La pourriture grise, causée par le champignon Botrytis cinerea, est l'une des principales maladies aériennes fongiques sur diverses cultures d’importance agronomique. La diversité génétique de B. cinerea est très forte et la capacité rapide d’adaptation de ce champignon à une pression sélective est également avérée. Ce champignon est ainsi capable de développer des résistances à une grande variété de composés fongicides de synthèse ou d'origine naturelle. Des méthodes alternatives de lutte ont de ce fait été développées ces dernières années : divers agents de lutte biologique (ALB) présentant différents modes d’actions ont été identifiés et pour certains d’entre eux commercialisés pour contrôler B. cinerea. Cependant la durabilité de la lutte biologique est un domaine encore très peu étudié. La perte d'efficacité d'un ALB pourrait résulter de la préexistence d’isolats moins sensibles de pathogènes dans les populations naturelles et/ou de la capacité de l’agent pathogène à produire, sous une pression de sélection continue exercée par l’ALB, des mutants ayant une sensibilité réduite. L'objectif global de la présente étude est d'évaluer le risque potentiel de perte d'efficacité de la lutte biologique vis-à-vis de B. cinerea. Dans cette étude, les efforts ont été concentrés sur la pyrrolnitrine, un antibiotique produit par divers ALBs, dont certains sont efficaces contre B. cinerea. Les objectifs spécifiques de l'étude étaient (i) d’évaluer la diversité de la sensibilité à la pyrrolnitrine au sein de la population naturelle de B. cinerea, (ii) d'estimer le risque de perte d'efficacité des ALBs produisant la pyrrolnitrine due à la pression de sélection exercée par la pyrrolnitrine et (iii) d'étudier le mécanisme de résistance à la pyrrolnitrine chez B. cinerea. Parmi 204 isolats de B. cinerea, une gamme importante de sensibilité à la pyrrolnitrine a été observée, avec un facteur de résistance de 8,4 entre l’isolat le plus sensible et l'isolat le moins sensible. La production de 20 générations successives pour 4 isolats de B. cinerea, sur des doses croissantes de pyrrolnitrine, a abouti au développement de mutants avec des niveaux élevés de résistance à l'antibiotique, et à une réduction in vitro de la sensibilité à la bactérie productrice de pyrrolnitrine Pseudomonas chlororaphis PhZ24. La comparaison entre les mutants résistants à la pyrrolnitrine et leurs parents sensibles pour la croissance mycélienne, la sporulation et l'agressivité sur plantes a révélé que la résistance à la pyrrolnitrine est associée à un fort coût adaptatif. Des observations cytohistologiques sur tomates ont confirmé que l’isolat sensible à la pyrrolnitrine attaque le pétiole rapidement et envahit la tige, alors que le mutant résistant à la pyrrolnitrine ne s'étend pas au-delà du pétiole. De plus, ce dernier mutant forme un mycélium anormal et des cellules ressemblant à des chlamydospores. Les résultats ont d'autre part révélé que les mutants de B. cinerea résistants à la pyrrolnitrine sont résistants au fongicide iprodione, suggérant ainsi qu'une pression exercée par la pyrrolnitrine sur le champignon conduit à une résistance au fongicide. Réciproquement, la production de générations successives sur iprodione conduit à une résistance à l'antibiotique. Afin d'étudier les déterminants moléculaires de la résistance de B. cinerea à la pyrrolnitrine, le gène histidine kinase Bos1, impliqué entre autres dans la résistance aux fongicides chez B. cinerea a été séquencé chez les souches sensibles et les mutants résistants. La comparaison des séquences a mis en évidence des mutations ponctuelles différentes chez les mutants de B. cinerea obtenus sur la pyrrolnitrine et ceux obtenus sur l'iprodione. De plus, les résistances à la pyrrolnitrine et à l'iprodione ne sont pas systématiquement associées à une mutation ponctuelle dans le gène Bos1. Enfin, aucune modification n'a été détectée dans la taille des allèles de neuf locus microsatellites quelle que soit la pression sélective exercée et quelle que soit le phénotype du mutant produit. Cette étude montre qu'un champignon pathogène des plantes est capable de développer progressivement une moindre sensibilité à un agent de lutte biologique mais que cette moindre sensibilité est associée à une forte perte de fitness / Gray mould, caused by Botrytis cinerea, is a severe disease on a wide range of crops. Disease control generally relies on chemicals, although biological control strategies have been intensively studied over the last decades. This pathogen can withstand a wide variety of fungitoxic compounds including fungicides and natural molecules. This capacity to adapt to different stress might, potentially, compromise the durability of biological control methods. The global purpose of that work was to estimate the potential of B. cinerea to overcome the efficacy of biological control agents. Knowledge on the potential development of resistance to biological control agents can help to devise or improve resistance management strategies. In this work, efforts have been focused on the antibiotic pyrrolnitrin produced by various bacteria described as potential biological control agents against B. cinerea. The specific objectives of the study were (i) to evaluate the diversity in susceptibility to pyrrolnitrin among natural population of B. cinerea, (ii) to estimate the risk of loss of efficacy of pyrrolnitrinproducing biological control agent due to selection pressure exerted by pyrrolnitrin and (iii) to study the mechanism of resistance to pyrrolnitrin in B. cinerea. An important range of sensitivity to pyrrolnitrin with an 8.4-fold difference in EC50 values between the most sensitive and the least sensitive isolates was observed within the 204 isolates tested. The production of 20 generations, for 4 isolates of B. cinerea, on increasing doses of pyrrolnitrin, resulted in the development of mutants of B. cinerea with high levels of resistance to the antibiotic and a reduced sensitivity in vitro to the pyrrolnitrin-producing Pseudomonas chlororaphis PhZ24. Comparison of the pyrrolnitrin-resistant mutants and their sensitive parent isolates for mycelial growth, sporulation and aggressiveness on plant tissues revealed that the high level of resistance to pyrrolnitrin has resulted in a high fitness cost. Additional cytohistological investigations revealed that while the sensitive isolate spread throughout the petiole and