Orientador : Paulo Arruda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:25:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nogueira_FabioTebaldiSilveira_D.pdf: 10338280 bytes, checksum: 37792b86af8630dc08c3fdb7b9c7918d (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Estresses ambientais representam um dos principais fatores limitantes para a produtividade agrícola. Sendo assim, fazem-se importantes estudos que têm por objetivo analisar ao nível molecular os efeitos causados por esses estresses. Neste trabalho, analisamos o perfil de expressão gênica em plântulas de cana-de-açúcar submetidas a baixas temperaturas. Inicialmente, membranas de alta densidade (DNA macroarrays) contendo 1536 ESTs (Etiquetas de Seqüências Expressas) do projeto SUCEST (Sugarcane EST Project) foram hibridadas com sondas de cDNAs obtidas a partir de RNA total de tecido foliar de plântulas de cana-de-açúcar crescidas in vitro e submetidas a 4 oC por 3, 6, 12, 24 e 48 h. Como controle, foram utilizadas plântulas in vitro crescidas a 26 oC. O experimento foi repetido duas vezes, utilizando-se RNA total de novas plântulas tratadas e controle. Somente ESTs que apresentaram padrão de indução ou repressão semelhantes nos dois experimentos foram considerados para posterior análise. Desta forma, os resultados permitiram a identificação de 59 ESTs que foram induzidos ou reprimidos pelo estresse abiótico, dentre os quais alguns ESTs sem homólogos no GenBank. Alguns genes selecionados tiveram seu perfil de expressão confirmado por RNA-blot. Utilizando o banco de dados do SUCEST e seqüências de proteínas oriundas do NCBI, foi gerado um banco de dados contendo 33 proteínas de cana-de-açúcar relacionadas ao frio. Dentre essas proteínas foi identificada proteína similar a PUMP (Plant Uncoupling Mitochondrial Protein), a qual está envolvida em mecanismos de redução da produção de espécies reativas de oxigênio durante estresses abióticos. Posteriormente, quatro outras proteínas pertencentes à família PUMP foram identificadas no banco de dados do SUCEST, além de quatro proteínas pertencentes à família AOx (alternative oxidase). Análises filogenéticas corroboraram a hipótese da existência de novos membros de ambas as famílias de proteínas em cana-de-açúcar (Saccharum sp. PUMPs e AOxs, ou seja, SsPUMPs e SsAOxs, respectivamente) e em Arabidopsis (AtPUMPs e AtAOxs). Análise do perfil de expressão desses genes sugere que PUMPs e AOxs são expressos em órgãos diferentes em cana-de-açúcar e em Arabidopsis. Adicionalmente, resultados de RNA-blot sugeriram que dois membros da família de PUMPs (SsPUMP4 e SsPUMP5) e um membro da família AOx (SsAOx1c) foram induzidos por baixa temperatura (4 oC), enquanto que, em Arabidopsis, dois membros da família PUMP (AtPUMP4 e AtPUMP5) e um membro da família AOx (AtAOx1a) foram também induzidos pelo estresse abiótico, entretanto, com perfis diferentes. Interessantemente, o gene AtAOx1d foi reprimido após exposição das plantas a baixas temperaturas. Análises in silico demonstraram a existência de 26 membros da superfamília de proteínas NAC em cana-de-açúcar, incluindo um gene identificado em estudos de expressão gênica, denominado SsNAC23 (Saccharum sp. NAC23). Este gene foi completamente seqüenciado e posteriormente analisado. Resultados de RNA-blot sugerem que o gene SsNAC23 é regulado por baixa temperatura (4 oC), mas não por 12 °C, além de herbivoria (Diatraea saccharalis) e estresse hídrico (Polietilenoglicol, PEG 6000, 20%). Ensaios de localização subcelular demonstraram que a proteína SsNAC23 localizou-se preferencialmente no núcleo de células epidérmicas de cebola (Allium cepa). A construção de um modelo molecular do domínio NAC da proteína SsNAC23 permitiu a análise de determinantes estruturais possivelmente envolvidos em ligação a DNA, sugerindo seu papel como fator de transcrição. Alinhamento desses determinantes de outras proteínas contendo domínio NAC revelou alta conservação de importantes aminoácidos envolvidos no contato entre proteína e molécula de DNA. