Memoria para optar al título profesional de: Ingeniero Agrónomo Mención: Sanidad Vegetal / La pudrición ácida en postcosecha de carozos, causada por el hongo Geotrichum candidum Link, se ha constituido en un problema recurrente para productores de Chile lo que ha resultado en la necesidad de hacer aplicaciones de fungicidas cerca de la cosecha, para su control. Los síntomas se presentan como una maceración y una desintegración de la cutícula y la pulpa del fruto, con formación de un micelio blanco muy tenue. Los síntomas de la enfermedad aparecen tardíamente, avanzado en postcosecha, cuando la fruta ya se encuentra en destino, no habiéndose observado el desarrollo de la pudrición en la fruta en origen. Esta situación dificulta conocer su epidemiología y evaluar manejos para disminuir su incidencia. Considerando esta situación, mediante un procedimiento de congelamiento de los frutos y una posterior mantención en cámara húmeda, se observó el desarrollo de poblaciones epífitas de G. candidum. Esta metodología permitió evaluar el efecto de distintos fungicidas en el control de la pudrición ácida. La efectividad de control de los fungicidas propiconazole, tebuconazole y un extracto de cítricos, fue estudiada en duraznos Everst, los que se inocularon 10 días antes de la cosecha y 5 días después fueron tratados con los fungicidas mencionados. Para conocer la efectividad residual de los fungicidas, duraznos de la variedad Ross se trataron con los mismos fungicidas en precosecha y luego se inocularon con G. candidum a 1, 5, 10 y 15 días después de la aplicación, y se cosecharon 5 días después de cada inoculación. Los fungicidas propiconazole y tebuconazole aplicados en precosecha redujeron significativamente las poblaciones epífitas de G. candidum, y tuvieron un efecto residual de hasta 15 días. Además, se determinó y comparó la incidencia de poblaciones epífitas en fruta proveniente de dos huertos comerciales con historial de pudrición acida, en los que se hicieron aplicaciones comerciales en precosecha de los fungicidas tebuconazole, propiconazole, dióxido de cloro, extracto de cítricos y una mezcla de iprodione + propiconazole. La incidencia fue muy diferente entre los dos campos evaluados, con un 99 y 8,3% respectivamente en los frutos de los tratamientos testigos (sin aplicación de productos). En ambos campos, la aplicación de tebuconazole y propiconazole redujeron la incidencia del patógeno en la fruta. / Sour rot of stone fruit caused by Geotrichum candidum Link, has become a recurrent problem for Chilean growers, resulting in new fungicide sprays applied in the orchards before the harvest. Fruit maceration and disintegration of the cuticle are the main symptoms of sour rot, with a white and thin layer of mycelium of the pathogen developing on infected tissues. Symptoms show up late in postharvest, mainly at the arrival of the fruit to the foreign markets, with few development of the rot in origin. This situation does not allow conducting experiments in order to know the epidemiology of the disease or the effect of control measures. In this work, the development of the epiphytic populations of the pathogen on the fruit after freezing it was observed. This methodology allowed evaluating the effect of fungicide treatment on the control of G. candidum. The effect of the fungicides propiconazole, tebuconazole and a citric extract was evaluated on Everst peach, when sprayed 5 days after a conidial inoculation of the fruit. The residual effect of the fungicides was evaluated on Ross peach inoculated in the orchard with G. candidum 1, 5, 10 and 15 days after fungicide spray. The fruit was harvest 5 days after each inoculation and subjected to the freezing methodology. Both propiconazole and tebuconazole significantly reduced the epiphytic populations of the pathogen, with a residual effect reaching up to 15 days. Furthermore, the effect of the fungicides propiconazole, tebuconazole, chlorine dioxide, citric extract and iprodione + propiconazole, on the epiphytic populations of G. candidum, was evaluated on two commercial orchards, with or without history of the disease, that were sprayed previous to harvest. Incidence of the pathogen on the fruit reached a 99% and 8.3%, in the untreated control fruit, for the orchards with and without history of the disease, respectively. The spray of tebuconazole and propiconazole reduced the incidence of the pathogen on the fruit in both orchards.

