Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Física, Programa de Pós-Graduação em Física, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-04-04T20:52:53Z No. of bitstreams: 1 2017_GabrielaCunhaPossa.pdf: 83966946 bytes, checksum: a5ad126687641e1f42d318ea576980b5 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-04-11T18:13:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_GabrielaCunhaPossa.pdf: 83966946 bytes, checksum: a5ad126687641e1f42d318ea576980b5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-11T18:13:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_GabrielaCunhaPossa.pdf: 83966946 bytes, checksum: a5ad126687641e1f42d318ea576980b5 (MD5) Previous issue date: 2018-04-11 / Este trabalho consiste no desenvolvimento e uso de um fotobiorreator automatizado para o estudo da dinâmica de crescimento de microalgas. Com ele, os parâmetros físicos e químicos que condicionam o desenvolvimento da cultura podem ser controlados de forma precisa e autônoma a partir de um programa de controle. Como exemplo do uso do dispositivo e das metodologias desenvolvidas, foi feito um estudo detalhado da dinâmica de crescimento da microalga Nannochloropsis oceanica em função da temperatura e do padrão de iluminação. Neste estudo foram feitas medidas relacionadas à taxa de crescimento, a mudanças no espectro de absorção da cultura e de sua interação com gases de interesse. / This work is based on the development and use of an automated photobioreactor for the study of microalgae growth dynamics. With it, the physical and chemical parameters that condition the development of the culture can be controlled in a precise and auto nomous way based on a control software. As an example of the use of the device and the methodologies that were developed, a detailed study of the growth dynamics of the microalgae Nannochloropsis oceanica was carried out as a function of temperature and lighting pattern. In this study, measurements concerning the growth rate, changes in the absorption spectrum of the culture and its interaction with gases of interest were made.

Os sistemas convencionais de tratamento de águas residuárias frequentemente utilizados em países tropicais não eliminam nutrientes, gerando impactos de eutrofização em corpos hídricos. Além disso, há uma crescente discussão quanto à finitude desses nutrientes e os impactos produtivos na geração de seus subprodutos. Nesse sentido, este estudo buscou avaliar o crescimento de Chlorella sorokiniana, a recuperação de nutrientes e a remoção de patógenos em fotobiorreatores tubulares (FBR). O experimento foi conduzido em fotobiorreatores, com caminho óptico de 50 mm, os quais foram alimentados com efluentes de reatores anaeróbios compostos por uma mistura de dejetos suínos e esgoto doméstico, e foi conduzido em quatro etapas. Na etapa inicial, o experimento foi conduzido em escala de bancada sob condições naturais para adaptação das microalgas ao esgoto. Posteriormente, foi feito em condições controladas para avaliação da influência do CO2 e da temperatura no processo (reator de 3 L e vazão de ar 0,2 vvm) nas temperaturas de 32 e 38°C. Depois, foi feita ampliação de escala com regime contínuo e em batelada sob condições naturais (211 L, 0,15 vvm e 2,19 L/h). E, por fim, avaliou-se a separação de algas da fase líquida e a remoção de Giardia spp. e Criptosporidium spp. Como resultados, o experimento obteve: a recuperação de fósforo de 97% e remoção de 91% para nitrogênio; a biomassa atingiu 1,15 g/L como crescimento máximo; o tanino se mostrou como um potencial coagulante para separação sólido-líquido, obtendo eficiência de 95,2% de remoção de turbidez e remoção de patógenos atingiu 2,97 log. No entanto, as altas temperaturas (acima de 45°C) comprometeram o sistema, bem como o acúmulo de nitrito que inibiu as bactérias nitratantes. Observou-se, portanto, que tanto para a temperatura de 38 °C, bem como para de 32°C, o sistema apresentou bom desempenho. Vale ressaltar que não foi necessário controle de pH, e que o crescimento sem adição de CO2 foi mais efetivo. Desse modo a tecnologia se mostrou favorável para tratamento de efluentes com nutrientes. / Conventional wastewater treatment systems often used in tropical countries do not eliminate nutrients, generating impacts of eutrophication on water bodies. In addition, there is a growing discussion about the finiteness of these nutrients and the productive impacts in the generation of their by-products. In this sense, this study sought to evaluate the growth of Chlorella sorokiniana, nutrient recovery and the removal of pathogens in tubular photobioreactors (FBR). The experiment was conducted in tubular photobioreactors with 50 mm optical path, which were fed effluents from anaerobic reactors composed of pig manure and domestic sewage and was conducted in four stages. In the initial stage, the experiment was conducted on bench scale under natural conditions to adapt the microalgae to the sewage. Subsequently, it was done under controlled conditions to evaluate the influence of CO2 and temperature in the process (3 L reactor and 0.2 vvm air flow) at temperatures of 32 and 38°C. Afterwards, continuous and batch scale scaling was carried out under natural conditions (211 L, 0.15 vvm and 2.19 L/h). Finally, the algae separation from the liquid phase and the removal of Giardia spp. and Cryptosporidium spp. were evaluated. As results, the experiment obtained: the recovery of phosphorus of 97% and removal of 91% for nitrogen; The biomass reached 1.15 g/L as maximum growth; The tannin was shown to be a potential coagulant for solid-liquid separation, obtaining 95.2% turbidity removal efficiency and removal of pathogens reaching 2.97 log. However, high temperatures (above 45°C) compromised the system as well as the accumulation of nitrite that inhibited nitrifying bacteria. It was observed, therefore, that the optimum growth temperature was shown at 38°C, and that at 32°C also showed good performance. It is worth noting that Ph-control was not necessary, and growth without CO2 addition was more effective. In this way, the technology proved to be favorable for wastewater treatment with nutrients.