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a proteína SsNAC23 é um fator de transcrição envolvido em mecanismos de resposta a estresses bióticos e abióticos / Abstract: Environmental stresses represent one of the main factors limiting crop productivity, being very important studies that aim to analyze, at a molecular level, the effects caused by these stresses. In the present project, we analyzed the sugarcane gene expression profiles in response to low temperature. Initially, high-density filter arrays containing 1536 ESTs (Expressed Sequence Tags) from SUCEST (Sugarcane EST Project) were hybridized with P33-labeled cDNA probes obtained from total RNA of sugarcane plantlets growing at 4 oC during 3, 6, 12, 24, and 48 h. As a control, plantlets growing at 26 oC were utilized. The experiment was repeated twice, being total RNA extracted from novel cold-treated and untreated plantlet sets. Only those ESTs, which presented similar expression profiles in both experiments, were taken into consideration for a further analysis. The results allowed identifying 59 ESTs that were induced or repressed by chilling stress. Selected genes had their expression profiles confirmed by RNA-blot analysis. Using SUCEST database and protein sequences from NCBI, a database containing 33 sugarcane proteins related to cold temperatures was generated. Among those proteins, we identified a PUMP (Plant Uncoupling Mitochondrial Protein) gene family member. This protein was reported to be involved in oxidative stress responses. Further, in SUCEST database, four additional proteins belonging to PUMP and four proteins belonging to AOx family (alternative oxidase) were identified. Phylogenetic analyses confirmed the existence of novel members of both protein families in sugarcane (Saccharum sp. PUMPs and AOxs: SsPUMPs and SsAOxs) and Arabidopsis (AtPUMPs and AtAOxs). Gene expression profile analyses suggested that PUMPs and AOxs are expressed in different plant organs. RNAblot results suggested that two members of sugarcane PUMP gene family (SsPUMP4 and SsPUMP5) and one member of AOx family (SsAOx1c) were induced by low temperature (4 oC). Arabidopsis PUMP4 and PUMP5 orthologs and one member of AOx family (AtAOx1a) were also induced by cold stress. Interestingly, AtAOx1d was down-regulated after plantlets were exposed In silico analyses demonstrated the existence of 26 members of sugarcane NAC domain protein family, including the cold-inducible SsNAC23 (Saccharum sp. NAC23). This gene was completely sequenced and analyzed. RNA-blot results suggested that SsNAC23 is modulated by extreme low temperatures (4 oC), but not at moderate ones (12 oC). SsNAC23 transcripts also accumulated in response to herbivory (Diatraea saccharalis) and PEG-induced water stress. Nuclear localization essays demonstrated that SsNAC23 was targeted to nucleus of onion cells (Allium cepa). A molecular model of the NAC domain of SsNAC23 allowed analyzing the structural determinants putatively involved in DNA-binding, evidencing the SsNAC23 transcriptional activator nature. Alignment of other NAC domain proteins revealed high structural determinants conservation in different plant species. In summary, our results indicated that the SsNAC23 is a transcription factor involved in biotic and abiotic stress response / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

