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Caractérisation fonctionnelle de FRABIN : protéine mutée dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 4H

Baudot, Cécile 29 November 2011 (has links)
La maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 4H est une neuropathie héréditaire sensitivo-motrice démyélinisante à transmission récessive. Elle est causée par à des mutations dans le gène FGD4 codant la protéine FRABIN, RhoGEF comportant cinq domaines fonctionnels : un domaine FAB de liaison à l’actine, un domaine DH à activité d’échange GDP/GTP sur les petites RhoGTPases, deux domaines PH et un domaine FYVE impliqués tous trois dans la liaison aux polyphosphoinositides. D’une part, nous avons pu identifier trois nouvelles mutations, portant à dix le nombre de mutations dans FGD4. D’autre part, des études transcriptionnelles ont permis de caractériser huit transcrits alternatifs pouvant coder pour différentes isoformes de FRABIN, dépourvues de différents domaines. Ces résultats suggèrent que FRABIN pourrait être une protéine modulaire. J’ai pu montrer que, dans les fibroblastes des patients, la protéine FRABIN était absente. Dans les lymphoblastes, nous supposons que l’isoforme FRABIN présente est dépourvue du domaine de liaison à l’actine, mais nous n’avons pas pu analyser l’effet des mutations sur la production de la protéine. Dans les fibroblastes et les lignées lymphoblastoïdes des patients, j’ai pu mettre en évidence une diminution drastique de l’activation des RhoGTPases CDC42 et RAC1. Cependant, cette diminution n’a pas pu être corrélée avec des anomalies du cytosquelette ou de la migration des fibroblastes des patients. Toutefois, ces RhoGTPases sont primordiales pour la myélinisation, il est donc fort possible que dans les cellules du système nerveux périphérique, la perte de FRABIN résultant en une diminution de plus de 50% de l’activation des RhoGTPases entraîne des défauts majeurs dans le processus de « radial sorting ». L’arrivée des souris KO conditionnelles pour fgd4 dans les cellules de Schwann ou dans les motoneurones, devrait nous permettre de valider ou d’infirmer plusieurs hypothèses qui ont été émises durant ce travail et ainsi de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie. / CMT4H is an autosomal recessive demyelinating CMT due to mutations in FGD4, which encodes FRABIN. FRABIN has five functional domains: a F-actin binding domain, a RhoGEF domain with GDP/GTP exchange activity, two PH and one FYVE domains which interact with polyphosphoinositides. In this study, we identified three novel FGD4 mutations, bringing to ten the number of mutations in this gene. Moreover, I characterized eight alternative transcripts, and all of them could lead to a functional FRABIN isoform, deprived of one or more functional domains. This led us to consider FRABIN as a modular protein. In patient’s fibroblasts, I have been able to show that FRABIN is degraded. Unlike in patient’s lymphoblastoïd cells line where we were unable to characterize the mutation effect on the protein. In these cells, we proposed that FRABIN is present without the F actin binding domain. Nevertheless, in patient’s fibroblasts and lymphoblastoïde cells line, I showed a major diminution of the CDC42 and RAC1 active forms, which is not in correlation with the absence of abnormalities in cytoskeleton and migration of patient‘s fibroblasts. We suggested that, in peripheral nerve system cells, the diminution of these RhoGTPases activation is damaging for the myelination. We are waiting for two fgd4 conditional KO mice model (one in Schwann cells and one in neuron). Exploration of these models will allow us to explain the physiopathological mechanism of CMT4H.
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Etude des mécanismes physiopathologiques des neuropathies périphériques dues à des mutations dans FRABIN (CMT4H) et VRK1 / Functional explorations in FRABIN (CMT4H) and VRK1-related inherited peripheral neuropathies

