Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-03-27Bitstream added on 2014-06-13T19:55:55Z : No. of bitstreams: 1 nakagi_vs_me_jabo.pdf: 402591 bytes, checksum: bde6a86608bbb9a9d68eb164ee5cc8ca (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A produção de fosfatase ácida extracelular pelo fungo Penicillium implicatum foi estudada em diferentes concentrações de fosfato no meio de cultivo e na presença e ausência de agitação. A produção de fosfatase ácida extracelular repressível foi cerca de 15 vezes maior em meio agitado e na presença de 50 ìM de KH2PO4 quando comparada ao tratamento controle. A enzima foi purificada 19 vezes em Fenil Sepharose CL-4B, e apresenta uma atividade específica de 27,3U/mg. A enzima é um monômero de massa molecular (Mr) da ordem de 45KDa. O pH ótimo aparente das atividades p-NFFásica e de pirofosfatase é de 5,5. Os íons Zn, Mg, e Co; EDTA, tartarato e iodoacetamida exerceram pouca ou nenhuma influência sobre a atividade da fosfatase ácida de P. implicatum; enquanto que a enzima foi inibida por molibdato e arsenato. A enzima apresenta atividade pirofosfatásica de 297,78U/mg a 4mM de pirofosfato e pH 5,5. A cinética de hidrólise simultânea dos substratos PNFF e PPi mostrou que ambos os substratos ligaram-se ao mesmo sítio. A aplicação da fosfatase na hidrólise de fitato em ração animal sugere uma forma de disponibilizar fosfato para o organismo e também minimizar o impacto ambiental. / The extracellular production of acid phosphatase by Penicillium implicatum was studied at different concentrations of phosphate and in the presence and absence of agitation growth medium. The production of extracellular repressible acid phosphatase was about 15-fold highest in agitated medium with 50ì M of KH2PO4 when compared to the control treatment. The enzyme was purified 19-fold on Phenyl Sepharose CL-4B and showed specific activity of 27,3U/mg. The enzyme is a monomer with molecular weight (Mr) of ~ 45KDa. The optimum pH of the p-NPP and pyrophosphate activities was 5,5. The Zn, Mg, Ca, Mn and Co ions, EDTA and tartarate had no effects; but it was inhibitored by arsenate and molybdate. The pyrophosphate activity was 298U/mg at 4mM and pH 5,5. The kinetics data of simultaneous p-NPP and pyrophosphate hydrolysis, showed that both substrates had bound the same active site. The phosphatase application on fitate hydrolysis in animal food suggests a mean to dispose phosphate to the organism and also to minimize the environmental impact.

Orientador: João Martins Pizauro Júnior / Banca: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Banca: Pietro Ciancaglini / Resumo: A produção de fosfatase ácida extracelular pelo fungo Penicillium implicatum foi estudada em diferentes concentrações de fosfato no meio de cultivo e na presença e ausência de agitação. A produção de fosfatase ácida extracelular repressível foi cerca de 15 vezes maior em meio agitado e na presença de 50 ìM de KH2PO4 quando comparada ao tratamento controle. A enzima foi purificada 19 vezes em Fenil Sepharose CL-4B, e apresenta uma atividade específica de 27,3U/mg. A enzima é um monômero de massa molecular (Mr) da ordem de 45KDa. O pH ótimo aparente das atividades p-NFFásica e de pirofosfatase é de 5,5. Os íons Zn, Mg, e Co; EDTA, tartarato e iodoacetamida exerceram pouca ou nenhuma influência sobre a atividade da fosfatase ácida de P. implicatum; enquanto que a enzima foi inibida por molibdato e arsenato. A enzima apresenta atividade pirofosfatásica de 297,78U/mg a 4mM de pirofosfato e pH 5,5. A cinética de hidrólise simultânea dos substratos PNFF e PPi mostrou que ambos os substratos ligaram-se ao mesmo sítio. A aplicação da fosfatase na hidrólise de fitato em ração animal sugere uma forma de disponibilizar fosfato para o organismo e também minimizar o impacto ambiental. / Abstract: The extracellular production of acid phosphatase by Penicillium implicatum was studied at different concentrations of phosphate and in the presence and absence of agitation growth medium. The production of extracellular repressible acid phosphatase was about 15-fold highest in agitated medium with 50ì M of KH2PO4 when compared to the control treatment. The enzyme was purified 19-fold on Phenyl Sepharose CL-4B and showed specific activity of 27,3U/mg. The enzyme is a monomer with molecular weight (Mr) of ~ 45KDa. The optimum pH of the p-NPP and pyrophosphate activities was 5,5. The Zn, Mg, Ca, Mn and Co ions, EDTA and tartarate had no effects; but it was inhibitored by arsenate and molybdate. The pyrophosphate activity was 298U/mg at 4mM and pH 5,5. The kinetics data of simultaneous p-NPP and pyrophosphate hydrolysis, showed that both substrates had bound the same active site. The phosphatase application on fitate hydrolysis in animal food suggests a mean to dispose phosphate to the organism and also to minimize the environmental impact. / Mestre

