La compréhension des mécanismes impliqués dans la formation des métastases est l’un des défis majeurs de la recherche sur le cancer. En effet, la formation de métastases est la cause principale de mortalité chez les patients atteints du cancer. L'influence du microenvironnement tumoral fait partie intégrante de la recherche et plusieurs études démontrent qu’il joue un rôle primordial dans l’invasion des cellules tumorales. L’une des caractéristiques du microenvironnement tumoral est l’hypoxie. Les cellules cancéreuses ont développé différentes stratégies afin de survivre dans ce microenvironnement. Des études récentes rapportent que des mécanismes posttranscriptionnels sont induits par l’hypoxie tels que le routage intracellulaire de molécules d'adhésion, de protéases et l’activation de facteurs de croissance, et qu’ils influencent le phénotype métastatique des cellules cancéreuses. L’étape importante dans l’initiation de la formation des métastases est la dégradation de la membrane basale de la tumeur et de la matrice extracellulaire. Les cellules cancéreuses ont développé des stratégies afin de faciliter leur migration dont l’une est la formation d'invadopodes. Malgré plusieurs études sur la biogenèse et les fonctions de ces structures, peu de travaux ont été accomplis concernant l’influence du microenvironnement tumoral hypoxique sur la formation et les fonctions des invadopodes. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur l’étude des mécanismes induits par l’hypoxie dans l’invasion des cellules cancéreuses. Dans le premier chapitre de la section résultats, nous démontrons que l’hypoxie induit une relocalisation stratégique de la furine, une convertase de pro-protéines, dans une boucle de recyclage en périphérie cellulaire. Nous démontrons que la redistribution de la furine favorise l’invasion cellulaire en condition hypoxique. Dans le deuxième chapitre, nous avons étudié l'impact de la relocalisation de la furine en hypoxie sur la maturation de substrats tumorigéniques. Nos résultats indiquent que l’hypoxie favorise la maturation du TGFß par la furine dans des vésicules acides. Nous démontrons que la présence d’une histidine, sensible au pH, située au site de clivage du pro-TGFß par la furine influence la capacité de cette dernière à cliver la pro-protéine. Enfin, dans le dernier chapitre, nous démontrons que l’induction hypoxique de la formation des invadopodes est principalement causée par la signalisation dépendante de Smad3 du TGFß. Nous identifions la HDAC6 comme étant un régulateur de la signalisation du TGFß en hypoxie. La HDAC6 permettrait la libération de Smad3 du réseau de tubuline, et suite à la liaison du TGFß sécrété à son récepteur, permettrait la phosphorylation et la translocation nucléaire de Smad3 afin d'induire ses gènes cibles. L'ensemble de ces travaux a permis d'identifier des molécules clés impliquées dans la formation des invadopodes en condition hypoxique. Nos travaux ont contribué de manière substantielle à nos connaissances des mécanismes impliqués dans l’invasion cellulaire dans le microenvironnement hypoxique. Nos résultats permettront en outre l’identification de cibles thérapeutiques potentielles qui pourraient servir à inhiber l’invasion cellulaire et la formation de métastases.

