Resumo: A capacidade de bactérias endofíticas em solubilizar fosfato inorgânico é alvo de grande interesse por parte dos microbiologistas, uma vez que as fosfatases são responsáveis por hidrolisar compostos orgânicos produzindo fósforo solúvel. Dessa forma, a fosfatase ácida ligada à membrana (MBAP) foi obtida a partir de Enterobacter sp. isolada de raízes de Cattleya walkeriana (Orchidaceae) e identificada pelo seqüenciamento do gene 16S rRNA. A expressão da enzima mostrou-se estritamente regulada pelo fósforo (expressão ideal em 7 mm). O pH ótimo aparente (3,5) não foi afetado pela concentração de p-nitrofenilfosfato. Em pH 3,5, a enzima é uma fosfomonidrolase inespecífica capaz de hidrolisar os substratos PNPP (61,2 U/mg), ATP (19,7 U/mg), e o pirofosfato (29,7 U/mg), com K0.5 de 0,06 mM, 0,11 mM e 0,08 mM, respectivamente. A enzima exibi cinética "Michaelina" para o pNPP (n=1,2). Para o ATP e o pirofosfato interações sítio-sítio foram observadas com n=1,6 e 2,3, respectivamente. Os íons de magnésio foram potentes estimuladores (K0.5=2,2 mM), enquanto o arsenato e o fosfato foram potentes inibidores competitivos. A atividade PNPPase foi inibida pelo EDTA, mas não pelo cálcio, levamisol, zinco, cobalto e phidroximercuribenzoato. A entalpia de inativação térmica foi da ordem de 77,5 kcal.mol- 1. Os resultados sugerem que a produção da fosfatase ácida ligada à membrana representa um mecanismo de solubilização do fosfato mineral aumentando a disponibilidade de nutrientes para as plantas / Abstract: The ability of endophytic bacteria in solubilizing inorganic phosphate is of great interest by microbiologists since phosphatases are responsible for catalyzing the hydrolysis of organic compounds producing soluble phosphorus. Thus, the membranebound acid phosphatase (MBAP) was obtained from Enterobacter sp. isolated from Cattleya walkeriana (Orchidaceae) roots and identified by the 16S rRNA gene sequencing analysis. The enzyme expression was demonstrated to be strictly regulated by phosphorus (optimal expression at 7 mM). The enzyme was obtained by centrifugation at 100.000g for 1 h at 4ºC. The apparent optimal pH (3.5) was not affect by p-Nitrophenyl phosphate concentration. At pH 3.5, the enzyme showed a broad substrate specificity hydrolyzing different substrates such as PNPP (61.2 U/mg), ATP (19.7 U/mg), and pyrophosphate (29.7 U/mg), with K0.5 values of 0.06 mM, 0.11 mM and 0.08 mM, respectively. The hydrolysis of PNPP by the enzyme exhibited "Michaelian" kinetics with n= 1.2. For ATP and pyrophosphate site-site interactions were observed with n= 1.6 and 2.3, respectively. Although magnesium ions were stimulatory (K0.5= 2.2 mM), arsenate and phosphate were a powerful competitive inhibitor. The PNPPase activity was inhibited EDTA but not by calcium, levamisole, zinc, cobalt and phydroxymercurybenzoate. The ΔH for thermal inactivation was 77.5 kcal.mol-1. Our results suggest that the production of a membrane-bound acid phosphatase might be one mechanism of mineral phosphate solubilization turn it's nutrients availability to plants / Orientador: João Martins Pizauro Junior / Coorientador: Cecília Maria Costa do Amaral / Banca: Mariana Carina Frigieri / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Mestre

Orientador: João Martins Pizauro Junior / Banca: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Banca: Pietro Ciancaglini / Resumo: Espécies de Burkholderia filogenéticamente distantes do complexo B. cepacia, são versáteis solubilizadores de minerais insolúveis, através da produção de ácidos, viabilizando nutrientes para as plantas. Descrevemos a purificação e caracterização da fosfatase ácida ligada à membrana, produzida pela bactéria do gênero Burkholderia, isolada de solo agrícola em Ponta grossa-PR-BRASIL, e identificada através da análise do 16s rDNA. A expressão da enzima se mostrou estritamente dependente ao fósforo (expressão ótima a 5 mM). A enzima ligada à membrana foi purificada por ultracentrifugação a 100.000g por 1 hora a 4°C e testada com atividade enzimática para p-nitrofenilfosfato (PNFF) e Pirofosfato. O pH ótimo da enzima foi 6 e não foi afetado pela concentração de PNFF. Em pH 6 a hidrolise do PNFF seguiu os seguintes parâmetros cinéticos com n=1.5, Vm= 103.8 U.mg-1 e K0,5=0,06 mM em uma faixa de 0,003 e 10 mM de PNFF. Estudos do pH sobre os parâmetros cinéticos demonstraram 26 pontos de variação na faixa de 3,5 a 6 e em seguida diminui até pH 8 enquanto K0,5 não mostrou variação nesta faixa. O H para hidrólise do PNFF foi de 5,74 kcal.mol-1. A atividade PNFFase foi inibida pelo arsenato e Cálcio, mas não por levamisol, EDTA, zinco e cobalto. A hidrolise do pirofosfato na presença de 2 mM de MgCl2 seguiu os parâmetros cinéticos de "Michaelis-Menten" com Km= 0.142 mM e Vm= 237 U.mg-1.Os resultados sugerem que a produção da fosfatase ácida ligada à membrana pode ser um mecanismo de solubilização de fosfato mineral por essa bactéria. / Abstract: Burkholderia species phylogenetically greatly distant from the B. cepacia complex species are versatile organisms that solubilize insoluble minerals through the production of acids, increasing the availability of nutrients to plants. Here we describe the purification and characterization a membrane-bound acid phosphatase produced by bulkholderia isolated from an agricultural soil in Ponta grossa-PR-BRASIL and identified through analysis of the 16S rDNA gene. The expression of this enzyme was demonstrated to be strictly regulated by phosphorus (optimal expression at 5 mM). The membrane bound enzyme was purified by centrifugation at 100.000g for 1 h at 4ºC and the enzyme was assayed for p-Nitrophenyl phosphatase (PNPPase) and pyrophosphatase activities. The optimal pH (6.0) was not affect by p-Nitrophenyl phosphate concentration. At pH 6.0 the hydrolysis of PNPP following a cooperative kinetics with n= 1.5, Vm= 103.8 U.mg-1 and K0.5= 0.60 mM in the range between 0.003 and 10 mM. Studies of pH effects on kinetics parameters revealed a 26-folds variation in the range of pH 3.5 to 6 following decreases until pH 8.0, wile K0,5 and cooperativity did not varied considerably in this range. The H for hydrolysis of PNPP was 5,74 kcal.mol-1. PNPPase activity was inhibited by arsenate, phosphate and calcium, but not for levamisole, EDTA, zinc, magnesium and cobalt. The hydrolysis of pyrophosphate in presence of 2 mM MgCl2 follows "Michaelis-Menten" kinetics with Km= 0.142 mM and Vm= 237 U.mg-1. Our results suggesting that the production of membranebound acid phosphatase might be one mechanism of mineral phosphate solubilization by this genus of Bacterium. / Mestre