Orientador: Hiroshi Aoyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T12:05:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_CarmenVerissima_M.pdf: 6901592 bytes, checksum: ae281be837b3a7c042cf49f019d3a59e (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: Quatro frações contendo atividade fosfatásica ácida (AP1, AP2, AP3A e AP3B) foram detectadas e purificadas à partir do extrato solúvel de sementes de soja quiescentes através da precipitação com sulfato de amônio e acetona e cromatografias de troca iônica, filtração em gel e afinidade. Em coluna de SP-Sephadex a fração APl foi eluída com o tampão de equilíbrio (tampão acetato 0,01 M, pH 5,0), enquanto as frações AP2 e AP3 foram eluídas com 0,05 e 0,3 M de fosfato, respectivamente. As frações AP3A e AP3B foram obtidas da fração AP3 aplicada em coluna de DEAE-Sephadex. A atividade enzimática foi determinada utilizando p-NPP como substrato em tampão acetato 100 mM, pH 5,0, a 37°C. Atividades específicas de 50, 10, 0,84 e 2 'um¿ .min-1.mg-1 foram obtidas para Apl (purificação de 910 vezes), AP2 (180 vezes), AP3A (16 vezes), e AP3B (36 vezes), respectivamente. Massas moleculares relativas de 51.000, 58.000, 52.000 e 30.000 foram determinadas para APl, AP2, AP3A e AP3B, respectivamente, através de filtração em gel na coluna SW 300 (Waters Protein Glass) acoplada a um sistema de LC. Das 4 frações, somente a APl se ligou à coluna de conA-Sepharose, embora provavelmente as outras frações também tenham carboidratos em suas estruturas. O perfil de eluição nas cromatografias de troca iônica mostrou que as 4 frações apresentavam pI diferentes. Após a purificação, foram realizados estudos cinéticos para as 4 frações de fosfatases ácidas. A fração APl apresentou uma alta atividade em pH 4,5-6,0, enquanto para as outras frações, a faixa de pH ótimo foi 5,0-6,5. APl e AP2 exibiram maior especificidade pelo substrato do que AP3A e AP3B. Os valores de Km foram determinados para p-NPP, Tyr-P e PPi, em pH 5,0 a 37°C. As fosfatases ácidas apresentaram os seguintes valores de Km: APl (p-NPP - 0,49, PPi - 0,51 e Tyr-P - 1,14 mM); AP2 (p-NPP - 0,38, PPi - 1,33 e Tyr-P - 1,14 mM); AP3A (p- NPP - 0,20, PPi - 0,16 e Tyr-P - 0,19 mM) e AP3B (p-NPP - 0,086, PPi - 0,17 e Tyr-P - 0,17 mM). A atividade das 4 frações não foi afetada na presença de EDTA, DTT, GSH e 2-mercaptoetanol. O fosfato, fluoreto, vanadato, molibdato e os cátions CU2+e Zn2+,inibiram as 4 frações, quando se utilizou o p-NPP como substrato. Ao contrário de outras fosfatases ácidas de planta, as 4 frações apresentaram alta atividade em temperatura acima de 80°C, durante 10 minutos de incubação. No entanto, quando as mesmas foram pré-incubadas a 80°C houve perda da atividade após 5 min., indicando portanto que a presença do substrato é importante para a manutenção da atividade nesta temperatura. Nenhuma das frações catalizou a reação de transfosforilação, uma vez que na presença de aceptores de fosfato (glicerol, metanol e etanol) não ocorreu aumento da atividade enzimática. Os resultados obtidos mostram que as 4 frações não apresentaram diferenças significativas em suas propriedades cinéticas / Abstract: Four fractions of acid phosphatase (API, AP2, AP3A,and AP3B) have been detected and purified from soybean seeds soluble extract through ammonium sulfate and acetone precipitations, and ion exchange, gel filtration and concanavalin Asepharose chromatographies. API was eluted with equilibrium buffer, while AP2 and AP3 were eluted with 0.05 and 0.3 M inorganic phosphate, respectively, from SP-Sephadex column, AP3A and AP3B were the enzymatic fractions originated from AP3 applied on the DEAE-Sephadex column. The enzyme activity was determined using p-nitrophenylphosphate as substrate in 100mM acetate buffer, pH 5, at 37°C. Specific activity values of 50, 10, 0.84 and 2 Umol.min-1.mg-w1 ere obtained for API (910-fold purification), AP2 (180-fold), AP3A (16-fold), and AP3B (36-fold), respectively.The relative molecular mass of API, AP2, AP3A and AP3B were determined by 300 SW Waters Protein Glass column, were found to be 51,000, 58,000, 52,000 and 30,000, respectively. The four acid phosphatase forms purified seemed to be glycoproteins, however, only AP1 could bind to concanavalina A Sepharose. Ion exchange chromatography elution pattems showed that soybean seed acid phosphatases essentially differed in relation to their isoelectric point. The kinetic properties of the four fractions of soybean seeds acid phosphatases were studied. API presented a high activity at pH 4.5-6.0, while for the other fractions the optimum pH range was 5.0-6.5. API and AP2 exhibited higher