Le cycle cellulaire est un processus finement régulé à différents niveaux. p27 est un inhibiteur des complexes cyclines/CDK et cette fonction lui confère un rôle antiprolifératif lorsqu'il est localisé dans le noyau. De nombreuses études ont montré que p27 se comporte comme un suppresseur de tumeur lorsqu'il est localisé dans le noyau des cellules via l'inhibition des cyclines/CDK. De manière surprenante, p27 a également des fonctions oncogéniques dans certaines situations, notamment lorsqu'il est présent dans le cytoplasme. Il s'avère qu'en plus de ses fonctions de régulateur du cycle cellulaire, p27 est également impliqué dans la régulation d'autres processus cellulaires, comme la migration, la cytocinèse, la transcription ou encore l'autophagie et la différenciation. Durant ma thèse, j'ai caractérisé deux de ces nouvelles fonctions en mettant en lumière un rôle de p27 dans la régula.on des invadopodes ainsi que dans l'oncogenèse pancréatique.Mon premier objectif a été de comprendre la fonction de l'interaction de p27 avec la protéine Cortactine, un nouveau partenaire de p27.Cette protéine joue un rôle important dans la régulation de l'invasion cellulaire. J'ai confirmé cette interaction dans différents types cellulaires et observé une colocalisation au niveau des invadopodes. J'ai également cartographié leurs domaines d'interaction respectifs et montré que l'interaction de p27 avec Cortactine était induite par une stimulation avec du sérum. L'interaction p27/Cortactine permet le recrutement de PAK1, une sérine/thréonine kinase impliqué dans l'invasion cellulaire et favorisant notamment le renouvellement des invadopodes, sur Cortactine. J'ai également observé que les cellules invalidées pour p27 présentent de nombreux invadopodes et dégradent la matrice extracellulaire de manière très importante par rapport aux cellules exprimant p27. Par des approches d'inhibiteurs et de siARN j'ai mis en évidence que ce phénotype implique la voie Rac1/PAK1/phospho-Ser113-Cortactine qui est sous-activée en l'absence de p27 à cause du défaut de recrutement de PAK1 sur Cortactine, stabilisant ainsi les invadopodes. Mon second objectif a été d'étudier les mécanismes par lesquels p27 régule l'oncogenèse pancréatique. En effet, différentes études cliniques ou chez la souris ont montré que la localisation nucléaire de p27 était requise pour son rôle de suppresseur de tumeur dans le pancréas. Or nous avons constaté dans un modèle murin génétique d'oncogenèse pancréatique induite par l'activation de K-Ras que p27 était exclu du noyau avant l'apparition des premières lésions, suggérant un rôle précoce dans l'oncogenèse de ce tissu. De manière surprenante, l'étude comparative par immunomarquage de pancréas de souris p27+/+, p27-/- et p27CK-/CK-, un modèle de souris knock-in où p27 n'est plus capable d'inhiber les cyclines/CDK, n'a pas montré d'effet de p27 sur la prolifération dans le pancréas exocrine. Par contre, ces études ont montré une localisation anormale de plusieurs marqueurs de polarité acinaire ainsi qu'une réexpression des facteurs de transcription Sox9 et Pdx1, impliqués dans le processus de transdifférenciation cellulaire à l'origine de l'oncogenèse pancréatique appelée métaplasie acino-canalaire. Nous avons montré que p27 régulait de manière directe la transcription de Sox9 en interagissant avec son promoteur, suggérant que p27 participe normalement à la répression transcriptionnelle de Sox9 dans le noyau, réprimant ainsi la métaplasie acino-canalaire.Ainsi, mes travaux de thèse ont permis l'identification de deux nouvelles fonctions de p27. Une fonction oncogénique, indépendante de son activité d'inhibiteur des CDK/cyclines, par laquelle p27 régule la protéine Cortactine, et par ce biais les invadopodes et l'invasion ainsi qu'une fonction de suppresseur de tumeur dépendante des cyclines/CDK via la répression de la transcription de Sox9 dans les cellules acinaires du pancréas. / Cell cycle is a tightly regulated process. One level of regulation is provided by p27, a cyclin/ CDK inhibitor and as such, p27 has an antiproliferative function. Several studies have shown that p27 is a tumor suppressor when it is located in the nucleus via the inhibition of cyclins/ CDKs. Surprisingly, p27 may also play oncogenic roles depending on the cellular context, especially when it is excluded from the nucleus. In fact, several lines of evidence indicate that p27 functions extend beyond cell cycle regulation and that p27 also regulates cell migration, cytokinesis, transcription, autophagy and stemness/differenciation. During my PhD, I have characterized two novel p27 functions, one in the regulation of invadopodia, and the second in pancreatic oncogenesis.My first aim was to investigate the function of the interaction between p27 and Cortactin, a new p27-interacting