Mehrere Studien haben gezeigt, daß die Cyclooxygenase-2 (COX-2) eine bedeutende Rolle sowohl bei Entstehung als auch Progression maligner Tumoren spielt. COX-2-Inhibitoren werden bereits in klinischen Studien zur Krebstherapie getestet. COX-2 ist die induzierbare Isoform der Cyclooxygenase - dem Schlüsselenzym der Synthese von Prostaglandinen und anderen Eicosanoiden. Im Tier- und Zellkulturmodell konnten COX-Hemmer anti-Tumor-Effekte hervorrufen. Es ist jedoch unklar, ob diese Effekte durch Hemmung des COX-Enzyms oder durch COX-unabhängige Mechanismen vermittelt werden. Wir untersuchten daher die Auswirkung der COX-Inhibition zum einen durch den selektiven COX-2-Hemmer NS-398 sowie zum anderen durch COX-Isoform-spezifische RNA-Interferenz (RNAi) in zwei humanen Ovarialkarzinomzellinien (OVCAR-3 und SKOV-3). OVCAR-3 zeigte eine konstitutive COX-1-Expression und eine durch IL-1beta induzierbare COX-2-Expression. SKOV-3 war COX-1- und COX-2-negativ. IL-1beta führte bei OVCAR-3 zu einer vermehrten Produktion von Prostaglandin E2 (PGE2), die durch eine gegen die COX-2 gerichtete siRNA gehemmt werden konnte, wohingegen COX-1-siRNA keinen Effekt hatte. Das deutet darauf hin, daß die COX-2 die Hauptquelle von PGE2 in OVCAR-3 ist. 1mikroM NS-398 waren ausreichend, um die PGE2-Produktion und somit auch die COX-2 in OVCAR-3 zu inhibieren. Höhere Konzentrationen NS-398 (>10mikroM) hatten einen antiproliferativen Effekt. Auch in der COX-2-negativen Zellinie SKOV-3 trat diese Wachstumshemmung auf; sie war nicht durch exogene Zufuhr von PGE2 (10mikroM) reversibel. Durchflußzytometrische Zellzyklusanalyse ergab, daß der Wachstumshemmung in beiden Zellinien ein G0/G1-Zellzyklusarrest zugrunde liegt. Dagegen führten weder COX-1- noch COX-2-Ausschaltung durch RNAi zu ähnlichen Auswirkungen auf Proliferation bzw. Zellzyklus. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein COX-2-unabhängiger Mechanismus für den durch NS-398 induzierten G0/G1-Arrest verantwortlich ist. / Several studies have provided evidence that the enzyme Cyclooxygenase-2 (COX-2) plays an important role in tumor development and progression. COX-2-inhibitors are already evaluated in clinical trials as cancer therapeutics. COX-2 is the inducible isoform of cyclooxygenase - the rate-limiting enzyme in the synthesis of prostaglandins and other eicosanoids. COX-inhibitors cause antitumor effects in animal models and in cell culture experiments. However, it is not clear, whether these effects are due to inhibition of the COX-enzyme or mediated via a COX-independent mechanism. We therefore investigated the effects of COX inhibition by the selective COX-2-inhibitor NS-398, as well as by COX-isoform specific RNA interference (RNAi) in the human ovarian carcinoma cell lines OVCAR-3 and SKOV-3. OVCAR-3 cells showed a constitutive expression of COX-1, and an inducible COX-2 expression. COX-2 was induced through stimulation with Interleukin-1beta, leading to production of high levels of Prostaglandin E2 (PGE2). SKOV-3 cells were negative for both COX isoforms. Selective COX-2-suppression by RNAi reduced PGE2 production in OVCAR-3, whereas COX-1-siRNA had no effect on PGE2 synthesis. Thus, COX-2 is the main source of PGE2 in OVCAR-3 cells. In these cells, 1microM NS-398 was sufficient to completely inhibit PGE2-synthesis - and thus the activity of the COX-2 enzyme. Increasing amounts of NS-398 (>10microM) had an antiproliferative effect. This growth inhibition was also observed in the COX-negative cell line SKOV-3, it could not be reverted by exogenous addition of PGE2 (10microM). Flowcytometric analysis of the cell cycle revealed that this growth inhibition was based on a G0/G1-cell-cycle-arrest. In contrast, suppression of COX-1 or COX-2 by RNAi had no effect on proliferation or cell cycle progression. These results suggest that a COX-independent mechanism is responsible for the G0/G1-arrest induced by NS-398.