Os sistemas convencionais de tratamento de águas residuárias frequentemente utilizados em países tropicais não eliminam nutrientes, gerando impactos de eutrofização em corpos hídricos. Além disso, há uma crescente discussão quanto à finitude desses nutrientes e os impactos produtivos na geração de seus subprodutos. Nesse sentido, este estudo buscou avaliar o crescimento de Chlorella sorokiniana, a recuperação de nutrientes e a remoção de patógenos em fotobiorreatores tubulares (FBR). O experimento foi conduzido em fotobiorreatores, com caminho óptico de 50 mm, os quais foram alimentados com efluentes de reatores anaeróbios compostos por uma mistura de dejetos suínos e esgoto doméstico, e foi conduzido em quatro etapas. Na etapa inicial, o experimento foi conduzido em escala de bancada sob condições naturais para adaptação das microalgas ao esgoto. Posteriormente, foi feito em condições controladas para avaliação da influência do CO2 e da temperatura no processo (reator de 3 L e vazão de ar 0,2 vvm) nas temperaturas de 32 e 38°C. Depois, foi feita ampliação de escala com regime contínuo e em batelada sob condições naturais (211 L, 0,15 vvm e 2,19 L/h). E, por fim, avaliou-se a separação de algas da fase líquida e a remoção de Giardia spp. e Criptosporidium spp. Como resultados, o experimento obteve: a recuperação de fósforo de 97% e remoção de 91% para nitrogênio; a biomassa atingiu 1,15 g/L como crescimento máximo; o tanino se mostrou como um potencial coagulante para separação sólido-líquido, obtendo eficiência de 95,2% de remoção de turbidez e remoção de patógenos atingiu 2,97 log. No entanto, as altas temperaturas (acima de 45°C) comprometeram o sistema, bem como o acúmulo de nitrito que inibiu as bactérias nitratantes. Observou-se, portanto, que tanto para a temperatura de 38 °C, bem como para de 32°C, o sistema apresentou bom desempenho. Vale ressaltar que não foi necessário controle de pH, e que o crescimento sem adição de CO2 foi mais efetivo. Desse modo a tecnologia se mostrou favorável para tratamento de efluentes com nutrientes. / Conventional wastewater treatment systems often used in tropical countries do not eliminate nutrients, generating impacts of eutrophication on water bodies. In addition, there is a growing discussion about the finiteness of these nutrients and the productive impacts in the generation of their by-products. In this sense, this study sought to evaluate the growth of Chlorella sorokiniana, nutrient recovery and the removal of pathogens in tubular photobioreactors (FBR). The experiment was conducted in tubular photobioreactors with 50 mm optical path, which were fed effluents from anaerobic reactors composed of pig manure and domestic sewage and was conducted in four stages. In the initial stage, the experiment was conducted on bench scale under natural conditions to adapt the microalgae to the sewage. Subsequently, it was done under controlled conditions to evaluate the influence of CO2 and temperature in the process (3 L reactor and 0.2 vvm air flow) at temperatures of 32 and 38°C. Afterwards, continuous and batch scale scaling was carried out under natural conditions (211 L, 0.15 vvm and 2.19 L/h). Finally, the algae separation from the liquid phase and the removal of Giardia spp. and Cryptosporidium spp. were evaluated. As results, the experiment obtained: the recovery of phosphorus of 97% and removal of 91% for nitrogen; The biomass reached 1.15 g/L as maximum growth; The tannin was shown to be a potential coagulant for solid-liquid separation, obtaining 95.2% turbidity removal efficiency and removal of pathogens reaching 2.97 log. However, high temperatures (above 45°C) compromised the system as well as the accumulation of nitrite that inhibited nitrifying bacteria. It was observed, therefore, that the optimum growth temperature was shown at 38°C, and that at 32°C also showed good performance. It is worth noting that Ph-control was not necessary, and growth without CO2 addition was more effective. In this way, the technology proved to be favorable for wastewater treatment with nutrients.

