Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-07-17T16:47:39Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliano Juscelino Silva - 2017.pdf: 1989710 bytes, checksum: f45b210b1488868b181e806fa7091267 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-07-18T11:01:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliano Juscelino Silva - 2017.pdf: 1989710 bytes, checksum: f45b210b1488868b181e806fa7091267 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-18T11:01:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliano Juscelino Silva - 2017.pdf: 1989710 bytes, checksum: f45b210b1488868b181e806fa7091267 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-06-01 / Microorganisms are agents of biological control, among them, the entomopathogenic fungi stand out. Tolypocladium cylindrosporum IP419 and IP425, Lecanicillium psalliotae IP456, IP491 and IP492 were isolated from sentinel larvae. Conidiobolus macrosporus IP396 and L. psalliotae IP455 isolated from adult culicíneos. At 5 and 15 days, depending on the fungus, conidia were scraped from sporulated culture plates and adjusted in suspensions. In 30 eggs/ replicate, 50 μL of suspension of the isolates IP419, IP425, IP455, IP456, IP491 and IP492 were applied in five concentrations (3.3 × 103 to 3.3 × 105 conidia/cm2). For IP 396, 2.5 × 104 conidia/cm2 was applied. In experiments with larvae (10 L3/repeat), five concentrations were applied (3.3 × 105 to 3.3 × 107 conidia/ml) for IP419, IP425, IP455, IP456, IP491 and IP492, and (103 to 105 conidia/ ml) for IP396. The controls were treated with distilled water. Adults were exposed to five concentrations (3.3 × 104 to 3.3 × 106 conidia/cm2) of conidia of IP419 and IP425. For IP396 and IP455, IP456, IP491 and IP492, adults were exposed to the sporulated culture. Adult controls were not exposed to fungi. Ten adults were exposed in 4 replicates. There was no significant activity of the isolates tested against eggs. Mortality of larvae treated with T. cylindrosporum was ≤ 90% at the lowest concentration (3.3 × 105 conidia/ml) and 100% at the highest concentration (3.3 × 107 conidia/ml). The LC50 and LC90 were 3.5 × 104 conidia/ml and 6.8 × 106 conidia/ml for IP419 and 5.9 × 105 and 1.3 × 107 conidia/ml for IP425. The TL50 and TL90 for IP419 at the highest concentration (3 × 107 conidia/ml) was ≤ 7 hours. The concentrations applied had a significant effect (P <0.001). In larvae treated with IP396, mortality of L3 increased with conidia concentration, in the highest concentration (105 conidia /ml), was ≤ 57% in 48 h. There was no growth of the fungus on L3 exposed in agar medium for IP396, for T. cylindrosporum the fungal development was ≤ 70%. Mortality of larvae in controls was ≤ 15%. L. psalliotae had no larvicidal activity. Mortality of adults treated with T. cylindrosporum was ≤ 75%. There was fungal development on corpses ≤ 65%, the concentrations applied had a significant effect (P <0.001). The cumulative mortality of IP396 treated adults reached 100% after 5 days, and ≥ 80% over 10 days for L. psalliotae. The results show that T. cylindrosporum and C. macrosporus have potential for integrated control of larvae and adults of A. aegypti. / Microrganismos são agentes de controle biológico, dentre eles, destacam-se os fungos entomopatogênicos. Tolypocladium cylindrosporum IP419 e IP425, Lecanicillium psalliotae IP456, IP491 e IP492 foram isolados de larvas sentinela. Conidiobolus macrosporus IP396 e L. psalliotae IP455 isolados de culicíneos adultos. Em 5 e 15 dias, dependendo do fungo, conídios foram raspados de placas com cultura esporulada e ajustados em suspensões. Em ovos (30 ovos/repetição), foram aplicados 50 μL de suspensão dos isolados IP419, IP425, IP455, IP456, IP491 e IP492 em cinco concentrações (3,3 × 103 a 3,3 × 105 conídios/cm2). Para IP396, aplicou-se 2,5 × 104 conídios/cm2. Em testes com larvas (10 L3/repetição), cinco concentrações foram aplicadas (3,3 × 105 a 3,3 × 107 conídios/ml) para IP419, IP425, IP455, IP456, IP491 e IP492, e (103 a 105 conídios/ml) para IP396. Os controles foram tratados com água destilada. Adultos foram expostos a cinco concentrações (3,3 × 104 a 3,3 × 106 conídios/cm2) de conídios de IP419 e IP425. Para IP396 e IP455, IP456, IP491 e IP492, adultos foram expostos à cultura esporulada. Adultos controle não foram expostos aos fungos. Foram