substrate specificity than AP3A and AP3B. The Km values were determined for p-nitrophenylphosphate, tyrosinephosphate and inorganic pyrophosphate, at pH 5.0 and 37°C. The acid phosphatases presented the following apparent Km values: API (pNPP -0.49, PPi -0.51 and TyrP - 1.14mM);AP2 (pNPP- 0.38, PPi - 1.33 and TyrP - 1.14 mM); AP3A (pNPP - 0.20, PPi - 0.16 and TyrP - 0.19 mM) and AP3B (pNPP - 0.086, PPi - 0.17 and TyrP - 0.17 mM). Using pNPP as substrate, no effect was observed in the acid phosphatases activity in the presence of EDTA, dithiothreitol, glutathione and 2-mercaptoethanol. The four fractions were inhibited by inorganic phosphate, fluoride, vanadate, molybdate, CU2+and Zn2+.In contrast to other plant acid phosphatases alI the soybean seeds enzymatic forms presented high activities above 80°C, during 10 min incubation. However the enzymes were inactivated after 5 min when pre-incubated at 80°C in the absence of substrate. The soybean seeds acid phosphatases did not catalyze the transphosphorylation reaction since no stimulation was observed with inorganic phosphate acceptors (glycerol, methanol and ethanol). Our results showed that no significative differences could be observed on the kinetic properties for the four soybean seed acid phosphatase fractions / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-11Bitstream added on 2014-06-13T20:56:20Z : No. of bitstreams: 1 rombola_th_me_jabo.pdf: 290913 bytes, checksum: 08f244b9cd35a229582ac7563c4b4ff9 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Espécies de Burkholderia filogenéticamente distantes do complexo B. cepacia, são versáteis solubilizadores de minerais insolúveis, através da produção de ácidos, viabilizando nutrientes para as plantas. Descrevemos a purificação e caracterização da fosfatase ácida ligada à membrana, produzida pela bactéria do gênero Burkholderia, isolada de solo agrícola em Ponta grossa-PR-BRASIL, e identificada através da análise do 16s rDNA. A expressão da enzima se mostrou estritamente dependente ao fósforo (expressão ótima a 5 mM). A enzima ligada à membrana foi purificada por ultracentrifugação a 100.000g por 1 hora a 4°C e testada com atividade enzimática para p-nitrofenilfosfato (PNFF) e Pirofosfato. O pH ótimo da enzima foi 6 e não foi afetado pela concentração de PNFF. Em pH 6 a hidrolise do PNFF seguiu os seguintes parâmetros cinéticos com n=1.5, Vm= 103.8 U.mg-1 e K0,5=0,06 mM em uma faixa de 0,003 e 10 mM de PNFF. Estudos do pH sobre os parâmetros cinéticos demonstraram 26 pontos de variação na faixa de 3,5 a 6 e em seguida diminui até pH 8 enquanto K0,5 não mostrou variação nesta faixa. O H para hidrólise do PNFF foi de 5,74 kcal.mol-1. A atividade PNFFase foi inibida pelo arsenato e Cálcio, mas não por levamisol, EDTA, zinco e cobalto. A hidrolise do pirofosfato na presença de 2 mM de MgCl2 seguiu os parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten” com Km= 0.142 mM e Vm= 237 U.mg-1.Os resultados sugerem que a produção da fosfatase ácida ligada à membrana pode ser um mecanismo de solubilização de fosfato mineral por essa bactéria. / Burkholderia species phylogenetically greatly distant from the B. cepacia complex species are versatile organisms that solubilize insoluble minerals through the production of acids, increasing the availability of nutrients to plants. Here we describe the purification and characterization a membrane-bound acid phosphatase produced by bulkholderia isolated from an agricultural soil in Ponta grossa-PR-BRASIL and identified through analysis of the 16S rDNA gene. The expression of this enzyme was demonstrated to be strictly regulated by phosphorus (optimal expression at 5 mM). The membrane bound enzyme was purified by centrifugation at 100.000g for 1 h at 4ºC and the enzyme was assayed for p-Nitrophenyl phosphatase (PNPPase) and pyrophosphatase activities. The optimal pH (6.0) was not affect by p-Nitrophenyl phosphate concentration. At pH 6.0 the hydrolysis of PNPP following a cooperative kinetics with n= 1.5, Vm= 103.8 U.mg-1 and K0.5= 0.60 mM in the range between 0.003 and 10 mM. Studies of pH effects on kinetics parameters revealed a 26-folds variation in the range of pH 3.5 to 6 following decreases until pH 8.0, wile K0,5 and cooperativity did not varied considerably in this range. The H for hydrolysis of PNPP was 5,74 kcal.mol-1. PNPPase activity was inhibited by arsenate, phosphate and calcium, but not for levamisole, EDTA, zinc, magnesium and cobalt. The hydrolysis of pyrophosphate in presence of 2 mM MgCl2 follows Michaelis-Menten” kinetics with Km= 0.142 mM and Vm= 237 U.mg-1. Our results suggesting that the production of membranebound acid phosphatase might be one mechanism of mineral phosphate solubilization by this genus of Bacterium.