Neste trabalho de mestrado, investigou-se o desempenho de membranas poliméricas de microfiltração para retenção de microalgas (Chlorella sorokiniana) em um fotobiorreator com capacidade volumétrica de 3,5 L, alimentado por um fluxo contínuo de nutrientes com pH 7,0 em condições controladas de temperatura (21°C no meio de cultura e 24°C no meio), borbulhamento de ar e luminosidade (2500 lux, em fotoperíodo de 12/12 horas claro/escuro). Membranas comerciais de tamanho médio de poros 0,8, 1,2, 3,0 e 5,0 μm foram testadas pelo tempo suficiente para esgotamento do limite da permeação da membrana. A concentração das microalgas no fotobiorreator foi analisada através de densidade óptica (espectofotometria) ao número de células (contagem de unidades de células em lâminas do tipo Fuchs Rosenthal - Microscopia Óptica) das amostras de concentrado e permeado. O fenômeno físico de polarização sobre a superfície da membrana está diretamente relacionado ao desempenho da mesma na retenção de microalgas, portanto, fotomicrografias (MEV) da membrana antes e após a microfiltração foram analisadas e comparadas. Para analisar a composição química das microalgas, bem como sua afinidade com as membranas, foram investigadas a composição e a caracterização do fenômeno químico sobre a superfície da membrana, por análise de Energia Dispersiva de Raio-X (EDX). Análises das diferentes fases de crescimento das algas e seus componentes foram feitas em amostras secas a 40°C, através de análise elementar e análises térmicas (TG- Análise Termogravimétrica e DTA- Análise Térmica Diferencial). Os resultados experimentais obtidos neste trabalho permitiram concluir que o uso de membranas de microfiltração em fotobiorreator proporciona a retenção das microalgas, o que contribui para o aumento da concentração da biomassa algal, permitindo a manipulação da sua composição de acordo com as condições pelas quais estes microrganismos são submetidos. / This dissertation investigates the performance of polymeric microfiltration membranes for microalgae retention (Chlorella sorokiniana) in photobioreactor with a volumetric capacity of 3.5 L. The reactor is fed by a continuous flow of nutrients under controlled conditions of pH (7,0) and the temperature (21°C in culture medium and 24°C in the environment), bubbling air and light (2500 lux, with a photoperiod of 12/12 hour light/dark). Commercial membranes of the average pore sizes of 0.8, 1.2, 3.0 and 5.0 μm were tested by depletion of time sufficient to limit the permeation of the membranes. The microalgae concentration in the photobioreactor was analyzed by optical density (spectrophotometry) and number of cells (cell units count on Fuchs Rosenthal type plates-Optical Microscopy). The physical phenomenon of polarization on the surface of the membrane is directly related to its performance in the retention of microalgae therefore micrographs (SEM) of the membrane before and after the microfiltration were compared to identify the chemical affinity between the membranescomposition and the microalgae. The chemical phenomenon on the membrane surface was characterized by Energy Dispersive Analysis of X-ray (EDX). The different phases of the growth of algae and their components were measured in samples dried at 40°C, by elemental analysis and thermal analysis (TG-DTA-Thermogravimetric analysis and differential thermal analysis). The experimental results indicate that the use of microfiltration membranes provides the retention of microalgae, contributing to the increase in the concentration of algal biomass and allowing the manipulation of the composition according to the conditions under which these microrganisms are subjected.

Apesar de ser considerado um combustível sustentável, o etanol, produzido a partir da cana de açúcar, deixa um passivo de grandes proporções durante seu processo produtivo, a vinhaça, que vem sendo depositada nas próprias lavouras de cana de açúcar. É gerada na proporção de 12 litros para cada litro de etanol produzido em média, sendo rica em diversos nutrientes, os quais podem ser aproveitados para diversos fins como, por exemplo, meio de cultivo para microalgas. A presente pesquisa avaliou em uma primeira etapa a clarificação da vinhaça por um processo de coagulação com auxílio de um polímero catiônico, seguida de uma etapa de microfiltração tangencial em filtro de fibras ocas, o que permitiu uma redução superior a 77% para a cor aparente, de 99% para a turbidez e de 20% para a DQO, facilitando a utilização deste efluente para o cultivo de microalgas. Numa segunda etapa, foi avaliado o cultivo da microalga Chlorella vulgaris, em escala de bancada e operação em batelada, em meio preparado a partir da diluição da vinhaça em água de poço profundo, obtendo um aumento na biomassa produzida, determinado em termos de clorofila-a, em concentrações de vinhaça inferiores a 7,5% utilizando inóculo da ordem de 106 indivíduos. Tais dados permitiram a realização de ensaios de cultivo em escala contínua, com fotobiorreatores em escala piloto, gerando assim a biomassa utilizada nas próximas fases do estudo, que avaliaram a separação da biomassa gerada pelo processo de flotação por ar dissolvido. Os ensaios inicialmente realizados em escala de bancada e operados em batelada permitiram identificar as condições ótimas de operação, as quais foram então avaliadas em um flotador operando em fluxo contínuo. Tal flotador permitiu a obtenção de um lodo com teor de sólidos superior a 2%, o qual foi submetido à um processo final de desaguamento por centrifugação. Os ensaios de desaguamento, permitiram verificar que a utilização do mesmo polímero utilizado na etapa de clarificação permite a obtenção de um lodo mais estável, quando comparado com a não utilização de produto químico, na dosagem de polímero catiônico de 6 g.kg-1. A conclusão deste trabalho permitiu verificar a possibilidade de utilização da vinhaça como meio de cultivo de microalgas, reduzindo assim um dos impactos