Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2013-2014. / Le suivi de la croissance et de l’activité de la microflore fongique de surface des fromages de type Camembert demeure un défi actuel. Cet écosystème est principalement composé de Geotrichum candidum et de Penicillium camemberti. Ces mycètes sont responsables de l’apparence et du développement des caractéristiques sensorielles pendant la période d’affinage des fromages à croûte fleurie. Ils ont donc un intérêt technologique pour l’industrie fromagère. Malgré leur importance, peu de travaux ont porté sur l’étude approfondie de l’écosystème de surface des fromages à croûte fleurie en cours d’affinage. Étant donné la nature filamenteuse, envahissante et multicellulaire des mycètes, les méthodes traditionnelles de dénombrement sur milieu gélosé sont imprécises. Pour y remédier, une méthode de quantification par PCR en temps réel (qPCR) a permis de suivre une population mixte contenant les mycètes les plus communs (Penicillium camemberti, Geotrichum candidum, Debaryomyces hansenii et Kluyveromyces lactis) sur des Camembert‐modèles, en fonction du temps d’affinage. En général, P. camemberti et G. candidum dominent l'écosystème et K. lactis demeure peu abondant. Lorsque D. hansenii est présent, il inhibe la croissance de K. lactis en plus de réduire celle des autres mycètes. Les informations aujourd’hui disponibles concernant ces mycètes sont principalement d’ordre biochimique et les gènes portés par G. candidum et par P. camemberti, de même que leurs profils d’expression pendant l’affinage sont peu décrits. La première étude métatranscriptomique de l’écosystème fongique du fromage Camembert a donc été réalisée et une base de données appelée CamemBank01 contenant près de 8000 gènes a pu être générée. L’annotation fonctionnelle des séquences obtenues a révélé que les fonctions prédominantes retrouvées dans CamemBank01 étaient associées au développement des propriétés sensorielles et que ces fonctions étaient principalement exprimées dans les deux premières semaines de l’affinage. Les résultats présentés dans cette thèse suggèrent que plusieurs gènes exprimés pendant l’affinage du Camembert pourraient servir de biomarqueurs. Les travaux futurs amèneront une meilleure compréhension de l’activité de ces champignons et permettront une utilisation optimale des ferments d’affinage. / Camembert cheese is characterised by a fungal microbiota which forms a complex surface ecosystem that has been little studied until now. Monitoring growth and activity during the ripening period remains a challenge. This ecosystem is mainly composed of Geotrichum candidum and Penicillium camemberti, but other yeasts such as Kluyveromyces lactis and Debaryomyces hansenii may be present. All these Fungi are responsible for the appearance and the development of typical sensory characteristics of mold ripened cheeses that develop during the ripening period and are therefore of technological interest for the cheese industry. Despite their importance, little work has focused on the in-depth study of this ecosystem. Given the filamentous and invasive nature of multicellular Fungi, traditional microbiological methods on agar medium are imprecise. A real time PCR (qPCR) has therefore been developed for the monitoring of mixed cultures containing the most common fungi (P. camemberti, G. candidum, D. hansenii and K. lactis) for the ripening of Soft Cheese Model Curds (SCMC). The results show that P. camemberti and G. candidum quickly dominate the ecosystem while K. lactis remains less abundant. When D. hansenii is added to the ripening culture, the growth of all other Fungi is reduced, except for K. lactis which is completely inhibited. General knowledge concerning these Fungi consist mostly on biochemical data, and genetic information carried by P. camemberti and G. candidum are poorly described. Moreover, their expression profiles during ripening are still unknown. CamemBank01 and its almost 8000 genes is then the first transcriptomic study concerning these fungi. Functional annotation of the sequences obtained revealed that the predominant functions found in CamemBank01 were associated with the development of the sensory properties and that these functions were expressed mainly within the first two weeks of ripening. The results presented in this work suggest that numerous genes expressed during Camembert ripening could be potential biomarkers. Future work should focus on better understanding the activity of these fungi and allow optimal use of ripening cultures.