Orientador: João Martins Pizauro Junior / Banca: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Banca: Pietro Ciancaglini / Resumo: Espécies de Burkholderia filogenéticamente distantes do complexo B. cepacia, são versáteis solubilizadores de minerais insolúveis, através da produção de ácidos, viabilizando nutrientes para as plantas. Descrevemos a purificação e caracterização da fosfatase ácida ligada à membrana, produzida pela bactéria do gênero Burkholderia, isolada de solo agrícola em Ponta grossa-PR-BRASIL, e identificada através da análise do 16s rDNA. A expressão da enzima se mostrou estritamente dependente ao fósforo (expressão ótima a 5 mM). A enzima ligada à membrana foi purificada por ultracentrifugação a 100.000g por 1 hora a 4°C e testada com atividade enzimática para p-nitrofenilfosfato (PNFF) e Pirofosfato. O pH ótimo da enzima foi 6 e não foi afetado pela concentração de PNFF. Em pH 6 a hidrolise do PNFF seguiu os seguintes parâmetros cinéticos com n=1.5, Vm= 103.8 U.mg-1 e K0,5=0,06 mM em uma faixa de 0,003 e 10 mM de PNFF. Estudos do pH sobre os parâmetros cinéticos demonstraram 26 pontos de variação na faixa de 3,5 a 6 e em seguida diminui até pH 8 enquanto K0,5 não mostrou variação nesta faixa. O H para hidrólise do PNFF foi de 5,74 kcal.mol-1. A atividade PNFFase foi inibida pelo arsenato e Cálcio, mas não por levamisol, EDTA, zinco e cobalto. A hidrolise do pirofosfato na presença de 2 mM de MgCl2 seguiu os parâmetros cinéticos de "Michaelis-Menten" com Km= 0.142 mM e Vm= 237 U.mg-1.Os resultados sugerem que a produção da fosfatase ácida ligada à membrana pode ser um mecanismo de solubilização de fosfato mineral por essa bactéria. / Abstract: Burkholderia species phylogenetically greatly distant from the B. cepacia complex species are versatile organisms that solubilize insoluble minerals through the production of acids, increasing the availability of nutrients to plants. Here we describe the purification and characterization a membrane-bound acid phosphatase produced by bulkholderia isolated from an agricultural soil in Ponta grossa-PR-BRASIL and identified through analysis of the 16S rDNA gene. The expression of this enzyme was demonstrated to be strictly regulated by phosphorus (optimal expression at 5 mM). The membrane bound enzyme was purified by centrifugation at 100.000g for 1 h at 4ºC and the enzyme was assayed for p-Nitrophenyl phosphatase (PNPPase) and pyrophosphatase activities. The optimal pH (6.0) was not affect by p-Nitrophenyl phosphate concentration. At pH 6.0 the hydrolysis of PNPP following a cooperative kinetics with n= 1.5, Vm= 103.8 U.mg-1 and K0.5= 0.60 mM in the range between 0.003 and 10 mM. Studies of pH effects on kinetics parameters revealed a 26-folds variation in the range of pH 3.5 to 6 following decreases until pH 8.0, wile K0,5 and cooperativity did not varied considerably in this range. The H for hydrolysis of PNPP was 5,74 kcal.mol-1. PNPPase activity was inhibited by arsenate, phosphate and calcium, but not for levamisole, EDTA, zinc, magnesium and cobalt. The hydrolysis of pyrophosphate in presence of 2 mM MgCl2 follows "Michaelis-Menten" kinetics with Km= 0.142 mM and Vm= 237 U.mg-1. Our results suggesting that the production of membranebound acid phosphatase might be one mechanism of mineral phosphate solubilization by this genus of Bacterium. / Mestre