causados pela produção de etanol. Além disso foi possível verificar o potencial da FAD, para o espessamento de biomassa produzido em fotobiorreatores. / Considered a sustainable fuel, ethanol produced from sugar cane, leaves a major liability during its production process, which has been deposited in the own sugar cane fields. The vinasse is generated, on average, in the proportion of 12 liters per liter of produced ethanol, is rich in different nutrients, which can be used for many purposes, such as the microalgae cultivation. This study evaluated in the first step the vinasse clarification by coagulation with cationic polymer, followed by crossflow microfiltration on a hollow fibers filter, which enable a reduction over 77% for apparent color, 99%for turbidity and 20% for COD, facilitating the use of this effluent for microalgae cultivation. In a second step, was evaluated the microalgae Chlorella vulgaris cultivation in bench scale and batch operation, in a medium prepared from the vinasse dilution in water from a deep well, getting an increase in the biomass production, measure in terms of chlorophyll-a, for a vinasse concentration below 7.5%, and an inoculum of approximately 106 individuals. These data allowed the microalgae cultivation in a continuous flow pilot-scale photobioreactor, which produced biomass that was used in the next stages of the study, for the evaluation of the biomass separation by dissolved air flotation. The first DAF tests carried out in bench scale and batch operation allowed to identify the optimum operation conditions, which were then evaluated in a continuous flow pilot scale dissolved air flotation unit (DAF). The DAF unit produced a sludge with a solid content greater than 2%, which was submitted to a final dewatering by centrifuge. The dewatering tests allowed to check that the use of the same polymer used for the clarification step, permit to obtain a more stable sludge when compared with the sludge without chemical add, and in the best cationic polymer dosage of 6 g.kg-1. The conclusion of this work has shown the possibility of use vinasse as a grow medium for microalgae cultivation, reducing one of impacts caused by ethanol production. In addition, it was possible to observe the potential of FAD, for biomass thickening, produced in photobioreactors.

Este trabalho tem como finalidade estudar as melhores condições do cultivo da microalga Chlamydomonas reindhartii geneticamente modificada para a produção da proteína fluorescente mCherry a partir do estudo dos macronutrientes contidos no meio de cultivo. A proteína mCherry possui a vantagem de ser facilmente detectada no meio de cultivo por espectofotometria convencional, convertendo-se, desta forma, em uma molécula interessante para o estudo como modelo de expressão. Inicialmente, foram estudadas três diferentes fontes de nitrogênio para avaliar a expressão da proteína recombinante. Os resultados indicaram que a melhor fonte de nitrogênio para a produção da mCherry foi o NH4NO3. Em seguida, para avaliar os efeitos gerados pelos macronutrientes (acetato, cloreto de cálcio, sultato de magnésio, nitrato de amônio e fostato total) contidos no meio de cultivo TAP, foi realizado um planejamento composto central 25, em cultivos em microplacas, sendo os resultados avaliados por regressão multivariada. Além disso, a análise realizada por regressão multivariada indicou que, dos níveis avaliados das variáveis, as condições que melhor atendem à otimização da produção de mCherry e crescimento celular são: acetato, 33,35 mM; cloreto de cálcio, 0,45 mM; sulfato de magnésio, 0,83 mM; nitrato de amônio, 10,31 mM; fosfato total, 1,96 mM. Essas condições foram escolhidas para cultivo em fotobiorreator tubular, onde foi obtido título de fluorescência de mCherry a 608 nm de 59209 UF, correspondendo a um aumento de 118,5% maior que o título de fluorescência obtido com uso de meio TAP padrão. Com a finalidade de seguir com os processos de produção foi disenhado um biorreator tipo coluna e foi reaizado um estudio de produção em sistema semicontinuo. Os resultados obtidos demostraram que o sistema semicontinuo aumento 2,6 veces a produtividade da biomassa. / This work aims to study the best conditions of the cultivation of the microalgae Chlamydomonas reindhartii genetically modified for the production of the fluorescent protein mCherry from the study of the macronutrients contained in the culture medium. The mCherry protein has the advantage of being easily detected in the culture medium by conventional spectrophotometry, thus becoming an interesting molecule for the study as an expression model. Initially, three different nitrogen sources were studied to evaluate the expression of the recombinant protein. The results indicated that the best source of nitrogen for the production of mCherry was NH4NO3. Then, to evaluate the effects generated by macronutrients (acetate, calcium chloride, magnesium sulphate, ammonium nitrate and total phosphate) contained in the TAP culture medium, a central composite 25 was carried out in cultures on microplates, Results evaluated by multivariate regression. In addition, multivariate regression analysis indicated that, from the evaluated levels of the variables, the conditions that best serve the optimization of mCherry production and cell growth are: acetate, 33.35 mM; Calcium chloride, 0.45 mM; Magnesium sulfate, 0.83 mM; 10.31 mM ammonium nitrate; Total phosphate, 1.96 mM. These conditions were chosen for cultivation in tubular photobioreactor where fluorescence titre of mCherry at 608 nm of 59209 UF was obtained, corresponding to an increase of 118.5% greater than the titer of fluorescence obtained using standard TAP medium. In order to follow the production processes, a column type bioreactor was designed and a production study was carried out in a semicontinuous system. The results showed that the semicontinuous system increased 2.6 times the productivity of the biomass.

