Orientador: João Martins Pizauro Júnior / Banca: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Banca: Pietro Ciancaglini / Resumo: A produção de fosfatase ácida extracelular pelo fungo Penicillium implicatum foi estudada em diferentes concentrações de fosfato no meio de cultivo e na presença e ausência de agitação. A produção de fosfatase ácida extracelular repressível foi cerca de 15 vezes maior em meio agitado e na presença de 50 ìM de KH2PO4 quando comparada ao tratamento controle. A enzima foi purificada 19 vezes em Fenil Sepharose CL-4B, e apresenta uma atividade específica de 27,3U/mg. A enzima é um monômero de massa molecular (Mr) da ordem de 45KDa. O pH ótimo aparente das atividades p-NFFásica e de pirofosfatase é de 5,5. Os íons Zn, Mg, e Co; EDTA, tartarato e iodoacetamida exerceram pouca ou nenhuma influência sobre a atividade da fosfatase ácida de P. implicatum; enquanto que a enzima foi inibida por molibdato e arsenato. A enzima apresenta atividade pirofosfatásica de 297,78U/mg a 4mM de pirofosfato e pH 5,5. A cinética de hidrólise simultânea dos substratos PNFF e PPi mostrou que ambos os substratos ligaram-se ao mesmo sítio. A aplicação da fosfatase na hidrólise de fitato em ração animal sugere uma forma de disponibilizar fosfato para o organismo e também minimizar o impacto ambiental. / Abstract: The extracellular production of acid phosphatase by Penicillium implicatum was studied at different concentrations of phosphate and in the presence and absence of agitation growth medium. The production of extracellular repressible acid phosphatase was about 15-fold highest in agitated medium with 50ì M of KH2PO4 when compared to the control treatment. The enzyme was purified 19-fold on Phenyl Sepharose CL-4B and showed specific activity of 27,3U/mg. The enzyme is a monomer with molecular weight (Mr) of ~ 45KDa. The optimum pH of the p-NPP and pyrophosphate activities was 5,5. The Zn, Mg, Ca, Mn and Co ions, EDTA and tartarate had no effects; but it was inhibitored by arsenate and molybdate. The pyrophosphate activity was 298U/mg at 4mM and pH 5,5. The kinetics data of simultaneous p-NPP and pyrophosphate hydrolysis, showed that both substrates had bound the same active site. The phosphatase application on fitate hydrolysis in animal food suggests a mean to dispose phosphate to the organism and also to minimize the environmental impact. / Mestre

Resumo: A capacidade de bactérias endofíticas em solubilizar fosfato inorgânico é alvo de grande interesse por parte dos microbiologistas, uma vez que as fosfatases são responsáveis por hidrolisar compostos orgânicos produzindo fósforo solúvel. Dessa forma, a fosfatase ácida ligada à membrana (MBAP) foi obtida a partir de Enterobacter sp. isolada de raízes de Cattleya walkeriana (Orchidaceae) e identificada pelo seqüenciamento do gene 16S rRNA. A expressão da enzima mostrou-se estritamente regulada pelo fósforo (expressão ideal em 7 mm). O pH ótimo aparente (3,5) não foi afetado pela concentração de p-nitrofenilfosfato. Em pH 3,5, a enzima é uma fosfomonidrolase inespecífica capaz de hidrolisar os substratos PNPP (61,2 U/mg), ATP (19,7 U/mg), e o pirofosfato (29,7 U/mg), com K0.5 de 0,06 mM, 0,11 mM e 0,08 mM, respectivamente. A enzima exibi cinética "Michaelina" para o pNPP (n=1,2). Para o ATP e o pirofosfato interações sítio-sítio foram observadas com n=1,6 e 2,3, respectivamente. Os íons de magnésio foram potentes estimuladores (K0.5=2,2 mM), enquanto o arsenato e o fosfato foram potentes inibidores competitivos. A atividade PNPPase foi inibida pelo EDTA, mas não pelo cálcio, levamisol, zinco, cobalto e phidroximercuribenzoato. A entalpia de inativação térmica foi da ordem de 77,5 kcal.mol- 1. Os resultados sugerem que a produção da fosfatase ácida ligada à membrana representa um mecanismo de solubilização do fosfato mineral aumentando a disponibilidade de nutrientes para as plantas / Abstract: The ability of endophytic bacteria in solubilizing inorganic phosphate is of great interest