protein which is an important regulator of cell invasion. I confirmed this interaction in different cell lines and found that p27 and Cortactin colocalized in invadopodia. I have mapped the domains mediating the interaction in both proteins and found that this interaction is induced after serum stimulation. p27 allows the recruitment of PAK1, a serine/ threonine kinase involved in cell invasion which promotes invadopodia turnover, on Cortactin. I also found that p27 knock-out cells have an increased number of invadopodia and degrade extracellular matrix more efficiently than wild-type cells. Using inhibitors and siRNAs I have shown that this phenotype involves the Rac1/PAK1/phospho-Ser113-Cortac.n pathway, which is underactivated in absence of p27 due to the PAK1/Cortactin interaction defect, causing a stabilization of invadopodia.My second aim was to study the mechanism by which p27 regulates pancreatic oncogenesis. Severals studies in the clinic or in animal models have shown that nuclear localization of p27 is required for its tumor suppressor function in the pancreas. In a genetic mouse model of K- Ras driven pancreatic oncogenesis, I found that p27 was excluded from the nucleus before the apparition of lesions, suggesting an early function in oncogenesis in this tissue. Surprisingly, comparative studies of pancreas from p27+/+, p27-/- and p27CK-/CK- (a knock- in mouse model where p27 no longer binds cyclins/CDKs) mice by immunostaining did not show any difference in proliferation in the exocrine pancreas. However, these studies have shown the mislocalization of different acinar polarity markers and the re-expression of two transcription factors, Sox9 and Pdx1, which are involved in acinar-to-ductal metaplasia, a cell transdifferenciation process thought to be the underlying cause of pancreatic oncogenesis. I have found that p27 regulates Sox9 transcription and directly interacts with its promoter, suggesting that p27 participates in the transcriptionnal repression of Sox9 in normal conditions to prevent acinar-to-ductal metaplasia. Overall, my PhD work has allowed the identification of two novel roles of p27. An oncogenic function, independent of its cyclin/CDK inhibitory activity, by which p27 regulates Cortac.n, invadopodia and cell invasion and a tumor suppressor function dependent of cyclin/CDK via the repression of Sox9 transcription in pancreas acinar cells.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire auto-immune qui affecte environ 1% de la population. Il s’agit d’une maladie douloureuse et débilitante, caractérisée par la déformation des articulations touchées, un processus secondaires à la destruction du cartilage et de l’os. À ce jour, il n’existe aucun traitement ciblant le processus de dégradation du cartilage articulaire. Notre laboratoire a observé précédemment que les synoviocytes de type fibroblastique (FLS), provenant de patients atteints de PR (RA-FLS) ou isolés de rats souffrants d’arthrite induite au collagène (CIA) (A-FLS), présentent une augmentation de l’activation de Src se traduisant par une augmentation de la formation d’invadosomes et de la dégradation d’une matrice de gélatine in vitro. De plus, l’inhibition de Src chez des rats atteints de CIA permet de diminuer la dégradation du cartilage articulaire comparativement aux rats contrôles. Chez les cellules cancéreuses, des études indiquent que les protéines adaptatrices Tyrosine Kinase Substrate 4 et 5 (Tks4,Tks5) sont essentielles à la formation de l’invadosome ainsi qu’à sa maturation menant à la dégradation de la matrice extracellulaire. L’objectif de cette étude est de déterminer si l’activation de Src chez les A-FLS et les RA-FLS médie la formation d’invadosomes et la dégradation du cartilage en faisant intervenir les protéines Tks4 et Tks5. Nous avons déterminé que l’expression de Tks4 et Tks5 est augmentée chez les A-FLS et les RA-FLS comparativement aux FLS sains. De plus, l’inhibition de Tks4 ou Tks5 résulte en une diminution significative du pourcentage de cellules formant des invadosomes chez les A-FLS et les RA-FLS, ainsi que de leur capacité à dégrader une matrice de gélatine. Nous avons aussi déterminé que les protéines Tks4 et Tks5 sont phosphorylées par la protéine kinase Src, et qu’il y a formation d’un complexe entre la MT1-MMP et Tks4 et/ou Tks5. Finalement, nous avons démontré que l’inhibition de la Tks4 chez des rats CIA permettait de diminuer significativement le nombre et l’ampleur des zones de dégradations du cartilage par les cellules composant la membrane synoviale ainsi que la dégradation du collagène de type II, une composante majeure du cartilage articulaire. Tks4 et Tks5 sont donc des cibles thérapeutiques prometteuses afin d’empêcher la dégradation du cartilage dans la polyarthrite rhumatoïde et ainsi diminuer sa progression.