O objetivo desta tese foi explorar o sistema de produção de proteínas heterólogas em microalga com ênfase em Chlamydomonas reinhardtii por meio de: (1) desenvolvimento de um fotobiorreator tubular fechado de escala laboratorial, utilizando técnicas de manufatura digital; (2) avaliação de 7 diferentes proteínas fluorescentes (mTagBFP, Cerulean, Emerald, crGFP, cOFP, tdTomato e mCherry), como sistema reporter de secreção de proteínas em microalga; (3) avaliação do fotobiorreator desenvolvido utilizando cultivo de cepas recombinantes; (4) desenvolvimento de novos peptídeos sinais para secreção de proteínas em C. reinhardtii; (5) avaliação da produção de um biofármaco (hialuronidase) em microalgas, por meio da expressão de duas isoenzimas codificadas pelos genes HYA1 e SPAM1 em C. reinhardtii. O fotobiorreator tubular foi avaliado quanto a sua capacidade de resistir ao processo de esterilização por autoclavação e seu desempenho por meio do cultivo de cepa recombinante secretando mCherry. A fluorescência das proteínas fluorescentes foi medida por leitor de placas de fluorescência e visualizada intracelularmente por microscopia confocal de fluorescência. A atividade de hialuronidase foi determinada através de um ensaio enzimático turbidimétrico. O desenvolvimento do fotobiorreator resultou em um sistema fechado resistente a autoclavação, com capacidade de cultivo de cepas recombinantes de C. reinhardtii. Esse fotobiorreator proporcionou uma produtividade máxima de 10 mg/L.d de mCherry da cepa recombinante em sistema fechado, com velocidade específica de crescimento máxima de 1,27 d-1 para a cepa recombinante testada. Todas as proteínas fluorescentes avaliadas apresentaram capacidade de secreção por C. reinhardtii, com diferentes níveis de interferências em sua medição, permitindo a escolha da mCherry como proteína reporter. Entre os peptídeos sinais avaliados (quatro descritos na literatura - BiP, ARS1, CAH1 e IBP1 - e seis preditos), o peptídeo predito \"SP5\" foi o que apresentou maior capacidade de secreção, determinado por níveis de fluorescência no sobrenadante. A avaliação dos peptídeos sinais constatou a necessidade de explorar o desenvolvimento de sistemas de expressão (e.g. vetores de expressão) aliados a análises computacionais, como o SignalP 4.0. Por último, os dados desse estudo mostram que C. reinhardtii transformadas com o vetor de expressão foi capaz de produzir as duas isoformas de hialuronidase em sua forma ativa, evidenciando a capacidade desse sistema para a produção de biofármacos. Portanto, nesta tese o sistema de expressão de proteínas heterólogas baseado em microalgas foi explorado, atingindo os objetivos propostos. O fotobiorreator desenvolvido tem a capacidade de esterilização em escala laboratorial (1) e em cultivo com cepa recombinante propiciou elevada produtividade (3). As proteínas vermelhas fluorescentes apresentaram-se como as proteínas com menores interferências para estudos de secreção em C. reinhardtii (2). Além disso, o peptídeo predito SP5 apresentou o melhor desempenho na secreção de proteínas (4) e o vetor de expressão empregado permitiu a identificação de cepas produtoras de biofármaco hialuronidase (5). Portanto, o sistema de produção de proteínas heterólogas por microalgas é um sistema promissor e poderá permitir, utilizando sistemas de secreção, obter proteínas de alto valor comercial a baixos custos, empregando a secreção e técnicas de cultivo como a fermentação extrativa. / In this thesis, the heterologous protein production in microalgae with emphasis on Chlamydomonas reinhardtii was explored through: (1) development of a laboratory scale closed tubular photobioreactor using digital manufacturing techniques; (2) evaluation of different fluorescent proteins (mTagBFP, Cerulean, Emerald, crGFP, cOFP, tdTomato and mCherry) as a reporter system for protein secretion in microalgae (3) evaluation of photobioreactor developed using recombinant strains culture; (4) development of new signals peptides for protein secretion in C. reinhardtii (5) expression evaluation of a biopharmaceutical (Hyaluronidase) in microalgae, through the expression of two isoenzymes encoded by the HYA1 and SPAM1 genes in C. reinhardtii. The tubular photobioreactor was evaluated for its ability to resist sterilization process by autoclaving and its performance by culturing recombinant strain secreting mCherry. Fluorescence of fluorescent proteins was measured by fluorescence plate reader and observed intracellularly by confocal fluorescence microscopy. The hyaluronidase activity was determined by a turbidimetric enzymatic assay. The development of the photobioreactor resulted in a closed system resistant to autoclaving, capable of culturing recombinant strains of C. reinhardtii. This recombinant strain achieved a maximum productivity of 10 mg/L.day of mcherry in the closed system, with a maximum growth rate of 1.27 d-1 for the recombinant strain tested. All the fluorescent proteins evaluated had C. reinhardtii secretion capacity, with different interference levels in their measurement, allowing the selection of mCherry as a reporter protein. Among the evaluated peptides (four described in the literature - BiP, ARS1, CAH1 and IBP1 - and six predicted), the predicted peptide \"SP5\" was the one that presented greater capacity of secretion, determined by levels of fluorescence in the supernatant. The results of this study point out the need to explore the development of biological systems (i.e., expression vectors) allied to computational analysis. Finally, the data from this study showed that C. reinhardtii could produce the two isoforms of hyaluronidase in its active form, evidencing the capacity of this system to produce biopharmaceuticals. Therefore, in this thesis the heterologous protein expression system based on microalgae was explored, reaching the proposed objectives. The developed photobioreator has sterilization capabilityin laboratorial scale (1) and in culture with recombinant strain had high productivity (3). The red fluorescent proteins was found as the most suitable proteins for studies of secretion in C. reinhardtii with lower interference levels(2). In addition, the predicted SP5 peptide showed the best performance in protein secretion (4) and the expression vector employed allowed the identification of strains producing biopharmaceutical hyaluronidase (5). Therefore, the system of heterologous proteins production by microalgae is promising and will allow, using secretion systems, to obtain proteins of high commercial value at low costs, using secretion and cultivation techniques such as extractive fermentation.