by microbiologists since phosphatases are responsible for catalyzing the hydrolysis of organic compounds producing soluble phosphorus. Thus, the membranebound acid phosphatase (MBAP) was obtained from Enterobacter sp. isolated from Cattleya walkeriana (Orchidaceae) roots and identified by the 16S rRNA gene sequencing analysis. The enzyme expression was demonstrated to be strictly regulated by phosphorus (optimal expression at 7 mM). The enzyme was obtained by centrifugation at 100.000g for 1 h at 4ºC. The apparent optimal pH (3.5) was not affect by p-Nitrophenyl phosphate concentration. At pH 3.5, the enzyme showed a broad substrate specificity hydrolyzing different substrates such as PNPP (61.2 U/mg), ATP (19.7 U/mg), and pyrophosphate (29.7 U/mg), with K0.5 values of 0.06 mM, 0.11 mM and 0.08 mM, respectively. The hydrolysis of PNPP by the enzyme exhibited "Michaelian" kinetics with n= 1.2. For ATP and pyrophosphate site-site interactions were observed with n= 1.6 and 2.3, respectively. Although magnesium ions were stimulatory (K0.5= 2.2 mM), arsenate and phosphate were a powerful competitive inhibitor. The PNPPase activity was inhibited EDTA but not by calcium, levamisole, zinc, cobalt and phydroxymercurybenzoate. The ΔH for thermal inactivation was 77.5 kcal.mol-1. Our results suggest that the production of a membrane-bound acid phosphatase might be one mechanism of mineral phosphate solubilization turn it's nutrients availability to plants / Orientador: João Martins Pizauro Junior / Coorientador: Cecília Maria Costa do Amaral / Banca: Mariana Carina Frigieri / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Mestre

Orientador: João Martins Pizauro Junior / Banca: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Banca: Pietro Ciancaglini / Resumo: Espécies de Burkholderia filogenéticamente distantes do complexo B. cepacia, são versáteis solubilizadores de minerais insolúveis, através da produção de ácidos, viabilizando nutrientes para as plantas. Descrevemos a purificação e caracterização da fosfatase ácida ligada à membrana, produzida pela bactéria do gênero Burkholderia, isolada de solo agrícola em Ponta grossa-PR-BRASIL, e identificada através da análise do 16s rDNA. A expressão da enzima se mostrou estritamente dependente ao fósforo (expressão ótima a 5 mM). A enzima ligada à membrana foi purificada por ultracentrifugação a 100.000g por 1 hora a 4°C e testada com atividade enzimática para p-nitrofenilfosfato (PNFF) e Pirofosfato. O pH ótimo da enzima foi 6 e não foi afetado pela concentração de PNFF. Em pH 6 a hidrolise do PNFF seguiu os seguintes parâmetros cinéticos com n=1.5, Vm= 103.8 U.mg-1 e K0,5=0,06 mM em uma faixa de 0,003 e 10 mM de PNFF. Estudos do pH sobre os parâmetros cinéticos demonstraram 26 pontos de variação na faixa de 3,5 a 6 e em seguida diminui até pH 8 enquanto K0,5 não mostrou variação nesta faixa. O H para hidrólise do PNFF foi de 5,74 kcal.mol-1. A atividade PNFFase foi inibida pelo arsenato e Cálcio, mas não por levamisol, EDTA, zinco e cobalto. A hidrolise do pirofosfato na presença de 2 mM de MgCl2 seguiu os parâmetros cinéticos de "Michaelis-Menten" com Km= 0.142 mM e Vm= 237 U.mg-1.Os resultados sugerem que a produção da fosfatase ácida ligada à membrana pode ser um mecanismo de solubilização de fosfato mineral por essa bactéria. / Abstract: Burkholderia species phylogenetically greatly distant from the B. cepacia complex species are versatile organisms that solubilize insoluble minerals through the production of acids, increasing the availability of nutrients to plants. Here we describe the purification and characterization a membrane-bound acid phosphatase produced by bulkholderia isolated from an agricultural soil in Ponta grossa-PR-BRASIL and identified through analysis of the 16S rDNA gene. The expression of this enzyme was demonstrated to be strictly regulated by phosphorus (optimal expression at 5 mM). The membrane bound enzyme was purified by centrifugation at 100.000g for 1 h at 4ºC and