La dissémination des cellules cancéreuses et la formation de métastases sont des étapes cruciales dans la progression tumorale et constituent une cause majeure des décès dus au cancer. La métalloprotéase transmembranaire MT1-MMP est un acteur clé impliqué dans le franchissement des barrières tissulaires et le remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) par les cellules cancéreuses. MT1-MMP est présente dans des vésicules intracellulaires, appelées endosomes, via lesquels elle est adressée à la membrane plasmique (PM) afin d'y dégrader la ECM. Des travaux menés au laboratoire ont identifié le complexe exocyste (CE) comme un acteur important pour la formation d'invadopodes dans la lignée d'adénocarcinome mammaire MDA-MB-231. Ce complexe multiprotéique (Sec3, Sec5, Sec6, Sec8, Sec10, Sec15, Exo70 et Exo84) est impliqué dans l'arrimage des vésicules intracellulaires à la PM. Des cribles double-hybride ont identifiés la protéine WASH comme partenaire potentiel du CE (via les sous-unités Exo84 et Sec3). WASH est capable d'induire la polymérisation de l'actine en activant le complexe Arp2/3. In vitro, nous avons montré que les complexes WASH et exocyste interagissent physiquement et coordonnent le trafic intracellulaire et l'adressage de MT1-MMP à la PM. Ces résultats mettent en évidence une étroite collaboration entre le cytosquelette d'actine et les mécanismes d'exocytose lors des étapes précoces de dégradation de la ECM ainsi que dans l'invasion tumorale. / Cancer cell invasion is a prerequisite to tumor progression and metastasis. In order to disseminate, tumor cells must degrade and remodel the extracellular matrix (ECM) in a process that requires the trans-membrane matrix metalloproteinase MT1-MMP, which is a key component of the ECM remodeling apparatus of cancer cells. MT1-MMP overexpression in cancers is associated with increased invasion and metastasis. Many cellular proteins are involved in the transport and delivery of MT1-MMP-containing vesicles to the PM. Previous work from the laboratory identified the exocyst complex (EC) as a key component required for matrix proteolysis and invasion of cancer cells. This multiprotein complex (Sec3, Sec5, Sec6, Sec8, Sec10, Sec15, Exo70 and Exo84) plays essential roles in docking secretory vesicles at the PM for exocytosis. To better characterize this complex, a yeast two-hybrid screen was performed, identifying the protein WASH as a potential partner of Exo84 and Sec3. WASH is a Nucleation Promoting Factor (NPF) able to activate the actin nucleating Arp2/3 complex. Results of the present study showed that WASH and the exocyst complexes interact and localize on MT1-MMP-positive endosomes in MDA-MB-231 breast cancer cells. This study highlight a direct implication of WASH and exocyst complex in ECM degradation by cancer cells through the docking and exocytosis of MT1-MMP-containing endosomes at the PM through connections between these compartments and the extracellular medium. This WASH- and exocyst-dependent MT1-MMP exocytosis mechanism is required for degradation of adjacent tissue by cancer cells during tumour cell invasion.

La migration et l'invasion tumorale sont des étapes clés de la cascade métastatique. Les microtubules (MT) contribuent à la division cellulaire et constitue la cible des agents de chimiothérapie anti-MT (ACM). Ce sont des structures dynamiques qui s'ancrent aux structures cellulaires périphériques. Durant ma thèse, j’ai étudié comment les protéines régulant le bout « + » des MT (+TIP) contribuent à la migration cellulaire et à la dégradation de la matrice extracellulaire. D’abord j’ai étudié l'impact de l'eribuline, un ACM dépolymérisant, sur la migration de cellules mammaires. L'éribuline s'est avérée empêcher l'ancrage des MT, modifier leur dynamique et inhiber la migration dirigée cellulaire, phénomène que nous avons expliqué par son action sur la +TIP EB1 mais surtout par la délocalisation de la tubuline polymérase ch-TOG de l'extrémité + des MT. Puis, nous avons examiné le rôle des +TIP dans la dégradation de la matrice, par les invadopodes, de petites protrusions riches en actine dégradant la matrice. La déplétion de EB1 et ses partenaires, APC et ACF7, régulaient négativement l’action des invadopodes, laissant supposer la présence d'un complexe fonctionnel : EB1, APC et ACF7 régulant négativement les invadopodes. En parallèle, par analyse protéomique systématique des composant des invadopodes, nous avons identifié de nouveaux proches voisins de TKS5, protéines indispensable à la formation des invadopodes, dont une protéine associée aux MT, MAP4. Au total, la régulation de la dynamique des +TIP est importante pour la migration et l'invasion et développer des stratégies ciblées contre ces acteurs pourrait améliorer la prise en charge du cancer du sein métastatique. / Migration and invasion are key steps in the metastatic cascade. Microtubules (MT) are involved in cell division and are dammaged by MT tagetting agents(MTA), a widely used chemotherapy drugs. MT are dynamic structures anchored to peripheral cell structures. During this work, I studied how proteins that regulates the "+" end of MT (+ TIP) cell migration and extracellular matrix degradation. First I adressed the impact of eribulin, a new depolymerizing MTA, on mammary cell migration. Eribulin was found to prevent the anchoring of MT to cell cortex, to modify their dynamics and to inhibit cell migration, a phenomenon that we explained by its action on +TIP EB1 but more precisely by the delocalization of tubulin polymerase ch-TOG. Next we investigated the role of TIPs in invadopodia matrix degradation , which are actin-rich protrusion specialized in matrix digestion. The depletion of EB1 and its partners, APC and ACF7, negatively regulated the action of invadopodia, assumed the presence of a complex complex: EB1, APC and ACF7 negatively regulating invadopodia activity. In parallel, by systematic proteomic analysis of the component of the invadopodia, we identified new close neighbors of TKS5, an essential proteins in invadopodia formation, including a MT associated protein MAP4. In conclusion, the regulation of + TIP dynamics is important for migration and invasion and developping targeted strategies against them could improve the management of metastatic breast cancer.