Este trabalho tem como finalidade estudar as melhores condições do cultivo da microalga Chlamydomonas reindhartii geneticamente modificada para a produção da proteína fluorescente mCherry a partir do estudo dos macronutrientes contidos no meio de cultivo. A proteína mCherry possui a vantagem de ser facilmente detectada no meio de cultivo por espectofotometria convencional, convertendo-se, desta forma, em uma molécula interessante para o estudo como modelo de expressão. Inicialmente, foram estudadas três diferentes fontes de nitrogênio para avaliar a expressão da proteína recombinante. Os resultados indicaram que a melhor fonte de nitrogênio para a produção da mCherry foi o NH4NO3. Em seguida, para avaliar os efeitos gerados pelos macronutrientes (acetato, cloreto de cálcio, sultato de magnésio, nitrato de amônio e fostato total) contidos no meio de cultivo TAP, foi realizado um planejamento composto central 25, em cultivos em microplacas, sendo os resultados avaliados por regressão multivariada. Além disso, a análise realizada por regressão multivariada indicou que, dos níveis avaliados das variáveis, as condições que melhor atendem à otimização da produção de mCherry e crescimento celular são: acetato, 33,35 mM; cloreto de cálcio, 0,45 mM; sulfato de magnésio, 0,83 mM; nitrato de amônio, 10,31 mM; fosfato total, 1,96 mM. Essas condições foram escolhidas para cultivo em fotobiorreator tubular, onde foi obtido título de fluorescência de mCherry a 608 nm de 59209 UF, correspondendo a um aumento de 118,5% maior que o título de fluorescência obtido com uso de meio TAP padrão. Com a finalidade de seguir com os processos de produção foi disenhado um biorreator tipo coluna e foi reaizado um estudio de produção em sistema semicontinuo. Os resultados obtidos demostraram que o sistema semicontinuo aumento 2,6 veces a produtividade da biomassa. / This work aims to study the best conditions of the cultivation of the microalgae Chlamydomonas reindhartii genetically modified for the production of the fluorescent protein mCherry from the study of the macronutrients contained in the culture medium. The mCherry protein has the advantage of being easily detected in the culture medium by conventional spectrophotometry, thus becoming an interesting molecule for the study as an expression model. Initially, three different nitrogen sources were studied to evaluate the expression of the recombinant protein. The results indicated that the best source of nitrogen for the production of mCherry was NH4NO3. Then, to evaluate the effects generated by macronutrients (acetate, calcium chloride, magnesium sulphate, ammonium nitrate and total phosphate) contained in the TAP culture medium, a central composite 25 was carried out in cultures on microplates, Results evaluated by multivariate regression. In addition, multivariate regression analysis indicated that, from the evaluated levels of the variables, the conditions that best serve the optimization of mCherry production and cell growth are: acetate, 33.35 mM; Calcium chloride, 0.45 mM; Magnesium sulfate, 0.83 mM; 10.31 mM ammonium nitrate; Total phosphate, 1.96 mM. These conditions were chosen for cultivation in tubular photobioreactor where fluorescence titre of mCherry at 608 nm of 59209 UF was obtained, corresponding to an increase of 118.5% greater than the titer of fluorescence obtained using standard TAP medium. In order to follow the production processes, a column type bioreactor was designed and a production study was carried out in a semicontinuous system. The results showed that the semicontinuous system increased 2.6 times the productivity of the biomass.