El Bazzal, Lara 07 December 2018 (has links)
Les Neuropathies Périphériques Héréditaires (IPN) constituent l’une des causes les plus fréquentes de maladies neurologiques héréditaires. Parmi elles, la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT), constitue le groupe plus large. Durant ma thèse, j’ai étudié les bases physiopathologiques de deux formes d’IPN.1)J’ai étudié CMT4H, une forme rare de CMT démyélinisante, à transmission autosomique récessive, due à des mutations dans FGD4, qui code la protéine FRABIN. J’ai ainsi validé trois partenaires de FRABIN impliqués dans la voie du trafic vésiculaire. J’ai mis au point un modèle de myélinisation in vitro, à partir de notre modèle murin de CMT4H qui m’a permis de mettre en évidence une implication de FRABIN dans le processus d’endocytose et une dérégulation de la voie NRG1/PI3K/AKT. Dans une perspective thérapeutique, j’ai pu corriger ces défauts en ciblant la voie NRG1typeIII, par la niacine, un médicament approuvé par la FDA connu pour inhiber la myélinisation.2)Par séquençage de l’exome entier dans une famille d’origine libanaise présentant deux patients atteints d’une forme motrice d’IPN, associée à une atteinte centrale, nous avons identifié deux nouvelles mutations hétérozygotes composites dans le gène VRK1 qui code une protéine kinase nucléaire qui phosphoryle plusieurs facteurs de transcription. Des mutations dans VRK1 ont été décrites dans plusieurs maladies neurologiques, affectant les motoneurones. Des études fonctionnelles dans des lignées cellulaires issues de patients ont montré la pathogénicité de ces mutations et j’ai pu mettre en évidence pour la première fois, l’implication de la machinerie de transcription et d’épissage dans une pathologie associée à VRK1. / Inherited Peripheral Neuropathies (IPNs) are one of the most common causes of inherited neurological diseases. Among them, Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) or Hereditary Motor and Sensory Neuropathy (HMSN), forms the largest group. During my thesis, I have studied the pathophysiological bases of two forms of IPNs.1) CMT4H, a rare form of autosomal recessive (AR) demyelinating CMT, due to mutations in FGD4 encoding FRABIN. First, I validated three partners of FRABIN involved in the vesicular trafficking pathway. I have also set up an in vitro myelination model based on the co-culture of DRG (Dorsal Root Ganglion) sensory neurons and Schwann cells (SCs) from our CMT4H mouse model. Studying this model allowed me to detect an upregulation of the NRG1 type III/PI3K/AKT pathway, which positively regulates myelination; and signs of impaired endocytosis, which presumably lead to the observed anomalies. I was able to correct these defects by targeting the NRG1 type III pathway with niacin, a FDA approved drug, known to downregulate NRG1-III signaling. 2) We have identified, by Whole Exome Sequencing two new compound heterozygous mutations in VRK1, in two siblings from a Lebanese family affected with distal Hereditary Motor Neuropathy associated with upper motor neurons signs. VRK1 is a nuclear kinase described to phosphorylate many transcription factors and for which mutations have been described in several motor neurons diseases. Functional studies on patients’ cells allowed me to demonstrate the pathogenicity of mutations and we brought evidence, for the first, about the implication of transcriptional machinery in a pathology associated to VRK1.
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Génétique et physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 4H / Genetics and physiopathology of CMT4H

Esteve, Clothilde 18 December 2014 (has links)
CMT4H est une forme de CMT démyélinisant, à transmission autosomique récessive, pour laquelle notre équipe a identifié le gène responsable. Il s'agit du gène FGD4, codant pour FRABIN, protéine de 766 AA possédant 5 domaines fonctionnels: le domaine FAB de liaison à l'actine, un domaine DH responsable de l'échange GDP/GTP, et trois domaines de liaison avec des polyphosphoinositides. C'est une RhoGEF, connue pour activer les RhoGTPases Cdc42 et Rac1.Mon projet de thèse vise à mieux comprendre les bases moléculaires et les mécanismes physiopatologiques qui sous-tendent CMT4H grace à l'étudie de modèles cellulaires et murins. Dans un premier temps, j'ai identifié deux nouvelles mutations dans le gène FGD4. J'ai pu démontrer l'impact fonctionnel des mutations p.Met298fs*8 et p.Ala172Glyfs*27 et une absence totale la protéine dans les fibroblastes de ces patients, donnant lieu à une augmentation de l'activation de Cdc42.L'étude d'un modèle murin d'ablation conditionnelle de FGD4 dans les cellules de Schwann, m'a permis de démontrer la présence d' anomalies myéliniques dans le nerf périphérique de ces souris, ainsi qu'une diminution de l'activation de Cdc42.J'ai également montré, que dans les fibroblastes, FRABIN était localisée au niveau des endomembranes et que l'endocytose semblait déficient dans des cellules de patients. Finalement, l'identification de SNX3,comme partenaire protéique de FRABIN constitue un argument supplémentaire fort en faveur du rôle de FRABIN dans le trafic membranaire.La poursuite de l'étude de nos modèles et de modèles iPS ,permettra de poursuivre l'exploration de ces mécanismes et de mieux comprendre la physiopathologie de la forme CMT4H. / Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 4H (CMT4H) is an inherited, autosomal recessive, peripheral neuropathy characterized by demyelination of sensory-motor nerves and due to mutations in FGD4. FGD4 encodes FRABIN, a GDP/GTP nucleotide exchange factor (GEF), specific for the GTPase Cdc42, composed of five functional domains: an N-terminal F-actin binding (FAB) domain, one Dbl homology (DH) domain, two pleckstrin homology (PH) domains, and one cysteine-rich FYVE domain.The main goal of my project is to understand the mechanisms leading to the pathology in CMT4H. To this purpose, I studied both cellular and mouse models.First, molecular screening of FGD4 allowed us to identify two additional mutations in FGD4. We also demonstrated a complete absence of the 105 kDa FRABIN isoform in patients homozygous for splicing and frameshift mutations, which unexpectedly was related to abnormally high levels of Cdc42 activation.The study of a mouse model with conditional ablation of fgd4 in Schwann cells, that we have generated, demonstrates the presence of abnormal myelin outfoldings in sciatic nerves from KO mice, which might be linked to decreased levels of Cd42 in mouse sciatic nerves. Finally, altered recycling of transferrin receptors in patients, with complete absence of FRABIN described above, as well as the identification of SNX3, a protein involved in endosomal trafficking, as a partner for FRABIN are new elements that I provide in favour of a role for FRABIN in membrane and cellular trafficking.Still, there are many points to understand, notably the relation between the RhoGTPase and the endosomal pathways, and the study of our models will help answer these questions.

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