Depuis plusieurs décennies, la communication intercellulaire par jonctions gap (CIJG) est connue pour être impliquée dans la cancérogenèse. Cette implication semble complexe par le fait que les connexines pourraient augmenter la capacité d’invasion des cellules cancéreuses tout en diminuant leur prolifération. Ceci était particulièrement observé pour la connexine 43 (Cx43) dans le cas de cellules de gliomes. Or, les propriétés d’invasion des gliomes de haut grade, les glioblastomes multiformes (GBM), les rendent difficiles à supprimer par résection chirurgicale et favorisent leur récidive.<br/> Afin de préciser le rôle de la Cx43 dans le contrôle des capacités invasives de cellules de GBM, nous avons utilisé une lignée de cellules de glioblastome humaine U251 exprimant par shRNA des niveaux, en ARNm et protéiques, de Cx43 réduits. Ces clones shRNA des cellules U251 montrent une corrélation entre le niveau d’expression de la Cx43 et le processus d’invasion. Au cours de ce travail, nous avons montré, pour la première fois, que la Cx43 est localisée dans les structures protéolytiques permettant l’invasion, les invadopodes. Nous avons démontré aussi que, par sa localisation, la Cx43 favorise la formation des invadopodes en agissant comme une protéine d’échafaudage qui permet l’interaction de Src de la Cortactine. De plus, l’activité hémicanal de la Cx43, probablement inhibée par le Bisphénol A, possède des effets négatifs sur la cinétique de développement des invadopodes. Une étude du protéome et du sécrétome des cellules U251 et des clones shRNA a permis l’identification des protéines impliquées dans l’invasion et la formation et fonction des invadopodes.<br/> En conclusion, la Cx43 participe au processus invasif des cellules de GBM en favorisant la formation et la fonction des invadopodes. Cette nouvelle fonction de la Cx43 semble être la conséquence de ses propriétés de protéines d’échafaudage et hémicanal, et non de son rôle principalement décrit dans la CIJG. / Since several decades, the gap junction intercellular communication (GJIC) is known to be involved in carcinogenesis. This involvement seems complicated by the fact that connexins could increase cancer cells invasion ability while decreasing their proliferation. This was especially observed for connexin 43 (Cx43) in the case of glioma cells. But high-grade gliomas, glioblastoma multiform (GBM) has invasion properties that make it difficult to remove surgically and promote their recurrence.<br/> To clarify the Cx43 role in the control of GBM cells invasive capacities, we used the GBM U251 cell line expressing Cx43 levels, mRNA and protein, reduced by shRNA strategy. Through this approach, we confirmed that Cx43 expression level is associated with the invasive capacity of GBM cells. Furthermore we have shown, for the first time, that Cx43 is localized in invasive proteolytic structures, the invadopodia. We also show that, by its location, Cx43 promotes invadopodia formation by acting as a scaffolding protein that allows Src and Cortactin interaction. Moreover, Cx43 hemichannel activity, probably inhibited by Bisphenol A, has negative effects on invadopodia kinetics development. A proteome and secretome study of U251 cells and shRNA clones allowed the identification of proteins involved in invasion and invadopodia formation and function.<br/>In conclusion, Cx43 participates in the invasive process of GBM cells by promoting invadopodia formation and function. This new function of Cx43 seems to be the result of its scaffold proteins and hemichannel properties, but not its role described mainly in CIJG.