O objetivo desta tese foi explorar o sistema de produção de proteínas heterólogas em microalga com ênfase em Chlamydomonas reinhardtii por meio de: (1) desenvolvimento de um fotobiorreator tubular fechado de escala laboratorial, utilizando técnicas de manufatura digital; (2) avaliação de 7 diferentes proteínas fluorescentes (mTagBFP, Cerulean, Emerald, crGFP, cOFP, tdTomato e mCherry), como sistema reporter de secreção de proteínas em microalga; (3) avaliação do fotobiorreator desenvolvido utilizando cultivo de cepas recombinantes; (4) desenvolvimento de novos peptídeos sinais para secreção de proteínas em C. reinhardtii; (5) avaliação da produção de um biofármaco (hialuronidase) em microalgas, por meio da expressão de duas isoenzimas codificadas pelos genes HYA1 e SPAM1 em C. reinhardtii. O fotobiorreator tubular foi avaliado quanto a sua capacidade de resistir ao processo de esterilização por autoclavação e seu desempenho por meio do cultivo de cepa recombinante secretando mCherry. A fluorescência das proteínas fluorescentes foi medida por leitor de placas de fluorescência e visualizada intracelularmente por microscopia confocal de fluorescência. A atividade de hialuronidase foi determinada através de um ensaio enzimático turbidimétrico. O desenvolvimento do fotobiorreator resultou em um sistema fechado resistente a autoclavação, com capacidade de cultivo de cepas recombinantes de C. reinhardtii. Esse fotobiorreator proporcionou uma produtividade máxima de 10 mg/L.d de mCherry da cepa recombinante em sistema fechado, com velocidade específica de crescimento máxima de 1,27 d-1 para a cepa recombinante testada. Todas as proteínas fluorescentes avaliadas apresentaram capacidade de secreção por C. reinhardtii, com diferentes níveis de interferências em sua medição, permitindo a escolha da mCherry como proteína reporter. Entre os peptídeos sinais avaliados (quatro descritos na literatura - BiP, ARS1, CAH1 e IBP1 - e seis preditos), o peptídeo predito \"SP5\" foi o que apresentou maior capacidade de secreção, determinado por níveis de fluorescência no sobrenadante. A avaliação dos peptídeos sinais constatou a necessidade de explorar o desenvolvimento de sistemas de expressão (e.g. vetores de expressão) aliados a análises computacionais, como o SignalP 4.0. Por último, os dados desse estudo mostram que C. reinhardtii transformadas com o vetor de expressão foi capaz de produzir as duas isoformas de hialuronidase em sua forma ativa, evidenciando a capacidade desse sistema para a produção de biofármacos. Portanto, nesta tese o sistema de expressão de proteínas heterólogas baseado em microalgas foi explorado, atingindo os objetivos propostos. O fotobiorreator desenvolvido tem a capacidade de esterilização em escala laboratorial (1) e em cultivo com cepa recombinante propiciou elevada produtividade (3). As proteínas vermelhas fluorescentes apresentaram-se como as proteínas com menores interferências para estudos de secreção em C. reinhardtii (2). Além disso, o peptídeo predito SP5 apresentou o melhor desempenho na secreção de proteínas (4) e o vetor de expressão empregado permitiu a identificação de cepas produtoras de biofármaco hialuronidase (5). Portanto, o sistema de produção de proteínas heterólogas por microalgas é um sistema promissor e poderá permitir, utilizando sistemas de secreção, obter proteínas de alto valor comercial a baixos custos, empregando a secreção e técnicas de cultivo como a fermentação extrativa. / In this thesis, the heterologous protein production in microalgae with emphasis on Chlamydomonas reinhardtii was explored through: (1) development of a laboratory scale closed tubular photobioreactor using digital manufacturing techniques; (2) evaluation of different fluorescent proteins (mTagBFP, Cerulean, Emerald, crGFP, cOFP, tdTomato and mCherry) as a reporter system for protein secretion in microalgae (3) evaluation of photobioreactor developed using recombinant strains culture; (4) development of new signals peptides for protein secretion in C. reinhardtii (5) expression evaluation of a biopharmaceutical (Hyaluronidase) in microalgae, through the expression of two isoenzymes encoded by the HYA1 and SPAM1 genes in C. reinhardtii. The tubular photobioreactor was evaluated for its ability to resist sterilization process by autoclaving and its performance by culturing recombinant strain secreting mCherry. Fluorescence of fluorescent proteins was measured by fluorescence plate reader and observed intracellularly by confocal fluorescence microscopy. The hyaluronidase activity was determined by a turbidimetric enzymatic assay. The development of the photobioreactor resulted in a closed system resistant to autoclaving, capable of culturing recombinant strains of C. reinhardtii. This recombinant strain achieved a maximum productivity of 10 mg/L.day of mcherry in the closed system, with a maximum growth rate of 1.27 d-1 for the recombinant strain tested. All the fluorescent proteins evaluated had C. reinhardtii secretion capacity, with different interference levels in their measurement, allowing the selection of mCherry as a reporter protein. Among the evaluated peptides (four described in the literature - BiP, ARS1, CAH1 and IBP1 - and six predicted), the predicted peptide \"SP5\" was the one that presented greater capacity of secretion, determined by levels of fluorescence in the supernatant. The results of this study point out the need to explore the development of biological systems (i.e., expression vectors) allied to computational analysis. Finally, the data from this study showed that C. reinhardtii could produce the two isoforms of hyaluronidase in its active form, evidencing the capacity of this system to produce biopharmaceuticals. Therefore, in this thesis the heterologous protein expression system based on microalgae was explored, reaching the proposed objectives. The developed photobioreator has sterilization capabilityin laboratorial scale (1) and in culture with recombinant strain had high productivity (3). The red fluorescent proteins was found as the most suitable proteins for studies of secretion in C. reinhardtii with lower interference levels(2). In addition, the predicted SP5 peptide showed the best performance in protein secretion (4) and the expression vector employed allowed the identification of strains producing biopharmaceutical hyaluronidase (5). Therefore, the system of heterologous proteins production by microalgae is promising and will allow, using secretion systems, to obtain proteins of high commercial value at low costs, using secretion and cultivation techniques such as extractive fermentation.

