Made available in DSpace on 2016-03-01T13:55:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 raquel_souza_ioc_mest_2015.pdf: 4865061 bytes, checksum: 9a40ccd1742323bfd705d91b20d8f29a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Leishmania (Leishmania) amazonensis apresenta mecanismos de adaptação guiados por suas proteinases. Neste contexto, destacam-se as cisteína proteinases (CPs) onde a cisteína proteinase B (CPB) é a CP mais estudada dentre as CPs deste parasito. O foco deste trabalho é a região COOH-terminal da CPB (cyspep), gerada a partir do processamento final desta proteinase. O estudo foi conduzido em cinco fases: obtenção da cyspep recombinante (rcyspep); avaliação da antigenicidade da rcyspep em camundongos experimentalmente infectados com L.(L.) amazonensis; diferenciação in vitro dos promastigotas em amastigotas; avaliação da expressão do gene cpb ao longo da diferenciação do parasito; e detecção da cyspep nas formas promastigotas e amastigotas do parasito. O polipeptídeo rcyspep, de 14 kDa, foi obtida em sistema pET28-a e purificado para posterior produção de anticorpos policlonais específicos em camundongos. Observou-se que, durante a infecção em camundongos, há uma resposta imune humoral contra o rcyspep, caracterizada por um aumento da detecção de anti-cyspep quando comparado com animais de controle (p <0,05). Nos ensaios de diferenciação constatamos três padrões morfológicos ao logo de 96 horas de análise, em uma cinética temporal: formas alongadas com flagelo livre, arredondados com flagelo e arredondadas sem flagelo por microscopia. Adicionalmente a cultura foi analisada por citometria de fluxo demonstrando uma migração gradual da população da região R1 para região R2 do dotplot indicando uma diminuição no tamanho e aumento da granulosidade celular. Observamos que ao longo desta diferenciação ocorre um aumento da quantidade de transcritos do gene cpb, nos tempos de 48 horas (1,3 ×), 72 horas (3,2 ×) e 96 horas (3,4 ×) nas preparações de cDNA dos parasitos, quando comparada com os resultados de quantificação realizados com preparações de cDNA dos promastigotas Na continuidade deste trabalho, o anti-rcyspep foi utilizado como ferramenta nos estudos de detecção da proteína em preparações de promastigotas e amastigotas obtidas por fracionamento subcelular e no sobrenadante de cultivo por ensaios de ressonância plasmônica de superfície. Os sensorgramas obtidos nestes ensaios revelaram valores de RU de dissociação, indicativos do reconhecimento do anti-rcyspep em todas as preparações do parasito. Constatamos que as proteínas das preparações de membrana e flagelo de ambas as formas têm menor propriedade de ligar a IgG anti-rcyspep. Dentre estas, as preparações de proteína de membrana de amastigota apresentaram os menores valores de Ksat. Por outro lado, os sobrenadantes de cultivo dos promastigotas e amastigotas apresentaram menores quantidades de proteínas reagentes a IgG anti-rcyspep. Adicionalmente, constatamos que as proteínas do parasito reconhecidas pela IgG anti-rcyspep que ligam ao E-64 foram melhor detectadas nas preparações de sobrenadante de cultura de promastigotas (1,4 x 10-2 ng/mm2). O conjunto dos resultados deste trabalho indica que amastigotas de L. (L.) amazonensis apresentam maior expressão de gene cpb do que promastigota e que ambas as formas lançam o polipeptídio cyspep para o meio extracelular, porém apenas os promastigotas lançam este polipeptídio ainda associada à enzima CPB / Leishmania (Leishmania) amazonensis presents adaptive me chanisms guided by their proteinases. In this context, we highlight the cysteine proteinases (CPs) where the cysteine proteinase B (CPB) is the most studied CP among these parasites. The focus of this work is the COOH - terminal region of CPB (cyspep), gener ated during the final processing stage of this proteinase. Our study comprises five main phases: obtaining of a recombinant cyspep polypeptide (rcyspep); evaluation of the antigenicity of rcyspep in mice experimentally infected with L. (L.) amazonensis ; in vitro differentiation of promastigotes into amastigotes; evaluation of cpb gene expression throughout morphological differentiation of the parasite; and detection of cyspep in promastigotes and amastigotes of L. (L.) amazonensis. The rcyspep polypeptide, with 14 kDa, was obtained using a pET28 - a system and, subsequently, specific polyclonal antibodies