Geotrichum candidum est une levure dimorphique qui occupe plusieurs rôles importants au sein de l’écosystème microbien de la surface des fromages à croute fleurie et à croute lavée. Ses différentes activités, notamment celles d’alcalinisation et de production de composés aromatiques, sont toutefois reconnues pour être souche-dépendantes. Peu d’études ont été menées sur la génétique de l’espèce G. candidum, bien que celle-ci mériterait d’être exploitée dans l’optique d’optimiser la production de ferments d’affinage utilisés dans les fromages affinés en surface. Dans le cadre de ce travail, les génomes de 11 souches de Geotrichum/Galactomyces spp. isolées de produits laitiers ou de l’environnement, ont été séquencés et comparés au niveau génomique. Également, afin d’avoir une caractérisation complète des souches, leur morphologie, leur capacité à croître en présence de différentes sources de carbone et à 35 °C, ainsi que leur capacité à se développer dans des caillés modèles ont été évaluées. Des divergences ont été observées entre les séquences génomiques des souches de Geotrichum spp. et Galactomyces spp., conduisant à la distinction des différentes espèces étudiées et à la formation de différents sous-groupes au sein de l’espèce G. candidum qui sont similaires à ceux établis par une étude préalablement réalisée par « Multilocus Sequence Typing » (MLST). Des différences ont également été observées entre les souches de l’espèce Geotrichum spp. en ce qui concerne leur morphologie, leur capacité à assimiler différentes sources de carbone ainsi que leurs propriétés alcalinisantes et protéolytiques lors de l’affinage de caillés modèles. La caractérisation génomique et phénotypique de souches de Geotrichum spp. fournit ainsi de nouvelles informations sur leurs caractéristiques et leur comportement dans différents milieux. Ce travail est donc d’une grande importance pour favoriser une meilleure sélection des souches de Geotrichum candidum pour le développement et l’amélioration de fromages affinés en surface. / Geotrichum candidum is a dimorphic yeast which plays several important roles within the surface microbial ecosystem of mold- and smear-ripened cheeses. Its various abilities, in particular those of alkalinization and production of aromatic compounds in cheeses are, however, recognized to be strain-dependent. Few studies have been carried out on the genetics of the species G. candidum, although this kind of information would be very useful in order to optimize the production of ripening cultures used in different types of surface ripened cheeses. In this project, the complete genomes of 11 Geotrichum/Galactomyces spp. strains isolated from dairy products or the environment were sequenced. Furthermore, in order to have a complete characterization of the strains, their morphology and their ability to grow in presence of different carbon sources, at 35°C, and in soft-cheese model curds were tested. Our results showed divergence between the genomic sequences of Geotrichum spp. and Galactomyces spp. strains, leading to the distinction of the different species studied and to the identification of different sub-groups among the G. candidum species that are consistent with those established in a previous study using Multilocus Sequence Typing (MLST). Differences were also observed between Geotrichum spp. strains for their morphology, their ability to metabolize different carbon sources, and their alkalinisation and proteolytic activities on soft-cheese model curd. The genome sequencing and the phenotypic characterization of the Geotrichum spp. strains provide new information about their characteristics and behavior in different media. This work is therefore of great importance to perform a better selection of G. candidum strains for the development and improvement of surface ripened cheeses.

Les souches microbiennes naturelles des fromages sont souvent caractérisées pour étudier leur contribution au développement des propriétés sensorielles (goût, odeur, texture) des fromages affinés. Une meilleure compréhension de ce rôle lors de l’affinage du fromage est essentielle afin de mieux contrôler la qualité de ceux-ci. Peu d’analyses génomiques en détails ont été effectuées sur les microorganismes de la microflore naturelle des fromages (microorganismes non inoculés), alors qu’un plus grand intérêt est porté sur les ferments inoculés. La caractérisation du génome complet de souches bactériennes provenant du terroir québécois permet d’en révéler le contenu en gènes et de prédire les voies métaboliques associées. Ceci permet également d’établir l’apport individuel de celles-ci à la production de composés aromatiques. Dans le cadre de ce travail, le génome complet de quatre souches Staphylococcus equorum ont été séquencés. Ensuite, une analyse détaillée du génome de ces quatre souches a été réalisée en effectuant l’assemblage et l’annotation fonctionnelle des ~2700 gènes prédits dans chacune des souches à l’étude. Des gènes impliqués potentiellement dans la protéolyse, la lipolyse et la dégradation du lactose, ont été retrouvés dans toutes les souches de S. equorum, révélant leur potentiel métabolique important dans le fromage. Plusieurs attributs intéressants des S. equorum ont également été identifiés par des analyses de génomique comparative. D’abord, la relation entre le regroupement phylogénétique des souches avec leurs sources d’isolement indique une possibilité d’adaptation des souches à leur niche écologique. La présence de gènes