Apesar de ser considerado um combustível sustentável, o etanol, produzido a partir da cana de açúcar, deixa um passivo de grandes proporções durante seu processo produtivo, a vinhaça, que vem sendo depositada nas próprias lavouras de cana de açúcar. É gerada na proporção de 12 litros para cada litro de etanol produzido em média, sendo rica em diversos nutrientes, os quais podem ser aproveitados para diversos fins como, por exemplo, meio de cultivo para microalgas. A presente pesquisa avaliou em uma primeira etapa a clarificação da vinhaça por um processo de coagulação com auxílio de um polímero catiônico, seguida de uma etapa de microfiltração tangencial em filtro de fibras ocas, o que permitiu uma redução superior a 77% para a cor aparente, de 99% para a turbidez e de 20% para a DQO, facilitando a utilização deste efluente para o cultivo de microalgas. Numa segunda etapa, foi avaliado o cultivo da microalga Chlorella vulgaris, em escala de bancada e operação em batelada, em meio preparado a partir da diluição da vinhaça em água de poço profundo, obtendo um aumento na biomassa produzida, determinado em termos de clorofila-a, em concentrações de vinhaça inferiores a 7,5% utilizando inóculo da ordem de 106 indivíduos. Tais dados permitiram a realização de ensaios de cultivo em escala contínua, com fotobiorreatores em escala piloto, gerando assim a biomassa utilizada nas próximas fases do estudo, que avaliaram a separação da biomassa gerada pelo processo de flotação por ar dissolvido. Os ensaios inicialmente realizados em escala de bancada e operados em batelada permitiram identificar as condições ótimas de operação, as quais foram então avaliadas em um flotador operando em fluxo contínuo. Tal flotador permitiu a obtenção de um lodo com teor de sólidos superior a 2%, o qual foi submetido à um processo final de desaguamento por centrifugação. Os ensaios de desaguamento, permitiram verificar que a utilização do mesmo polímero utilizado na etapa de clarificação permite a obtenção de um lodo mais estável, quando comparado com a não utilização de produto químico, na dosagem de polímero catiônico de 6 g.kg-1. A conclusão deste trabalho permitiu verificar a possibilidade de utilização da vinhaça como meio de cultivo de microalgas, reduzindo assim um dos impactos causados pela produção de etanol. Além disso foi possível verificar o potencial da FAD, para o espessamento de biomassa produzido em fotobiorreatores. / Considered a sustainable fuel, ethanol produced from sugar cane, leaves a major liability during its production process, which has been deposited in the own sugar cane fields. The vinasse is generated, on average, in the proportion of 12 liters per liter of produced ethanol, is rich in different nutrients, which can be used for many purposes, such as the microalgae cultivation. This study evaluated in the first step the vinasse clarification by coagulation with cationic polymer, followed by crossflow microfiltration on a hollow fibers filter, which enable a reduction over 77% for apparent color, 99%for turbidity and 20% for COD, facilitating the use of this effluent for microalgae cultivation. In a second step, was evaluated the microalgae Chlorella vulgaris cultivation in bench scale and batch operation, in a medium prepared from the vinasse dilution in water from a deep well, getting an increase in the biomass production, measure in terms of chlorophyll-a, for a vinasse concentration below 7.5%, and an inoculum of approximately 106 individuals. These data allowed the microalgae cultivation in a continuous flow pilot-scale photobioreactor, which produced biomass that was used in the next stages of the study, for the evaluation of the biomass separation by dissolved air flotation. The first DAF tests carried out in bench scale and batch operation allowed to identify the optimum operation conditions, which were then evaluated in a continuous flow pilot scale dissolved air flotation unit (DAF). The DAF unit produced a sludge with a solid content greater than 2%, which was submitted to a final dewatering by centrifuge. The dewatering tests allowed to check that the use of the same polymer used for the clarification step, permit to obtain a more stable sludge when compared with the sludge without chemical add, and in the best cationic polymer dosage of 6 g.kg-1. The conclusion of this work has shown the possibility of use vinasse as a grow medium for microalgae cultivation, reducing one of impacts caused by ethanol production. In addition, it was possible to observe the potential of FAD, for biomass thickening, produced in photobioreactors.