L-Domän Motivs mit TSG101, einer frühen Komponente der ESCRT-Komplexe, verbindet PFV mit dem VPS-Sortierungsweg der Zelle. Die besondere Fähigkeit des FV Env-Proteins zur Freisetzung von SVPs wurde bereits vor einiger Zeit entdeckt, dennoch war bisher nichts über die viralen und zellulären Determinanten bekannt, die zu einer Knospung des Env-Proteins in Vesikel führten. Durch eine Reihe von Deletions- und Mutationsanalysen des PFV Env-Proteins konnten in dieser Arbeit zwei für die SVP-Freisetzung inhibitorische Abschnitte am N- und C-Terminus der zytoplasmatischen Domänen des Env- Proteins ermittelt werden. Weiterhin wurden essentielle Sequenzen im Leaderpeptid, sowie die Notwendigkeit der Membranspannenden Domäne der Transmembran- Untereinheit für die SVP-Freisetzung festgestellt. Obwohl das PFV Env-Protein kein bekanntes L-Domän Sequenzmotiv enthält, konnte ein Einfluß später Komponenten der ESCRT-Maschinerie auf die SVP-Bildung beobachtet werden. Wobei die genaue Eintrittsstelle in den VPS-Weg im Rahmen dieser Arbeit nicht definiert werden konnte. Die vorgenommen Analysen lassen vermuten, daß die Bildung von SVPs durch die Konzentration der Env-Proteine in der Zellmembranen reguliert wird. Welche genauen Mechanismen dabei zu Grunde liegen und wieweit die zelluläre Ubiquitinylierungsmaschinerie involviert ist, bedarf jedoch weiterer Erforschung. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen erneut die Sonderstellung der FV innerhalb der Familie der Retroviren. Auf der einen Seite folgt die foamyvirale Viruspartikelfreisetzung den typischen Mechanismen der retroviralen Virusknospung. Andererseits zeigt die Freisetzung von subviralen Partikeln, die bei keinem anderen Retrovirus bisher beobachtet wurde, eine weitere Parallele zur Replikationsstrategie der Hepadnaviren auf.

Like all other viruses, a successful egress of functional particles from infected cells is a prerequisite for foamy virus (FV) spread within the host. The budding process of FVs involves steps, which are shared by other retroviruses, such as interaction of the capsid protein with components of cellular vacuolar protein sorting (Vps) machinery via late domains identified in some FV capsid proteins. Additionally, there are features of the FV budding strategy quite unique to the spumaretroviruses. This includes secretion of non-infectious subviral particles and a strict dependence on capsid-glycoprotein interaction for release of infectious virions from the cells. Virus-like particle release is not possible since FV capsid proteins lack a membrane-targeting signal. It is noteworthy that in experimental systems, the important capsid-glycoprotein interaction could be bypassed by fusing heterologous membrane-targeting signals to the capsid protein, thus enabling glycoprotein-independent egress. Aside from that, other systems have been developed to enable envelopment of FV capsids by heterologous Env proteins. In this review article, we will summarize the current knowledge on FV budding, the viral components and their domains involved as well as alternative and artificial ways to promote budding of FV particle structures, a feature important for alteration of target tissue tropism of FV-based gene transfer systems.

Like all other viruses, a successful egress of functional particles from infected cells is a prerequisite for foamy virus (FV) spread within the host. The budding process of FVs involves steps, which are shared by other retroviruses, such as interaction of the capsid protein with components of cellular vacuolar protein sorting (Vps) machinery via late domains identified in some FV capsid proteins. Additionally, there are features of the FV budding strategy quite unique to the spumaretroviruses. This includes secretion of non-infectious subviral particles and a strict dependence on capsid-glycoprotein interaction for release of infectious virions from the cells. Virus-like particle release is not possible since FV capsid proteins lack a membrane-targeting signal. It is noteworthy that in experimental systems, the important capsid-glycoprotein interaction could be bypassed by fusing heterologous membrane-targeting signals to the capsid protein, thus enabling glycoprotein-independent egress. Aside from that, other systems have been developed to enable envelopment of FV capsids by heterologous Env proteins. In this review article, we will summarize the current knowledge on FV budding, the viral components and their domains involved as well as alternative and artificial ways to promote budding of FV particle structures, a feature important for alteration of target tissue tropism of FV-based gene transfer systems.