Thèses (Ph.D.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2001. / Titre de l'écran-titre (visionné le 24 août 2006). Publié aussi en version papier.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 1998. / Titre de l'écran-titre (visionné le 21 juillet 2006). Publié aussi en version papier.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2000. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Le cancer est une pathologie complexe causée par plusieurs facteurs génétiques et environnementaux. Aux États-Unis seulement, près de 1 400 000 cas de cancer seront diagnostiqués en 2006 et plus de 500 000 personnes en mourront. Encore aujourd'hui, plusieurs types de cancer sont incurables et la plupart des traitements existants ne sont malheureusement pas curatifs. Cette maladie est caractérisée par une croissance cellulaire incontrôlée ainsi qu'une dissémination des cellules anormales. La prolifération accrue des cellules cancéreuses mène à l'apparition de régions hypoxiques chez plusieurs tumeurs solides. Un grand nombre de molécules participent aux différents stades de la progression tumorale et permettent à la tumeur de s'adapter à son microenvironnement. Plusieurs de ces dernières sont synthétisées sous forme de pro-peptides nécessitant un clivage enzymatique ciblé afin d'acquérir leur activité. Il a été démontré que la furine, le prototype de la famille des convertases de proprotéines, joue un rôle important dans la progression tumorale. La furine est surexprimée chez plusieurs types de tumeurs et elle est nécessaire à l'activation de substrats protéiques dont les rôles dans la croissance tumorale ainsi que dans la formation des métastases sont répertoriés. Dernièrement, l'étude des différents promoteurs de la furine a révélé qu'elle pouvait être induite en hypoxie, et. ce, via le facteur de transcription HIF-1. Notre étude avait pour but d'étudier l'implication de la régulation hypoxique de la furine dans le développement du cancer. Nous avons démontré, par immunohistochimie, la présence de régions hypoxiques dans les xénogreffes formées à partir de fibrosarcomes humains ainsi qu'une surexpression de la furine dans ces régions. Afin d'inhiber cette induction dans les régions hypoxiques tumorales, nous avons construit des vecteurs plasmidiques contenant un inhibiteur de la furine, soit l'[alpha]1-AT-PDX, sous le contrôle d'un promoteur inductible en hypoxie. Ces vecteurs possèdent 3 ou 6 répétitions d'une séquence du gène de l'érythropoïétine contenant un site de reconnaissance pour le HIF-1. Nous avons démontré que ces vecteurs augmentent les niveaux de PDX chez les cellules HT1080 cultivées en hypoxie. De plus, nous avons établi que l'augmentation de PDX en hypoxie est principalement due à la présence de HIF-1 dans la cellule. Nous avons aussi observé une diminution de la maturation de la MT1-MMP ainsi que de l'IGF-IR[bêta], deux substrats de la furine. Dans le but de vérifier la possibilité qu'une inhibition de la furine induite en hypoxie puisse affecter la croissance tumorale, nous avons par la suite transfecté les cellules HT1080 afin d'obtenir une population de cellules exprimant de façon stable les plasmides 3HRE-PDX et 6HRE-PDX. Nous avons démontré que, suite à l'implantation de ces cellules chez des souris immunodéficientes, la croissance des tumeurs exprimant du PDX en hypoxie est diminuée de façon significative. Nous avons également démontré, par immunobuvardage de type Western, la présence de PDX à l'intérieur de ces tumeurs. De plus, des expériences d'immunohistochimie ont révélé que l'expression de PDX était principalement située dans les régions hypoxiques des tumeurs. La furine est une enzyme ubiquiste, impliquée dans le maintien physiologique des fonctions cellulaires. Nos résultats démontrent pour la première fois la faisabilité d'inhiber de façon ciblée la furine, soit dans les zones hypoxiques de tumeurs. Cette inhibition diminue la maturation de substrats impliqués dans la modification du microenvironnemt des tumeurs et par conséquent, diminue la progression tumorale.