Das humane Zytomegalievirus, ist ein ubiquitäres Pathogen, welches akute und persistierende Infektionen verursacht. Bei immunsupprimierten Patienten kann das Virus zu schweren Erkrankungen, wie Hepatitis, Pneumonie und bei kongenitaler Infektion außerdem zu Schädigungen des ZNS führen. HCMV blockiert die Zellproliferation durch einen Arrest am G1/S-Übergang des Zellzyklus, andererseits wird aber gleichzeitig die Expression S-Phase spezifischer Gene aktiviert. Teilweise lässt sich dies durch eine Virus vermittelte spezifische Inhibition der zellulären DNA-Repliaktion sowie durch eine massive Deregulation Zyklin-assozzierter Kinasen erklären. Zellkulturexperimente deuten darauf hin, dass die Zellzyklusalterationen wichtige Voraussetzungen für eine erfolgreiche Virusreplikation darstellen. Es ist hingegen nicht bekannt, welche Relevanz sie für die Virusvermehrung in vivo und das pathologische Erscheinungsbild im erkrankten Organismus besitzen. Diese Frage kann nur in einem Tiermodell sinnvoll angegangen werden. Aufgrund der Wirtsspezifität der Zytomegalieviren, ist man dabei auf die Verwendung der jeweiligen artspezifischen CMV angewiesen. Murines CMV (MCMV) und Ratten-CMV (RCMV) sind dabei die bislang bestuntersuchtesten Systeme. Das Anliegen dieser Arbeit war es zu prüfen, inwieweit die für HCMV beschriebenen Zellzyklusregulationen in MCMV und RCMV auf Zellkulturbasis konserviert sind. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl RCMV als auch MCMV einen antiproliferativen Effekt auf infizierte Zellen besitzen und ebenso wie HCMV zu einem Zellzyklusarrest führen. Nager-Zytomegalieviren können Zellen auch in der G2-Phase arretieren und in dieser Zellzyklusphase auch effizient replizieren können. Die Infektion mit Nager-CMV führt außerdem auf breiter Basis zur Veränderung Zyklin-assoziierter Kinaseaktivitäten. Allen Zytomegalieviren ist die Hemmung der zellulären DNA-Synthese am G1/S-Übergang durch die Inhibition des replication licensing, dem Beginn der DNA-Synthese gemein. Durch diese vergleichende Studie wird einerseits deutlich, dass wesentliche funktionelle Schritte der Zellzyklusregulation zwischen den Zytomegalieviren konserviert sind, aber andererseits die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen zum Teil deutlich variieren. / Human Cytomegalovirus (HCMV) is an ubiquitous, species-specific beta-herpesvirus that, like other herpesviruses, can establish lifelong latency following primary infection. HCMV infection becomes virulent only in immunocompromised patients such as premature infants, transplant recipients and AIDS patients where the virus causes severe disease like hepatitis, pneumonitis and retinitis. Congenital infection produces birth defects, most commonly hearing loss. To develop rational-based strategies for prevention and treatment of HCMV infection, it is crucial to understand the interactions between the virus and its host cell that support the establishment and progression of the virus replicative cycle. In general, herpesviruses are known to replicate most efficiently in the absence of cellular DNA synthesis. What is more, they have evolved mechanisms to avoid the cell´s DNA replication phase by blocking cell cycle progression outside S phase. HCMV has been shown to specifically inhibit the onset of cellular DNA synthesis resulting in cells arrested with a G1 DNA content. Towards a better understanding of CMV-mediated cell cycle alterations in vivo, we tested murine and rat CMV (MCMV/RCMV), being common animal models for CMV infection, for their influence on the host cell cycle. It was found that both MCMV and RCMV exhibit a strong anti-proliferative capacity on immortalised and primary embryonic fibroblasts after lytic infection. This results from specific cell cycle blocks in G1 and G2 as demonstrated by flow cytometry analysis. The G1 arrest is at least in part caused by a specific inhibition of cellular DNA synthesis and involves both the formation and activation of the cells’ DNA replication machinery. Interestingly, and in contrast to HCMV, the replicative cycle of rodent CMVs started from G2 as efficiently as from G1. Whilst the cell cycle arrest is accompanied by a broad induction of cyclin-cdk2 and cyclin-cdk1 activity, cyclin D1-cdk4/6 activity is selectively suppressed in MCMV and RCMV infected cells. Thus, given that both rodent and human CMVs are anti-proliferative and arrest cell cycle progression we found a surprising divergence of some of the underlying mechanisms. Therefore, any question put forward to a rodent CMV model involving cell cycle regulation has to be well defined in order to extrapolate meaningful information for the human system.