the enzyme was assayed for p-Nitrophenyl phosphatase (PNPPase) and pyrophosphatase activities. The optimal pH (6.0) was not affect by p-Nitrophenyl phosphate concentration. At pH 6.0 the hydrolysis of PNPP following a cooperative kinetics with n= 1.5, Vm= 103.8 U.mg-1 and K0.5= 0.60 mM in the range between 0.003 and 10 mM. Studies of pH effects on kinetics parameters revealed a 26-folds variation in the range of pH 3.5 to 6 following decreases until pH 8.0, wile K0,5 and cooperativity did not varied considerably in this range. The H for hydrolysis of PNPP was 5,74 kcal.mol-1. PNPPase activity was inhibited by arsenate, phosphate and calcium, but not for levamisole, EDTA, zinc, magnesium and cobalt. The hydrolysis of pyrophosphate in presence of 2 mM MgCl2 follows "Michaelis-Menten" kinetics with Km= 0.142 mM and Vm= 237 U.mg-1. Our results suggesting that the production of membranebound acid phosphatase might be one mechanism of mineral phosphate solubilization by this genus of Bacterium. / Mestre

Orientador: Ana Cláudia de Melo Stevanato Nakamune / Banca: José Mauro Granjeiro / Banca: Célio Percinoto / Resumo: A saliva é coletada através de métodos simples e não invasivos, além de ser facilmente armazenada. A coleta não-traumática é atrativa especialmente para crianças e quando repetidas coletas são requeridas. A desvantagem da saliva como uma ferramenta de diagnóstico é a variabilidade, que ocorre em decorrência dos fatores fisiológicos e do modo de coleta. Numa primeira etapa o trabalho teve por objetivo estudar as atividades das enzimas fosfatase alcalina (FAlc), fosfatase ácida total (FAT) e fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) na saliva total não estimulada de crianças, investigando as influências de fatores como sexo, faixa etária e horário de coleta, bem como a correlação das enzimas com a taxa de fluxo salivar. Nesta etapa, 120 crianças saudáveis de ambos os sexos, nas faixas etárias de 1-5 e 6-12 anos de idade tiveram as amostras de saliva coletada entre 8:00-10:00 horas ou entre 14:00-16:00 horas. A segunda parte do trabalho teve por objetivo avaliar a correlação das atividades enzimáticas da FAT, TRAP, proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa (PTP-BMr) e FAlc na saliva e no soro de crianças, além de analisar a influência do sexo e da faixa etária na atividade das enzimas, no soro e na saliva total. Para tanto 32 crianças de ambos os sexos, nas faixas etárias de 1-5 anos e 6-12 anos de idade tiveram as amostras de saliva e sangue coletadas entre 8:00-10:00 horas. Os resultados da primeira etapa sugerem que as atividades da FAT, TRAP e FAlc são influenciadas, de formas distintas, pelos fatores sexo, faixa etária e horário de coleta e que não existe correlação entre as atividades das enzimas e a taxa de fluxo salivar. / Abstract: Saliva can be collected by simple, non-invasive methods and is easily stored. The non-traumatic collection is specially appealing for children and when repeated collections are required. The main disadvantage of the saliva as a diagnosis tool is the variability that happens due to the physiologic factors and dependence on mode of the collection. In a first stage the work had for objective to study the activities of the enzymes alkaline phosphatase (ALP), total acid phosphatase (TAP) and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in the whole unstimulated saliva of children, investigating the influences of factors as sex, age group and time of collection, as well as the correlation of the enzymes with the salivary flow rate. In this stage, 120 healthy children of both sexes, in the age groups of 1-5 and 6-12 years of age had the saliva samples collected between 8:00-10:00 hours or between 14:00-16:00 hours. In a second stage, the work had for objective to evaluate the correlation of the enzymatic activities of TAP, TRAP, low molecular weight protein tyrosine phosphatase (LMW-PTP) and ALP in the saliva and in the children's serum, besides analyzing the influence of the sex and of the age group in the activity of the enzymes, in the serum and in the whole unstimulated saliva. For so much 32 children of both sexes, in the 1-5 year-old age groups and 6-12 years of age had the saliva samples and blood collected between 8:00-10:00 hours. The results of the first stage suggest that the activities of TAP, TRAP and ALP are influenced, in different ways, for the factors sex, age group and time of collection and that correlation doesn't exist between the activities of the enzymes and the salivary flow rate. / Mestre