CAPES / Os pêssegos e nectarinas são muito apreciados pelos consumidores, mas são frutos climatéricos, tendo disponibilidade no mercado curto espaço de tempo. Dessa forma, é necessário investir na obtenção de genótipos com frutos de qualidade e menor perecibilidade ou que apresentem menos distúrbios fisiológicos após armazenamento. Assim, os objetivos deste trabalho foram i) avaliar a divergência genética entre 40 acessos de pessegueiros e nectarineiras com base na qualidade pós-colheita, selecionando-se possíveis genitores; ii) verificar a susceptibilidade a danos por frio em pêssegos e nectarinas após armazenamento refrigerado; iii) avaliar divergência de pêssegos e nectarinas com base na susceptibilidade aos danos por frio e selecionar acessos superiores; iv) realizar estudo das correlações entre qualidade e susceptibilidade a danos por frio de pêssegos e nectarinas; v) selecionar genitores com a combinação de menor susceptibilidade aos danos por frio após armazenamento e maior qualidade dos frutos. O estudo foi conduzido na EEAD-CSIC, Zaragoza-Espanha, durante o ciclo produtivo 2013/2014. Um total de 40 acessos de pêssegos e nectarinas da coleção de germoplasma foram avaliados. Características de qualidade como, firmeza de polpa, teor de sólidos solúveis totais, acidez titulável, pH, índice de maturação e parâmetros de coloração do mesocarpo foram determinadas. Os frutos foram submetidos ao armazenamento refrigerado de 0º e 5ºC, com umidade relativa média de 95%. Após 14 e 28 dias foram avaliados os sintomas de lanosidade através da presença de polpa farinhenta, granulosa, coriácea, alterações de cor na polpa, como escurecimento e avermelhamento interno e, ausência de sabor. Como critério de seleção adotou-se 20% dos genótipos que apresentaram maior frequência de superioridade quanto às características de qualidade, de susceptibilidade aos danos por frio e combinando ambas. Para as característica de qualidade apresentaram maior divergência os acessos ‘Queen Giant’, ‘Sudanel Blanco’ e ‘Borracho de Jarque’. E, com base na qualidade foram selecionados os oito genótipos ‘Andross’, ‘San Jaime’, ‘San Lorenzo’, ‘Borracho de Jarque’, ‘Sudanell 1’, ‘Carson’, ‘Baby Gold 6’ e ‘Stanford’. Todos os 40 acessos apresentaram susceptibilidade a um ou mais sintomas causados pelo armazenamento refrigerado, quando mantidos por 28 dias, independentemente da temperatura. Para 14 dias, os acessos ‘Baby Gold 6’, ‘Flavortop’ e ‘Queen Giant’ não apresentaram nenhuma desordem fisiológica causada pelo frio. De maneira geral, a temperatura de 0 ºC favoreceu para conservação pós-colheita dos frutos, causando menor incidência e severidade dos sintomas oriundos do armazenamento refrigerado. O armazenamento por 14 dias contribuiu para menor incidência de danos sobre os acessos estudados. Para os 14 dias, em ambas as temperaturas, observou-se divergência para os acessos ‘Queen Giant’, ‘Sudanell Blanco’, ‘Baby Gold 6’, ‘GF3’,‘Baby Gold 8’, ‘Campiel’ e ‘Campiel Rojo’. Para 28 dias a 5 ºC, ‘Queen Giant’, ‘Big Top’, ‘Flavortop’ e ‘Redhaven’ apresentaram-se divergentes. Com base na suscetibilidade a danos por frio a 0 ºC, foram selecionados os oito acessos, ‘Queen Giant’, ‘Keimoes’, ‘Flavortop’, ‘Big Top’, ‘Redhaven’, ‘Sudanell 3’, ‘Bonet I’ e ‘Carson’. Os parâmetros de qualidade índice de maturação, sólidos solúveis, firmeza de polpa e acidez total apresentaram correlações entre si. Os mesmos, correlacionaram-se com polpa granulosa e escurecimento interno, indicando que frutos com maior amadurecimento tendem a desenvolver mais estes sintomas. Os distúrbios escurecimento interno, polpa farinhenta, polpa granulosa e ausência de sabor foram correlacionados em ambos os tempos e temperaturas, corroborando que esses sintomas são os principais distúrbios causados pelo armazenamento refrigerado. Combinando as características de qualidade e suscetibilidade aos danos por frio foram selecionados os genótipos ‘Baby Gold 6’, ‘Sarell’, ‘Keimoes’, ‘GF3’ ‘San Jaime’, ‘Big Top’, ‘Sudanell 