expostos 10 adultos, em 4 repetições. Não houve atividade significante dos isolados testados contra ovos. A mortalidade de larvas tratadas com T. cylindrosporum, foi ≤ 90% na menor concentração (3,3 × 105 conídios/ml) e 100% na maior concentração (3,3 × 107 conídios/ml). A CL50 e CL90 foi de 3.5 × 104 conídios/ml e 6.8 × 106 conídios/ml para IP419 e de 5.9 × 105 e 1.3 × 107 conídios/ml para IP425. O TL50 e TL90 para IP419, na maior concentração (3 × 107 conídios/ml) foi ≤ 7 horas. As concentrações aplicadas tiveram efeito significativo (P < 0,001). Em larvas tratadas com IP396, a mortalidade de L3 aumentou com a concentração de conídios, na maior concentração (105 conídios/ml), foi ≤ 57% em 48 h. Não houve crescimento do fungo sobre L3 expostas em meio ágar para IP396, para T. cylindrosporum o desenvolvimento fúngico foi ≤ 70%. A mortalidade de larvas nos controles foi ≤ 15%. L. psalliotae não teve atividade larvicida. A mortalidade de adultos tratados com T. cylindrosporum foi ≤ 75%. Houve desenvolvimento fúngico sobre cadáveres ≤ 65%, as concentrações aplicadas tiveram efeito significativo (P < 0,001). A mortalidade acumulada de adultos tratados com IP396 chegou a 100% após 5 dias, e ≥ 80% em dez dias para L. psalliotae. Os resultados mostram que T. cylindrosporum e C. macrosporus têm potencial para controle integrado de larvas e adultos de A. aegypti.

The coleoptera Rhynchophorus palmarum (L.), vulgarly known as palm weevil is considered on of mainly pest of several palm trees of economic importance. In coconut tree their larvae destroy the plant culms and their adults act like a vector of nematode Bursaphelenchus cocophilus that cause the red ring disease. With the objective of subside the practices of biological control of R. palmarum already utilized it was carried out tests aiming to determine the flight activity of the insect in coconut fields; to validate the technique of autoinoculation of adults of R. palmarum using traps like vegetal traps bait inoculated with the Beauveria bassiana enthomopatogenic fungi; and to characterize genetically isolates of the fungi by molecular makers of RAPD, microsatellites and ITS-DNAr. To determine the flight activity of the insect it was installed, around the commercial field, traps of capture/monitoring for population of R. palmarum adult’s insect, containing attractive feed (culms of sugar cane) added with pheromone of aggregation. For the autoinoculation tests it was used the randomized statistical design, in a factorial scheme 3x4 (3 spores concentration of the fungi and 4 periods of autoinoculation), using four replications constituted by 5 pairs of males and females. The insects were separated, cleaned with distilled water and transfer to buckets with sugar cane culms inoculated with B. bassiana on concentrations 107, 108 and 109 spores/mL of suspension), keeping in contact with the inoculums for 45min.; 90min.; 3h00 and 6h00. After this period of exposition the insects were individualized being the mortality/infection evaluated for 20 days. For genetic characterization it was used 11 isolates obtained from monospores cultures that posterior were inoculated in a liquid medium at 25ºC±1ºC under constant shaking in dark conditions. After seven days the mycelium were filtered, lyophilized and after DNA extracted in SDS buffer at 10%. It was tested 20 decamer primers of arbitrary sequence of IDT Company. The amplifications were carried out in termocycler (Biometra/Unisciense) programmed for initial temperature of 94°C for 5min. and 45 cycles of: 94°C for 1min., 36°C for 2min. and 72°C for 1min.. For microsatellites analyses it was used four pairs of primers. The amplification reactions were carried out using a volume of 25µL. The amplifications consisted by one initial cycle of 94ºC and 30 cycles of 94ºC for 1min.; 50ºC for 1min. and 72ºC for 2min., and a end cycle of 72ºC for 7min.. The amplified fragments were separated by electrophoresis in agarose gel using TBE buffer, and the gel stained with ethidium bromete (0.5µg/mL) after visualized under UV light. The insect initiates flight activity at 5h00 am through 6h00 pm o’clock occurring the population maximum at 9h00 am to11h00 am. It was verified the mortality increase of adults of R. palmarum in accord to fungi concentration and period of exposition of the inoculums. The higest index of mortality (53%) occurred nine days after the autoinoculation by B. bassiana. The RAPD analysis generated 138 polymorphic and 14 monomorphic bands being the patterns used to calculate the genetic similarity that varies of 2% to 77%. The 57.99 (Betume2-SE) and 53.96 (Mojú-PA) isolates presented high similarity (77%), followed by 64.99 (Egypt) and 53.96 (Mojú-PA), with similarity of 73% by RAPD test. For microssatellite the BC.05 and 32.91 isolates presented genetic similarity of 82%, followed by 64.99 and 57.99 with genetic similarity of 80%. It was not observed amplifications variations using ITS regions for B. bassiana isolates. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / O coleóptero Rhynchophorus palmarum (L.), vulgarmente conhecido como broca-doolho-do-coqueiro é considerado uma das principais pragas de palmeiras de importância econômica. Suas larvas destroem a estipe da planta e os adultos atuam como vetores do nematóide Bursaphelenchus cocophilus causador da doença “anel vermelho”. Com o objetivo de subsidiar as práticas de controle biológico do R. palmarum já empregadas, foram realizados testes visando: determinar a atividade de vôo do inseto em plantios de coco; validar a técnica de autoinoculação de adultos de R. palmarum usando armadilhas com iscas vegetais inoculadas com o fungo entomopatogênico Beauveria bassiana e caracterizar geneticamente isolados do fungo por meio de marcadores moleculares do tipo RAPD, microssatélite e ITS-DNA. Para determinar a atividade de vôo do inseto foram instaladas, na periferia de pomares comerciais de coco, armadilhas de captura/monitoramento da população de adultos de R. palmarum, contendo atrativo alimentar (colmos de cana-de-açúcar) mais feromônio de agregação. Nos testes de autoinoculação utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3x4 (3 concentrações do fungo e 4 tempos de autoinoculação), com 4 repetições de 5 casais. Os insetos foram separados, limpos em água destilada e transferidos para baldes contendo cana-de-açúcar inoculada com B. bassiana nas concentrações padronizadas (107, 108 e 109 esporos/mL de suspensão), permanecendo em contato com o inóculo por 45min.; 90min.; 3h00 e 6h00. Após o período de exposição ao fungo, os insetos foram individualizados, sendo a mortalidade/infecção avaliada por 20 dias. Na caracterização genética foram utilizados 11 isolados, para os quais foram obtidas culturas monospóricas que posteriormente foram repicadas, em meio líquido a 25ºC±1ºC, em agitação constante e no escuro. Após sete dias os micélios foram filtrados, liofilizados e em seguida seu DNA genômico extraído em tampão de extração SDS 10%. Foram testados 20 primers decâmeros de seqüência arbitrária da marca IDT. As amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra/Unisciense) programado com temperatura inicial de 94°C por 5min. e 45 ciclos a 94°C por 1min., 36°C por 2min. e 72°C por 1min.. Para as análises de microssatélites foram empregados quatro pares de primers. As reações de amplificação foram feitas em um volume de 25µL. As amplificações consistiram de um ciclo inicial de 94ºC e 30 ciclos de: 94ºC por 1min.; 50ºC por 1min. e 72ºC por 2min., ao final 1 ciclo de 72ºC por 7min. Os fragmentos amplificados foram separados em gel de agarose, submetidos à eletroforese em tampão TBE, corados com brometo de etídio (0,5 µg/mL) e visualizados sob luz UV. Observou-se que o inseto inicia sua atividade de vôo as 5h00 até às 18h00, ocorrendo um pico populacional máximo das 9h00 às 11h00. Verificou-se uma mortalidade crescente de adultos de R. palmarum em função do aumento da concentração do fungo e dos tempos de exposição ao inóculo. O maior índice de mortalidade (53%) ocorreu nove dias após a autoinoculação do inseto. As análises de RAPD geraram 138 bandas polimórficas e 14 monomórficas, sendo os padrões empregados para o cálculo das similaridades genéticas que variaram de 2% a 77%. Os isolados 57.99 (Betume2-SE) e 53.96 (Moju-PA) apresentaram maior similaridade (77%), seguidos de 64.99 (Egito) e 53.96 (Moju-PA), com uma similaridade de 73% pelo teste de RAPD. Enquanto que para o microssatélite os isolados BC.05 e 32.91 apresentaram maior similaridade genética (82%), seguidos de 64.99 e 57.99 com similaridade genética de 80%. Não foram observadas variações na amplificação das regiões ITS de DNAr para os isolados de B. bassiana.