Les ADAMTS (a desintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 repeat) sont des métallopeptidases sécrétées dans le milieu extracellulaire ayant comme fonction le clivage de différents substrats de la matrice extracellulaire tel le propeptide en N-terminal du collagène, l'aggrécan, ainsi que le von Willebrand factor retrouvé dans le plasma. Une mutation ou un dérèglement d'ADAMTS2, 5 et 13 sont directement responsable du syndrome de Ehlers-Danlos de type VII C, l'arthrose et la purpura thrombotique thrombocytopénique respectivement. De plus, ADAMTS1 et 8 sont reconnues pour avoir des propriétés anti-angiogéniques qui s'avèrent d'un potentiel thérapeutique contre la progression des tumeurs. La biosynthèse et les mécanismes menant à la pleine activité biologique de ces peptidases sont peu connus et ont été étudiés dans cet ouvrage. Nous avons démontré que les ADAMTS sont initialement synthétisées sous forme de zymogènes qui subissent un clivage protéolytique à la jonction de leur prodomaine et de leur domaine catalytique par différentes sérines peptidases de la famille des pro-protéines convertases de type subtilisine. Des études de marquages métaboliques des différents ADAMTS transfectées dans la lignée cellulaire CHO RPE.40 déficiente en furine ont dévoilé que ADAMTS1, 5, 7 et 9 sont toutes clivées par la furine. D'autres convertases clivent de façon moins efficace que la furine les prodomaines des ADAMTS (PACE4 et PC6B clivent ADAMTS1, PC6B et PC7 clivent ADAMTS7, PC5A Clive ADAMTS9 et PC7 Clive ADAMTS5). Malgré la présence de plusieurs sites consensus de clivage par la furine dans les prodomaines des ADAMTS, des études de mutagenèse dirigée abolissant les différents sites ont démontré que le site plus près du domaine catalytique est préférentiellement clivé par la furine. Le clivage du prodomaine d'ADAMTS1 et 7 s'effectue au réseau du trans -Golgi. Toutefois, des études de marquage à la biotine des protéines de la surface cellulaire démontrent que ADAMTS7 semble aussi être clivée à la surface de la cellule. ADAMTS5 est strictement maturée dans l'espace extracellulaire, soit à la surface cellulaire ou dans le milieu extracellulaire, ce qui révèle un nouveau mécanisme d'activation par la furine pour des substrats endogènes. En outre, ADAMTS9 est clivée à la surface de la cellule par la furine, mais contrairement à la presque totalité des substrats de la furine, celle-ci inactive ADAMTS9. En somme, il existe plusieurs mécanismes d'activation des ADAMTS : activation intracellulaire ou extracellulaire et inactivation extracellulaire par les convertases. La présence, dans les prodomaines des ADAMTS, d'acides aminés conservés à travers les membres de cette famille d'enzyme nous amène à penser qu'ils pourraient jouer un rôle important dans leur maturation. La mutation des acides aminés conservés des motifs CXYXG et YFIXPL d'ADAMTS1 et 9 ainsi que des sites de N-glycosylation d'ADAMTS9 ont grandement affecté la sécrétion de l'enzyme mature. Cette observation permet de conclure qu'outre le site consensus de clivage par la furine, des motifs conservés ainsi que la glycosylation des prodomaines sont impliqués dans la biosynthése des ADAMTS. La découverte de nouveaux mécanismes d'activation par la furine a une signification importante dans le domaine d'activation de précurseurs. L'activation extracellulaire d'ADAMTS5, l'enzyme responsable de la dégradation du cartilage, génère une cible thérapeutique potentielle pour un traitement futur de l'arthrose.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La compréhension des mécanismes impliqués dans la formation des métastases est l’un des défis majeurs de la recherche sur le cancer. En effet, la formation de métastases est la cause principale de mortalité chez les patients atteints du cancer. L'influence du microenvironnement tumoral fait partie intégrante de la recherche et plusieurs études démontrent qu’il joue un rôle primordial dans l’invasion des cellules tumorales. L’une des caractéristiques du microenvironnement tumoral est l’hypoxie. Les cellules cancéreuses ont développé différentes stratégies afin de survivre dans ce microenvironnement. Des études récentes rapportent que des mécanismes posttranscriptionnels sont induits par l’hypoxie tels que le routage intracellulaire de molécules d'adhésion, de protéases et l’activation de facteurs de croissance, et qu’ils influencent le phénotype métastatique des cellules cancéreuses. L’étape importante dans l’initiation de la formation des métastases est la dégradation de la membrane basale de la tumeur et de la matrice extracellulaire. Les cellules cancéreuses ont développé des stratégies afin de faciliter leur migration dont l’une est la formation d'invadopodes. Malgré plusieurs études sur la biogenèse et les fonctions de ces structures, peu de travaux ont été accomplis concernant l’influence du microenvironnement tumoral hypoxique sur la formation et les fonctions des invadopodes. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur l’étude des mécanismes induits par l’hypoxie dans l’invasion des cellules cancéreuses. Dans le premier chapitre de la section résultats, nous démontrons que l’hypoxie induit une relocalisation stratégique de la furine, une convertase de pro-protéines, dans une boucle de recyclage en périphérie cellulaire. Nous démontrons que la redistribution de la furine favorise l’invasion cellulaire en condition hypoxique. Dans le deuxième chapitre, nous avons étudié l'impact de la relocalisation de la furine en hypoxie sur la maturation de substrats tumorigéniques. Nos résultats indiquent que l’hypoxie favorise la maturation du TGFß par la furine dans des vésicules acides. Nous démontrons que la présence d’une histidine, sensible au pH, située au site de clivage du pro-TGFß par la furine influence la capacité de cette dernière à cliver la pro-protéine. Enfin, dans le dernier chapitre, nous démontrons que l’induction hypoxique de la formation des invadopodes est principalement causée par la signalisation dépendante de Smad3 du TGFß. Nous identifions la HDAC6 comme étant un régulateur de la signalisation du TGFß en hypoxie. La HDAC6 permettrait la libération de Smad3 du réseau de tubuline, et suite à la liaison du TGFß sécrété à son récepteur, permettrait la phosphorylation et la translocation nucléaire de Smad3 afin d'induire ses gènes cibles. L'ensemble de ces travaux a permis d'identifier des molécules clés impliquées dans la formation des invadopodes en condition hypoxique. Nos travaux ont contribué de manière substantielle à nos connaissances des mécanismes impliqués dans l’invasion cellulaire dans le microenvironnement hypoxique. Nos résultats permettront en outre l’identification de cibles thérapeutiques potentielles qui pourraient servir à inhiber l’invasion cellulaire et la formation de métastases.

Le TGF[bêta] est une cytokine anti-inflammatoire impliquée dans plusieurs types de cancer. Il joue le rôle à la fois de suppresseur de tumeurs et d'oncogène. En effet, selon le stade de progression de la tumeur, il peut avoir un effet protecteur ou promoteur de la tumorigénèse. Les mécanismes par lesquels le TGF[bêta] exerce ses fonctions dans la carcinogénèse ne sont pas bien compris. Il est important d'élucider ces mécanismes afin de pouvoir développer de nouveaux traitements permettant de contrer les effets tumorigénique de ce facteur de croissance. Le TGF[bêta] interagit avec une panoplie de facteurs au cours de son processus de maturation et d'activation. On compte parmi eux la furine, la plasmine, la thrombospondine, les intégrines et les métalloprotéases. Toutes ces molécules peuvent être impliquées dans les processus néoplasiques. L'étude du rôle de leurs interactions dans la tumorigénèse permettrait de mieux comprendre les effets du TGF[bêta]. Une des cibles importantes de l'étude des interactions entre le TGF[bêta] et les acteurs de son processus de maturation et d'activation est la convertase de proprotéine furine. Cet enzyme est responsable de la maturation de plusieurs substrats impliqués dans le cancer tels que le TGF[bêta], le VEGF, le PDGF, la MT1-MMP et l'IGF-1. La maturation de tous ces composés favorise le développement des tumeurs et des métastases en augmentant la prolifération des cellules tumorales, leur capacité d'invasion et l'angiogénèse au coeur des tumeurs solides et des métastases.Le TGF[bêta] étant un susbtrat important de la furine, le but de ce projet est de caractériser le rôle de la maturation du TGF[bêta] par la furine dans la tumorigénèse. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle in vitro de cellules cancéreuses humaines, les HT1080, et un modèle in vivo de progression tumorale chez les souris nu/nu. Nous avons déterminé par différentes techniques telles que la zymographie, les essais d'adhésion, les essais d'invasion sur matrice de collagène de type IV, les essais de motilité, l'incorporation de thymidine tritiée et le PCR quantitatif en temps réel, que la maturation du TGF[bêta] par la furine a un effet protecteur dans les phases précoces du développement tumoral et promoteur sur le développement plus tardif du cancer. En fait, la maturation du TGF[bêta] par la furine permet de maintenir des concentrations plus élevées de TGF[bêta] bioactif dans l'environnement tumoral. Ceci permet l'inhibition de la prolifération cellulaire. Toutefois, cette forte présence de TGF[bêta] au niveau de la tumeur induit, par l'augmentation de l'adhésion et de la motilité cellulaire, la migration de type amoeboïde observée dans plusieurs stades de la tumorigénèse dont la dissémination lymphatique et l'extravasation. De plus, par la production de MMP-2 active et la formation d'invadopodes, le TGF[bêta] induit la migration de type mésenchymal surtout observée au début de l'invasion tumorale et au cours du processus d'intravasation. Par ailleurs, il nous a été impossible de déterminer le rôle exact de la maturation du TGF[bêta] par la farine sur l'angiogénèse, un facteur important dans le maintien des tumeurs solides volumineuses et des métastases. En fait, globalement, elle semble favoriser l'angiogénèse par l'expression de la furine et du VEGF, l'activation de la MT1-MMP et la maturation de la MMP-2, tous des facteurs pro-angiogéniques. Elle permet aussi l'induction de l'expression de PAI-1 qui est plutôt un facteur anti-angiogénique. À l'aide d'un système de reconstitution de l'activité du TGF[bêta] chez les cellules dont la furine est inhibée, nous avons déterminé que le TGF[bêta] est fortement responable des effets de la furine sur la tumorigénèse et ce, à plusieurs niveaux. Il est responsable de l'effet de la furine sur la prolifération, la production de MMP-2, l'invasion, le phénotype cellulaire et la transition d'une migration de type mésenchymal à une migration de type amoeboïde. Il est également partiellement impliqué dans le rôle de la furine sur la formation des invadopodes et la motilité cellulaire. Par contre, pour ces deux derniers processus et au niveau de l'adhésion cellulaire, d'autres substrats de la furine semblent nécessaire pour qu'elle accomplisse ses fonctions.

De nos jours, le scénario d’une pandémie à l’échelle mondiale est de plus en plus surveillé par l’Organisation mondiale de la santé en plus d’être exploité par le cinéma et les médias à sensations fortes. La réalité est que plusieurs épidémies ont ravagé la population sur terre à travers les époques telle que ce fut le cas lors de l’éclosion de la peste noire au XIV siècle en Europe et en Asie ou encore le VIH en Afrique encore aujourd’hui. La grande majorité des populations étant concentrée dans des mégalopoles et le transport international étant toujours plus développé et accessible rend une simple épidémie susceptible de se transformer rapidement en pandémie. Plus récemment, l’éclosion de la grippe aviaire H5N1 a décimé d’importantes populations d’oiseau en Asie et certains cas de contamination humaine fatale ont même été répertoriés. Comme les virus mutent rapidement, il serait donc pertinent de connaître leurs mécanismes de prolifération et tenter de les maîtriser afin de les neutraliser avant l’éclosion d’une souche se propageant d’humain à humain. Or, il a été découvert qu’une famille d’endoprotéases à sérines, les proprotéines convertases, sont impliquées dans diverses pathologies dont l’influenza-A H5N1. La furine, première proprotéine convertase à avoir été découverte, semble à l’origine de l’activation de ces virus. Nous avons donc choisi d’entreprendre la conception de divers inhibiteurs de furine dans le but de développer un agent antiviral contre cette pathologie. En ayant une approche impliquant la biologie structurelle et en effectuant une conception rationnelle d’inhibiteurs, nous avons développé des inhibiteurs de furine ayant à la fois une bonne affinité pour l’enzyme ainsi qu’une bonne stabilité en milieu biologique, tout en tentant de comprendre les principes fondamentaux de la liaison avec ces enzymes. Nos résultats ont démontré que diverses techniques peuvent être exploitées afin de concevoir des composés pouvant cibler la furine avec une bonne affinité. Le rationnel derrière la conception de ces composés a été démontrée à l’aide d’outils modernes de visualisation tridimensionnels de biomolécules en mettant en évidence les fonctionnalités importantes des complexes enzymes-substrat et enzyme-inhibiteurs afin de bien vulgariser la biologie structurelle inhérente au projet.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.