rapidly invaded the stem via the abscission zone, the pyrrolnitrinresistant mutant failed to extend beyond petiole to invade the stem. Moreover, the pyrrolnitrin-resistant mutant formed abnormal mycelium and chlamydospore-like cells. The comparison of resistance to pyrrolnitrin and to the iprodione fungicide in B. cinerea revealed that fungicide pressure exerted on the fungus is able to build-up resistance to pyrrolnitrin. Comparison of sequences of the osmosensing class III histidine kinase encoding gene bos1 revealed different mutations in pyrrolnitrin- and iprodione-resistant mutants. However, resistance to pyrrolnitrin and to iprodione was not systematically associated with a point mutation in the Bos1 gene. Finally, no changes were observed in the allele size at nine microsatellite loci whatever the four selective pressure endured by the fungus despite their phenotypic changes. This study provides evidence that a fungal plant pathogen is able to gradually build-up resistance to an antibiotic produced by a biocontrol agent

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La sélection naturelle constitue un processus clé de l’adaptation des populations à leur environnement, favorisant les variants présentant les meilleures valeurs sélectives. Les champignons présentent généralement des traits biologiques (diversité des modes de reproduction, grandes tailles de populations, fortes capacités de dispersion, entre autres) qui favorisent leur adaptation à des environnements variés. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’évolution de leurs populations sous les contraintes, naturelles et anthropiques, qu’elles subissent constituent donc un enjeu majeur pour la protection des plantes, en particulier dans le contexte actuel de durabilité des méthodes de lutte. Dans cette thèse, nous avons décrit la structure et la diversité des populations Botrytis cinerea à l’aide de marqueurs neutres et sélectionnés et d’un échantillonnage emboîté, et avons proposé des mécanismes pouvant expliquer les résultats observés. Puis nous avons analysé la réponse adaptative des populations de B. cinerea en Champagne, aux applications de fongicides. Premièrement, nous avons montré que la pourriture grise était causée par un complexe de deux espèces cryptiques, vivant en sympatrie sur des hôtes communs. De plus, les populations françaises de B. cinerea sont structurées en cinq dèmes, caractérisés par le système de culture (sélection directionnelle), la plante-hôte (adaptation écologique), et dans une moindre mesure, par la géographie. Sur vigne, nous avons mis en évidence une entité dont l’isolement génétique semble lié à un isolement temporel. Par ailleurs, nous avons montré que l’application de fongicides conduit à la sélection de phénotypes résistants spécifiquement à quasiment tous les modes d’action homologués, selon des proportions variant suivant les vignobles et les usages. Plus particulièrement, la résistance aux fongicides inhibiteurs de la succinate déshydrogénase (SDHI) est causée par au moins sept mutations affectant les gènes encodant la protéine cible de ces fongicides, déterminant ainsi une grande variété de phénotypes. Enfin, nous avons montré que les fongicides ne modifiaient pas la structure neutre des populations mais qu’ils pouvaient conduire à une perte de richesse allélique dans les populations traitées ainsi qu’à un équilibre sélection-migration détectable dans certaines situations sous forme de clines au loci sous pression de sélection contemporaine tels que ceux déterminant la résistance multidrogues. La modélisation de l’évolution des fréquences de résistance hivernale a permis d’estimer le coût de la résistance pour quatre loci déterminant la résistance aux fongicides. Cette thèse a permis d’appréhender le fonctionnement des populations de B. cinerea et de comprendre et quantifier partiellement les mécanismes sélectifs opérant in natura. Ces informations seront utilisées pour raisonner des stratégies anti-résistance adaptées localement et durables. / Natural selection is the most powerful force driving population adaptation to their environment, favoring the variants with the best fitness. Fungi generally exhibit biological traits (diversity of reproduction modes, large population sizes, and intense dispersion) that favor their adaptation to changing environments. Therefore, disentangling the mechanisms that explain their evolution under natural and anthropic constraints constitute a major challenge for plant protection, especially in the actual context of agriculture sustainability. In this thesis, we described Botrytis cinerea population structure and diversity, using neutral and selected markers and a hierarchical sampling, and proposed mechanisms that may explain these observations. We then analyzed the adaptive answer of this species towards fungicide applications. First, we showed that grey mold populations were caused by a complex of two cryptic species, living sympatrically on the same hosts. Second, B. cinerea populations are divided into five demes, according to the cropping system (directional selection), the host-plant (ecological adaptation), and to a lesser extent, by geography. On grapevine, we identified a specific populations exhibiting temporal isolation, as an evidence of extreme exploration of the viticultural conditions. Moreover, fungicide applications select resistance towards all unisite modes of action, with few exceptions, but at varying proportions according to vineyards and fungicide use. More specifically, resistance to succinate dehydrogenase inhibitors (SDHIs) is caused by at least seven mutations altering the target genes of these fungicides, and determines a large variety of phenotypes in the field. At last, we showed that fungicides did not shape population structure but that they could decrease allele richness in treated areas and lead to migration-selection equilibrium, detectable in some situation and for loci under contemporary selective pressures as clines. Modeling the evolution of resistance during winter allowed estimating fitness cost of four loci involved in contemporary fungicide resistance, such as multidrug resistance. As a conclusion, this thesis helped to understand how B. cinerea populations evolve and to detect and quantify selective mechanisms at work in natura. This information will be useful to deign sustainable and locally-adapted anti-resistance strategies.