Memoria para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo / Con el fin de evaluar la virulencia y características genéticas de aislados chilenos de Botrytis cinerea con distinta sensibilidad a iprodione, se seleccionaron nueve aislados altamente resistentes (EC50: 1,35 – 2,47 μg·mL-1) y cuatro aislados sensibles (EC50: 0,26 – 0,31 μg·mL-1). La virulencia se evaluó en plántulas de pepino (Cucumis sativus L.) mediante inoculación de discos de agar con micelio del hongo de tres días de edad y en bayas de vid (Vitis vinífera L.) Thompson Seedless con distinto grado de madurez (7°, 14° y 17° Brix), mediante inoculación de una suspensión conidial (equivalente a 2·105 conidias·mL-1). Posterior a la inoculación las plántulas de pepino se mantuvieron a 20-25°C y 100% de humedad relativa y las bayas de vid en cámaras de crecimiento a 20°C. La evaluación se realizó mediante medición del diámetro de la lesión en la zona de inoculación luego de 96 y 72 horas en hojas de pepino y bayas de vid, respectivamente. Los resultados obtenidos fueron sometidos a un ANDEVA simple y en las dos pruebas de virulencia realizadas los aislados de Botrytis cinerea resistentes y sensibles presentaron niveles de agresividad similares. La caracterización genética de los aislados se realizó amplificando mediante PCR el gen bos1 asociado a resistencia de Botrytis cinerea a dicarboximidas, utilizando 5 pares de partidores específicos. Posteriormente los productos de PCR purificados fueron secuenciados por Macrogen USA Corp. El análisis de las secuencias nucleotídicas de los nueve aislados resistentes detectó un cambio aminoacídico en la posición T1259A de la proteína. En ocho de éstos fueron detectadas las mutaciones I365N y R104Q y en el aislado restante un cambio en la posición I365S y una sustitución en la posición L849V. Esta última sustitución no ha sido descrita previamente desconociéndose su implicancia en el nivel de resistencia. En ninguno de los cuatro aislados sensibles secuenciados, el gen bos1 presentó mutaciones asociadas a resistencia a dicarboximidas. / In order to evaluate the virulence and genetic characteristics to Chilean isolates Botrytis cinerea of with different sensitivity to iprodione, were selected nine highly resistant isolates (EC50: 1, 35 to 2.47 μg·mL-1) and four susceptible isolates (EC50: 0.26 to 0.31 μg·mL-1). The virulence was evaluated inoculating cucumber seedlings (Cucumis sativus L.) with three days old Botrytis cinerea mycelium and different ripe (7 °, 14 ° 17 ° Brix) Thompson Seedless grape berries (Vitis vinifera L.) with a conidial suspension (2·105 conidia·mL-1). Cucumber seedlings were kept at 20-25°C and relative humidity 100% and grape berries in growth chambers at 20°C. The evaluation was done measuring the lesion diameter after 96 and 72 hours in cucumber leaves and grape berries, respectively. The results were subjected to a simple ANOVA and in both virulence tests carried out, the sensitive and resistant Botrytis cinerea isolates showed similar levels of aggressiveness. The genetic characterization was performed by PCR amplification of the dicarboximide resistance associated Botrytis cinerea bos1 gene, by means of five specific primers. The purified PCR product was sequenced by Macrogen USA Corp. By means of sequences analysis the bos1 gene nucleotide, in all the nine resistant isolates was detected an amino acid change at the T1259A protein position. The I365N and R104Q mutations were detected in eight of the isolates and in the other isolate a change in the position I365S and a substitution at position L849V. The latter substitution has not been previously detected and it implications on resistance is unknown. The bos1 gene showed no mutations associated to the resistance to dicarboximides in any one of the four susceptible isolates sequenced.

Ingeniera Civil en Biotecnología / Chile: Potencia Alimentaria y Forestal es el nuevo slogan adoptado por el país y simboliza el buen escenario del sector silvoagropecuario. Sin embargo, la planta y los frutos de la vid son atacados por el hongo patógeno Botrytis cinerea, produciendo grandes pérdidas productivas y económicas. Nuevas oportunidades de negocio se abren con el cultivo de flores de exportación. Para cuidar que las flores permanezcan en óptimas condiciones se debe combatir el principal patógeno que enferma a estas plantas, la bacteria Erwinia carotovora. Recientemente se ha demostrado que extractos de plantas, algas y esponjas marinas que contienen geranilfenoles y geranilhidroquinonas, poseen propiedades antifúngicas y antibacterianas. Debido a esto y los bajos rendimientos con que se obtienen desde la fuente natural es que se ha decidido sintetizar 6 de estos compuestos en el Laboratorio de Síntesis Orgánica de la UTFSM. Se estudió el efecto de los compuestos H1, M1, I1, I5, L1 y L2 sobre el crecimiento de Botrytis cinerea y Erwinia carotovora. Además, se planteó aumentar la solubilidad de los compuestos y su efectividad contra los patógenos, mediante un sistema de encapsulamiento. Del estudio de actividad antifúngica se obtuvo resultados prometedores para los compuestos, en particular el compuesto H1, que incluso logró porcentajes de inhibición mayores que los del producto comercial Captan, utilizando las mismas concentraciones. H1 a 250 ppm provocó una inhibición del crecimiento de B. cinerea del 86%. También exhibieron altos porcentajes de inhibición del crecimiento del hongo, H1 a 150 ppm con 82% e I1 a 250 ppm con 81%. Al probar la actividad antibacteriana de los compuestos también se obtuvo un buen candidato de estudio, L1. Aunque demostró tener poder bactericida contra Erwinia carotovora a 100 ppm y contra Bacillus subtilis a 50 ppm, esta actividad antibacteriana no fue estable en el tiempo. Sólo fue estable contra Bacillus en el caso en que la infección se realiza al mismo tiempo que la adición del compuesto. El sistema de encapsulamiento fue efectivo en la solubilización de los compuestos pero inefectivo en su uso en pruebas biológicas. Los altos porcentajes de inhibición del crecimiento de Botrytis obtenidos por los compuestos sin encapsular se vieron disminuidos al utilizar los compuestos en su forma encapsulada, llegando a bajar, en el peor de los casos, desde 81% a 26% para I1 a 250 ppm. Al utilizarse el compuesto L1 encapsulado en los ensayos de actividad antibacteriana, en todos los casos, se revirtió el poder bactericida del compuesto, provocando gran proliferación de ambos patógenos, E. carotovora y B. subtilis. Se postula que estos compuestos son muy estables dentro de la micela de encapsulamiento y su liberación es muy lenta como para ser registrada durante la duración de los experimentos. Entre las recomendaciones realizadas para estudios futuros, se hace énfasis en la necesidad de un estudio de cinética de liberación. Se propone el compuesto H1 como componente principal de un potencial producto comercial para combatir el hongo Botrytis cinerea. Para el caso de la actividad antibacteriana, se debe seguir investigando para aumentar la estabilidad del compuesto L1.