1’, ‘Carson’, ‘Baby Gold 8’, e ‘San Lorenzo’. / The peaches and nectarines are highly appreciated by consumer, but it is climacteric fruits, with availability in the market in small time. It is necessary to invest to obtain genotypes with fruit quality and small perishability or that it presente less physiological disorders after storage. The aims of this work were i) to evaluate the genetic divergence among 40 peach and nectarine trees genotypes based on postharvest quality and select posible parents; ii) to evaluate the susceptibility to chilling injury in peaches and nectarines after cold storage; iii) to evaluate divergence of peaches and nectarines on the basis in the susceptibility for chiling injury and select superior genotypes; iv) evaluate the correlations between quality and susceptibility to chilling injury of peaches and nectarines v) select parents with the combination of lower susceptibility to chilling injury and higher quality fruit. The study was carried out in EEAD-CSIC, Zaragoza - Spain, during the production cycle 2013/2014. A total of 40 peaches and nectarines genotypes from germplasm collection were evaluated. The quality characteristics as flesh firmness, total soluble solids, titratable acidity, pH, rippining index and flesh color parameters were evaluated. The fruits were submitted to cold storage at 0 °C and 5 °C, with 95% average relative humidity. The evaluations were after 14 and 28 days, it being observed the presence of symptoms, such as wooliness through mealiness, flesh grainy, leatheriness and flesh color changes, through browning, bleeding and off flavor. As a selection parameter was adopted 20% of genotypes that had a higher frequency of superiority for quality characteristics, susceptibility to chilling injury and the combining of both. For quality characteristic presented greater divergence the ‘Queen Giant’, ‘Sudanel Blanco’ and ‘Borracho de Jarque’. Based on the quality the eight genotypes were selected, ‘Andross’, ‘San Jaime’, ‘San Lorenzo’, ‘Borracho de Jarque’, ‘Sudanell 1’, ‘Carson’, ‘Baby Gold 6’ and ‘Stanford’. All genotypes studied exhibited susceptibility to one or more symptoms caused by cold storage during 28 days, independent of temperature. For 14 days, the ‘Baby Gold 6’, ‘Flavortop’ and ‘Queen Giant’ genotypes did not show any physiological disorder caused by cold. In general, the temperature of 0 °C favored fruit postharvest conservation, it have a lower incidence and severity of symptoms caused by cold storage. The storage for 14 days contributed for the lower incidence of damage in the genotypes fruits studied. For 14 days, with both temperatures, it was observed divergence for ‘Queen Giant’, ‘Sudanell Blanco’, ‘Baby Gold 6’ ‘GF3’, ‘Baby Gold 8’, ‘Campiel’ and ‘Campiel Rojo’ genotypes. For 28 days, in the 5 °C condition, ‘Queen Giant’, ‘Big Top’, ‘Flavortop’ and ‘Redhaven’ genotypes were divergents. Based on susceptibility to chilling injury at 0 °C, the eight genotypes were selected, it being these, ‘Queen Giant’, ‘Keimoes’, ‘Flavortop’, ‘Big Top’, 'Redhaven', 'Sudanell 3', 'Bonet I' and ‘Carson’. The quality parameters as rippining index, soluble solids, firmness and titratable acidity presented correlation among them. These, also it had correlation with woolines and bowning, what it indicate that fruits with more ripening can have this symptoms more easily. The browning, mealiness, flesh grainy and off flavor variables were correlationed with the time period and temperartures, what it confirm that these symptoms are the main disorders caused by cold storage. The quality characteristics together susceptibility to chilling injury allowed selected ‘Baby Gold 6’, ‘Sarell’, ‘Keimoes’, ‘GF3’ ‘San Jaime’, ‘Big Top’, ‘Sudanell 1’, ‘Carson’, ‘Baby Gold 8’, and ‘San Lorenzo’ genotypes.