were produced by inoculation in mice. We observed that, during mice infection, there is a humoral immune response against rcyspep, characterized by an increa se in detection of anti - cyspep when compared to control animals (p<0.05). During differentiation assays three morphological patterns could be observed over 96 hours of observation: elongated shapes with free flagellum, rounded shapes with free flagellum an d rounded shapes without visible flagellum. The data point to a gradual migration of the population of parasites from region R1 to r egion R2 into the dotplot indicating a decrease in size and increase in cell granularity. We observed that alongside the mor phological differentiation there is an increase in the amount of cpb gene transcripts, in time of 48 hours (1.3 ×), 72 hours (3.2 ×) and 96 hours (× 3.4), compared with quantitation results obtained with cDNA of promastigotes. Purified anti - rcyspep IgGs we re lately used as a tool to detect cyspep in subcellular fractions and culture supernatants of promastigote and amastigote by surface plasmon resonance assays. The sensorgram obtained from these assays indicate RU dissociation values that detect the recogn ition of anti - parasite rcyspep in all preparations. We noticed that membrane and flagellum protein extracts of both parasite forms present lower capacity to interact with anti - rcyspep IgG. The interaction coefficients of each sample with anti - rcyspep IgG w ere analyzed and we could observe that amastigote membrane protein preparations have lower Ksat values. Comparatively, the culture supernatants of amastigotes and promastigotes exhibited lower p roportions of rcyspep anti - IgG - binding proteins. Additionally, we found that parasite proteins were recognized by anti - IgG rcyspep that bind to E - 64 were best detected in promastigote culture supernatant preparations, 1.4 x 10 - 2 ng/mm2 on the chip. Collectively the results indicate that amastigotes of L. (L.) amazone nsis exhibit hi gher expression of cpb gene that promastigote and that both forms releases the polypeptide cyspep to the extracellular environment, but only promastigotes releases that polypeptide still associated with CPB enzyme

Orientador: Jose Antonio Rocha Gontijo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T10:17:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grigoletti_GabrielBoerLima_M.pdf: 3195983 bytes, checksum: 162e3819e6b1b271cfcaa92020a90fa4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O estresse gestacional afeta diversas regiões neurais incluindo hipocampo, amígdala, corpo caloso, neocortéx, cerebelo e hipotálamo e frequentemente resulta em redução no volume dos tecidos que compõem estas estruturas. A formação hipocampal tem sido alvo de diversos estudos devido a sua importância na plasticidade neural, na neurogênese e na regulação de processos cognitivos. Dessa forma, este estudo buscou avaliar os efeitos da restrição proteica, durante a gestação e amamentação, sobre a estrutura do hipocampo e o comportamento relacionado à memória e emoções (ansiedade/medo) bem como sobre a composição celular desta estrutura cerebral e, a influência sobre estes parâmetros morfológicos e comportamentais, da exposição da prole de ratos machos ao ambiente enriquecido. Os achados deste estudo representam o impacto pré e perinatal da desnutrição proteica correspondente à situação de estresse nutricional, no hipocampo que está envolvido no comportamento emocional bem como na memória e no aprendizado. O estudo revelou dissociação entre a resposta do teste comportamental e alterações no número de neurônios hipocampais, como consequência da programação fetal. A ausência de alterações basais no desempenho destes testes, ocorreram a despeito de redução no número de neurônios no giro denteado do hipocampo. Vários autores têm sugerido que a atrofia observada no hipocampo pode ser uma resposta compensatória para proteger o hipocampo de danos adicionais. Nós demonstramos, pela primeira vez, que a exposição materna a restrição proteica durante o desenvolvimento neural da prole causa importantes mudanças morfológicas no hipocampo podendo tornar estes animais vulneráveis a distúrbios neurais na idade adulta. O presente estudo pelo menos sob aspecto morfológico ponderal confirma a teoria do "cérebro egoísta", um paradigma recente que postula que, para manter estável seu próprio fornecimento de energia, o