uniques ou peu partagés est aussi une caractéristique identifiable dans les génomes des souches étudiées et pouvant avoir un impact sur les métabolismes des souches. La caractérisation du génome de souches de S. equorum et les analyses phylogénomiques fournissent de nouvelles informations sur son rôle dans le fromage et des indices sur son potentiel métabolique. Les données génomiques obtenues permettront, lors de validations futures, de sélectionner des souches ayant des propriétés désirables en fonction des variétés fromagères afin d’obtenir des fromages de qualité optimale. / The natural microbiota of cheese has often been characterized to study their potential participation in the development of sensorial properties (taste, odour, texture) of the ripened cheeses. A better understanding of their role during cheese ripening is therefore essential in order to have a better control of its quality. Few in-depth genomic analyzes have been carried out on microorganisms of the natural microflora of cheese (non-inoculated microorganisms), while there is a greater interest for inoculated ferments. The genes possessed by bacterial strains of the Quebec terroir can be revealed by the characterization of their complete genome, leading to the prediction of the associated metabolic pathways. This also allows the establishment of the individual contribution of each strain to the production of aromatic compounds. As part of this work, the complete genome of four strains of Staphylococcus equorum were sequenced. Then, a detailed analysis of the genome of these four strains was completed by their assembly and the functional annotation of the ~ 2700 genes predicted in each of the studied strains. Genes potentially implicated in proteolysis, lipolysis and lactose degradation, were found in all S. equorum strains, revealing their potential metabolisms important for cheese. Several interesting attributes of S. equorum were also identified by comparative genomic analyses. First, the relation in between the phylogenetic grouping and the source of isolation of the strains, indicates a possible adaptation of the strains to their ecological niche. The presence of unique or barely shared genes is also a distinguishable characteristic of the studied strains and can have an impact on the metabolisms of the strains. The characterization of the genome of S. equorum strains and the phylogenomic analyzes have provided new information on their role in cheese and clues about their metabolic potential. The genomic data collected will allow during future validations the selection of strains with desirable properties in function of cheese variety to yield cheeses of optimal quality.

Le Cheddar est le fromage le plus consommé au Canada. Sa fabrication résulte de l'action coordonnée de facteurs technologiques et microbiologiques. Ces derniers sont souvent les plus difficiles à contrôler. Ils comprennent l'action du ferment et le développement de bactéries lactiques de la flore secondaire (NSLAB). Les NSLAB ne sont pas ajoutées volontairement au fromage et leurs rôles durant l'affinage ne sont pas bien définis. Ce projet exemplifie l'utilisation de la métagénomique, nouvelle science permettant d'analyser simultanément les génomes de tous les microorganismes d'une niche écologique donnée, pour obtenir de l'information sur la communauté microbienne du fromage et le rôle de chaque microorganisme dans le Cheddar. L'optimisation de la méthode ±substrate-induced gene expression screening¿ (SIGEX), afin d'identifier des opérons cataboliques induits par le citrate et la methionine, est décrite. Cette étude illustre la grande diversité de la flore microbienne du Cheddar et établit plusieurs protocoles nécessaires à l'avancement de la métagénomique dans le fromage.

Pour satisfaire l'intérêt grandissant des Québécois pour la consommation de fromage Cheddar, les transformateurs laitiers font face au défi du maintien de la grande qualité de leurs produits. Plusieurs bactéries, levures et champignons du microbiote natif des fromages du terroir québécois ont précédemment été isolés et identifiés. Ces microorganismes sont responsables des propriétés sensorielles typiques des fromages québécois par leurs diverses activités enzymatiques pendant l'affinage, notamment la protéolyse qui module la texture des fromages pendant l'affinage. En premier lieu, un criblage de souches de bactéries lactiques a été réalisé à l'aide d'une méthode basée sur la caractérisation de la texture, mais a été remplacée par la détermination de l'activité protéolytique. Au total, dix souches bactériennes et sept de levures ont été criblées. L'activité lipolytique a aussi été ajoutée comme paramètre de criblage pour son potentiel impact sur la texture. Pour ce faire, des milieux caséinate de calcium et tributyrine ont été inoculés individuellement avec les souches pour le criblage de la protéolyse et la lipolyse, respectivement, et incubés à 15 °C et 25 °C, pendant 21 jours. Deux souches, Latilactobacillus curvatus (LMA-11) et Lacticaseibacillus paracasei ssp. tolerans (LMA-1802), se sont démarquées par leur forte capacité protéolytique à 15 °C. Ensuite, les souches ont été ajoutées individuellement à la production à l'échelle pilote de fromages de type Cheddar affinés de manière accélérée pendant 64 jours à 13 °C afin de vérifier leur impact sur la protéolyse et la texture. Les suivis de la population bactérienne, de la composition, du pH et du profil de texture (TPA) ont aussi été réalisés après 5, 22, 43 et 