Orientador: Iguatemy Lourenço Brunetti / Banca: Luís Carlos Spolidorio / Banca: Marília Afonso Rabelo Buzalaf / Banca: Maria Teresa Pepato / Banca: Maria Lúcia Rubo de Rezende / Resumo: O tratamento cirúrgico da fissura congênita do processo alveolar superior compreende o enxerto ósseo, um procedimento bem aceito e de grande importância na restauração da forma e da função perdidas. Associado ao enxerto ósseo tem-se utilizado um produto atóxico, não imunoreativo e de fácil obtenção, denominado plasma rico em plaquetas (PRP). Neste estudo foi analisado o comportamento dos marcadores fosfatase alcalina, fosfatase alcalina isoforma óssea, osteocalcina e fosfatase ácida tartarato resistente em 50 pacientes, com idade entre 10 e 20 anos e que foram submetidos à cirurgia de enxerto ósseo autógeno alveolar pelo serviço de Cirurgia Buco-maxilofacial do Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais da Universidade de São Paulo. O objetivo foi acompanhar de forma sistêmica e em curto período a formação ou reabsorção óssea após a realização do enxerto ósseo alveolar, bem como avaliar a eficácia do uso do plasma rico em plaquetas no processo de formação óssea. O estudo concluiu que as propriedades restauradoras do PRP não puderam ser demonstradas por nenhum dos marcadores bioquímicos do metabolismo ósseo nos primeiros 70 dias do ato cirúrgico; a análise temporal dos marcadores de formação óssea testados demonstrou uma tendência de queda com 35 dias e retorno próximo aos níveis basais com 70 dias do ato cirúrgico nos dois grupos estudados; não houve uma correlação significativa dos marcadores com o número de plaquetas e nem com a área da fissura e o resultado do exame ao raio X foi considerado inconclusivo para a presença ou não de trabeculado ósseo organizado em fase inicial de formação. / Abstract: The surgical treatment of the congenital cleft of the upper alveolar process understands the bone graft, a well accepted procedure of great importance in the restoration of the lost form and function. Together with the bone graft it is being used a non-toxic, non imunoreactive and easily obtained product, denominated platelet-rich plasma (PRP). In this study it was analysed the behavior of the alkaline phosphatase, bone alkaline phosphatase, osteocalcin and tartrate-resistant acid phosphatase markers in 50 patients, with age between 10 and 20 years and that were undergone to alveolar autogenous bone graft performed by the Bucomaxillofacial Service of the "Hospital for Rehabilitation of Craniofacial Anomalies, University of São Paulo". The aim was follow in a sistemic and early way the bone formation or reabsorption after the accomplishment of the alveolar bone graft, as well as to evaluate the effectiveness of the use of the platelet-rich plasma in the process of bone formation. The study concluded that the restorative properties of the PRP could not be demonstrated by of the biochemistry markers of the bone metabolism in the first 70 days of the surgery; the temporal analisys of the bone formation markers tested demonstrated a fall tendency in 35 days with return near to basal levels in 70 days in the two studied groups; there was not a significant correlation between markers and the number of platelets and neither with the area of the cleft and the result of the x-ray examination was not considered conclusive for the presence or not of organized bone trabeculae in the initial phase of formation. / Doutor