cérebro modula o metabolismo da energia na periferia regulando tanto a alocação quanto a ingestão de nutrientes. Neste trabalho, a ausência de alterações ponderais encefálicas não está associada às intensas modificações na composição citológica, particularmente hipocampal, nos diferentes grupos experimentais. Embora pareça que as alterações nutricionais promovam alterações irreversíveis ponderais na massa corporal, mas não no encéfalo e algumas de suas estruturas fundamentais, a composição e estrutura neuronal e sua recuperação a partir de células primordiais, são profundamente modificadas pela restrição dietética materna e, surpreendentemente, pela exposição ao ambiente enriquecido. Assim, podemos afirmar que a teoria do cérebro egoísta explica a manutenção da massa encefálica entretanto, a proporção dos diferentes tipos celulares é profundamente alterada o que pode expandir nosso entendimento sobre a adaptação ao estresse e a neuro-regeneração em estados neuro-comportamentais tidos como anormais. Além disso, devemos ressaltar que, embora tenhamos observado redução significativa no número de neurônios após o período de amamentação, demonstramos pela primeira vez que este parâmetro é revertido pelo estimulo em ambiente enriquecido / Abstract: he stress affects neural regions including gestational hippocampus, amygdala, corpus callosum, neocortex, cerebellum and hypothalamus and often results in a reduction in the volume of the tissues that make up these structures. The hippocampal gyrus training has been the subject of several studies due to its importance in neural plasticity in neurogenesis and regulation of cognitive processes. Thus, this study sought to assess the effects of protein restriction, during pregnancy and breastfeeding, on the structure of hippocampus, their duties on the memory and emotions (anxiety/fear) as well as on the cellular composition of this brain structure and influence over these morphological and behavioral parameters, the exposure of the offspring of male rats to the enriched environment. The findings of this study represent the pre and perinatal impact of malnutrition protein corresponding to situation of nutritional stress in the hippocampus, which is involved in emotional behavior as well as in memory and learning. The study revealed decoupling the behavioral test response and changes in the number of hipocampais neurons, as a consequence of fetal programming. The absence of basal changes in performance of these tests, occurred in spite of reduction in the number of neurons in the dentate gyrus of the hippocampus. Several authors have suggested that the observed atrophy in the hippocampus may be a compensatory response to protect the hippocampus of additional damage. We have demonstrated, for the first time, that maternal exposure to protein restriction during neural development of offspring cause important morphological changes in hippocampus may make these animals vulnerable to neural disorders in adulthood. The present study at least under morphological aspect by confirming the "selfish brain" theory, a recent paradigm that posits that in order to keep stable its own energy supply, the brain modulates the energy metabolism in the periphery by regulating both the allocation as the intake of nutrients. In this work, the unmodified brain mass, do not match with the intensity of cytological composition changes, particularly of the hippocampal nucleus, in different experimental groups. Although it seems that the nutritional changes promote irreversible changes in body mass, but not in the brain and some of its fundamental structures, composition and neuronal structure and its recovery from primordial cells, are deeply modified by the maternal dietary restriction and, surprisingly, by exposure to oxygen-enriched environment. Thus, we can affirm that the selfish brain theory explains the maintenance of brain matter however, the proportion of the different cell types is profoundly changed what can expand our understanding of the adaptation to stress and neuro-regeneration in neuro-behavioral States regarded as abnormal. Moreover, we must emphasize that, while we have observed a significant reduction in the number of neurons after the period of breastfeeding, we demonstrate for the first time this parameter is reversed by stimulus in enriched / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestre em Ciências