64 jours d'affinage. Aucune des deux souches n'a apporté de changements significatifs au niveau de la composition, de la protéolyse, ni de la texture pendant l'affinage. Cependant, Lacticaseibacillus paracasei ssp. tolerans (LMA-1802) a mieux persisté pendant l'affinage et a réduit le compte bactérien du ferment significativement. Ces nouvelles données suggèrent que les souches Latilactobacillus curvatus (LMA-11) et Lacticaseibacillus paracasei ssp. tolerans (LMA-1802) n'induisent pas de défaut de composition ni de texture, mais un affinage prolongé aurait peut-être permis de cerner un impact sur l'un ou l'autre de ces paramètres. Il est possible d'émettre l'hypothèse que Lacticaseibacillus paracasei ssp. tolerans (LMA-1802) aurait permis de réduire la viabilité du ferment, et possiblement son autolyse, ce qui peut ainsi libérer des peptidases intracellulaires qui peuvent moduler les saveurs du fromage Cheddar. / To satisfy the growing interest of Quebecers for Cheddar cheese consumption, dairy processors are facing the challenge of maintaining the high quality of the cheeses. Several bacteria, yeasts, and molds of the native microbiota of Quebec cheeses have been previously isolated and identified. These microorganisms are responsible for the typical sensory properties of Quebec cheeses through their various enzymatic activities during ripening, among which proteolysis, which modulates the texture of cheeses during ripening. First, a screening of lactic acid bacteria was performed using a texture-based method but was replaced by the detection of the proteolytic activity of the strains. A total of ten bacterial strains and seven yeasts were screened. The lipolytic activity was also added as a screening parameter. For this purpose, calcium caseinate and tributyrin media were inoculated with the strains individually for proteolysis and lipolysis screening, respectively, and incubated at 15°C and 25°C, for 21 days. Two strains, Latilactobacillus curvatus (LMA-11) and Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans (LMA-1802), stood out for their high proteolytic activity at 15 °C. Then, the strains were added individually to pilot-scale production of Cheddar-type cheeses aged using an accelerated ripening protocol for 64 days at 13°C to determine their impact on proteolysis and texture. Monitoring of bacterial population, composition, pH, and texture profile (TPA) were also performed after 5, 22, 43 and 64 days of ripening. Neither strain showed changes in composition, proteolysis, or texture during maturation. However, Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans (LMA-1802) persisted better during ripening and reduced the bacterial count of the starter culture significantly. These new data suggest that, at least, Latilactobacillus curvatus (LMA-11) and Lacticaseibacillus paracasei ssp. tolerans (LMA-1802) strains do not induce compositional or textural defects, but extended ripening might have identified an impact on either of these parameters. It is possible to hypothesize that Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans (LMA-1802) reduced the viability of the starter culture and could have possibly induced its autolysis, which can then release intracellular peptidases that may modulate the flavors of Cheddar cheese.

L’hypertension est probablement le plus important problème de santé dont souffrent les Canadiens (Statistiques Canada, 2010). Modifier l’alimentation est une façon de contrôler l’hypertension (OMS, 2013) (Statistiques Canada, 2010). Une autre possibilité serait la consommation d’acide gamma-aminobutyrique. L’acide gamma-aminobutyrique (GABA) est un composé hypotenseur présent dans certains aliments fermentés suite à sa production par certains microorganismes en condition de stress acide. La consommation quotidienne de 50 g de fromage de type Cheddar contenant 0,32 mg de GABA/g de fromage a entrainé une baisse de pression artérielle significative chez des hommes sujets à la préhypertension (Pouliot-Mathieu et al., 2013), mais non-significative par rapport au groupe témoin. Le Chester est un fromage à pâte semi-ferme, dont l’affinage dure plusieurs mois et dont le pH de 4,8 est obtenu naturellement, conditions qui favorisent la production de GABA. Le but de ce projet était de produire un fromage de type Chester en employant un ferment producteur de GABA qui permettrait l’obtention d’une concentration en GABA supérieure à 0,32 mg de GABA/g. La consommation de 50 g quotidienne de ce fromage pourrait alors entrainer une baisse de pression artérielle significative comparativement à un témoin sans GABA. La production de GABA a été confirmée chez les souches productrices Lc. lactis A23 et H13 et infirmée chez les souches de Lb. casei et Lb. paracasei testées. L’ajout du cofacteur de la réaction, le pyridoxal-5’-phosphate (PLP) a été évalué sur des caillés modèles, en plus de l’effet d’une combinaison des souches productrices de GABA, soit 50 % Lc. lactis H13/50% Lc. lactis A23. Le PLP n’a pas été ajouté lors de la fabrication des fromages de type Chester. Quatre ferments ont été employés et les fromages ont été affinés à 4°C, 8°C ou 12°C. À l’exception d’une humidité plus faible, la composition des fromages produits était semblable à celle d’un Chester traditionnel mais leur texture n’était pas aussi friable. La concentration maximale de GABA produite après 90 jours d’affinage à 12°C a été de 58mg/100g de fromage en utilisant un ferment composé de 25 % Lc. lactis H13 et de 75 % Lc. lactis A23.